鸢尾黄斑病毒免疫磁珠RT-PCR检测方法的建立及应用

鸢尾黄斑病毒是近年新发现的番茄斑萎病毒属的一个种,目前国内还没有发生、危害的报道。试验以带有鸢尾黄斑病毒的烟草叶片为材料,建立了免疫磁珠RT-PCR高灵敏度的检测方法。通过抗体包被、吸附特异性及灵敏度比较等试验,确定了免疫磁珠在样品处理中的作用。免疫磁珠RT-PCR方法最低可检测稀释至10~(-6)的病汁液,灵敏度比免疫捕获RT-PCR高10倍,比磁珠直接吸附RT-PCR高10~4倍。这一结果表明免疫磁珠用于样品处理,可大大增加病毒吸附效率,提高检测灵敏度。应用该方法检测进境葱类种子及田间大葱、洋葱等样品150份,结果均未检出。     

蔬菜农药残留检测过程中的质量控制

蔬菜农药残留检测是蔬菜进入市场且达到健康、无害的重要保障。因此,应对检测质量进行控制,提高检测工作的高效性。文章分别介绍样品采集、样品流转、样品检测、样品分析及结果观察等5个方面,以便对检测质量进行监控。     

定量PCR快速检测动物食品中沙门菌污染

沙门氏菌是动物性食品中的重要食源性致病菌,建立其快速检测方法对动物性食品的质量控制具有重要作用.根据沙门氏菌16srDNA、dT fermentation等基因或DNA功能区序列设计PCR引物,通过比较3种不同的基因组DNA提取方法,提取待检样品总DNA,进行多基因定量PCR检测.结果表明,该方法简单快速且灵敏度高,在动物食品中的检测灵敏度可达10 cfu/g,整个检测时间在10h以内.说明该方法对检测动物中沙门氏菌具有特异性高且灵敏、快速等特点,适用于快速、准确地检测动物中沙门氏菌的需要.     

花生矮化病毒3种PCR检测方法的建立和比较

建立了花生矮化病毒（PSV）普通RT-PCR、SYBR Green I荧光RT-PCR和免疫捕获RT-PCR检测方法,并比较了它们的检测灵敏度。结果表明,以阳性对照为样品,普通RT-PCR灵敏度达到10-4,SYBR Green I荧光RT-PCR和免疫捕获RT-PCR的检测灵敏度相当,相对灵敏度均可达到10-6;检测混有PSV的大豆叶片样品,普通RT-PCR灵敏度为10-1,SYBR Green I荧光RT-PCR和免疫捕获RT-PCR的检测灵敏度为10-5;SYBR Green I荧光RT-PCR和免疫捕获RT-PCR方法比直接RT-PCR灵敏度高至少100倍,尤其在带毒植物叶片检测中优势更明显,而且灵敏、简便、同时重复性好。     

应用高效毛细管电泳测定生物蛋白质样品

应用高效毛细管电泳仪(CE)测定了生物样品中的胃蛋白酶、卵清蛋白及枯草杆菌细菌蛋白等。经过对波长185mm与214nm条件下的测定结果进行比较试验,得出185nm波长下的检测灵敏度大大高于214nm波长的检测灵敏度。     

实时荧光定量PCR法测定禽蛋中沙门氏菌

为建立禽蛋中沙门氏菌的荧光PCR法检测方法,根据invA基因序列设计实时荧光定量PCR引物和探针,常规方法提取菌体DNA,以55℃为退火温度进行荧光PCR扩增,并进行方法学考察。结果表明:阳性对照品和沙门氏菌为模板的样品有明显扩增曲线,其他菌株为模板的样品无扩增曲线,特异性、灵敏度和重现性考察提示实时荧光定量PCR方法符合检测方法学要求。实时荧光定量PCR法的应用,提高了禽蛋制品中沙门氏菌检测的灵敏度、缩短了检测时间、简化了检测流程。     

牡蛎中GⅡ型诺如病毒巢式RT-PCR检测方法的优化与评价

为了解决目前巢式PCR法检测牡蛎样品中GII型诺如病毒时存在的非特异性扩增、假阴性等问题,本研究对NCBI数据库中在线获得的所有GII型诺如病毒序列进行系统分析,重新设计出针对GII型诺如病毒检测的通用型巢式PCR引物(NG2OF/NG2OR),并从基因型覆盖度、特异性、灵敏度和实际样品检测的稳定性几个方面对新设计的引物进行评估。结果显示：(1)新引物的特异性好,只对GII型诺如病毒进行有效扩增,且不受牡蛎样品本底的影响。(2)新引物灵敏度高,最低可检测至26.4个拷贝。(3)在对92个牡蛎样品进行检测时,新引物的阳性检出率为28.3%,比经典引物高出7.5%。因此,新建立的GII型诺如病毒巢式PCR检测方法在检测牡蛎样品时特异性更强,灵敏度更高,为牡蛎中诺如病毒的检测提供了一种新的、可靠的技术手段。     

实时荧光PCR法检测致敏原鱼成分的研究

探讨了采用实时荧光PCR技术检测食品中的致敏原鱼成分。结果表明：采用鱼管家基因16SrRNA基因的特异性检测引物和探针进行检测时,19种样品经实时荧光PCR检测,只有鱼类样品产生阳性荧光信号,其余样品均不产生荧光信号。灵敏度试验结果表明：该方法对致敏原鱼成分的检测灵敏度较高,可达到1mg／kg,符合痕量检测要求。     

PCR－核酸试纸条法快速检测鸽子源性成分

[目的]提高动物源性成分检测效率,建立PCR-核酸试纸条快速检测技术体系。[方法]针对物种特异性DNA序列,设计并标记引物;建立并优化PCR反应体系;利用通用核酸试纸条进行结果判读。[结果]试验表明,PCR-核酸试纸条特异性高;绝对灵敏度为0.001 3 ng/μL,混合样品,实际灵敏度为0.01%;加工处理样品,实际灵敏度为0.1%;最低检测限检出率为100%,稳定性良好。[结论]综上,PCR-核酸试纸条方法是一种既有PCR反应的高灵敏度,又具有免疫学检测的特异性好的特点,同时操作简便的快速检测方法。     

气相色谱法测定水果中菊酯类农药残留量

采用气相色谱仪测定苹果中的溴氰菊酯、氰戊菊酯、甲氰菊酯、三氟氯氰菊酯等拟除虫菊酯类农药残留量,以乙腈代替传统的丙酮-石油醚作萃取剂,以固相萃取代替传统的液-液萃取,用Florisil小柱对样品进行过滤净化,减少了对检测的干扰,提高了检测的灵敏度。当样品中的添加浓度为0.05~0.10 mg/kg时,添加回收率为85.2%~110.2%,最低检测浓度为2×104~5×10-4mg/kg。     

水稻种子样品前处理对转基因成分荧光PCR检测的影响

以转基因水稻科丰6号不同含量的水稻种子为样品,对影响检测结果的主要前处理措施,包括样品研磨颗粒细度与DNA提取过程中样品CTAB裂解缓冲液温育时间等,进行分析筛选.结果表明,样品颗粒细度与CTAB缓冲液温育时间的不同处理组合对提取的DNA含量影响极显著,其中,样品颗粒细度100目与CTAB缓冲液温育时间8 h(过夜)处理的样品DNA提取效果与荧光PCR检测结果均最佳.采用最佳前处理组合,样品的主要转基因成分(Ca MV 35S、NOS、Cry1Ab)检出限从通常的转基因含量质量分数0.01%降到0.001%,使得水稻种子转基因成分荧光PCR检测灵敏度提高10倍,大幅度提高了检测结果的准确性.     

冰鲜鸡肉中致病菌三重PCR检测方法的建立

【目的】建立在鸡肉生产一线具有较强操作性,并可同时检测沙门氏菌、单增李斯特菌、大肠杆菌O157的三重PCR方法。【方法】利用该3种致病菌的特异性基因invA、HlyA、rfbE设计3对引物,在确定方法特异性和抗干扰能力的基础上,用优化后的反应体系对反应灵敏度进行测定,模拟并检测在鸡肉中常见腐败菌和鸡肉基质对检测方法的干扰影响作用下,在前增菌程序的辅助下该方法的实际样品检测灵敏度。【结果】该方法特异性和抗干扰能力强,3种致病菌测序结果的同源性分别达到100%、99%和99%,反应体系的最佳退火温度为51℃,灵敏度试验中3种致病菌同时检出的检测线达到103 CFU/mL,单重的灵敏度达到101 CFU/g,模拟实际样品检测中,经过20 h的前增菌后,三者同时检出的灵敏度达到101 CFU/g,单重PCR的灵敏度达到100 CFU/g;对60份屠宰线上的鸡胴体样品和32份超市鸡肉样品中沙门氏菌、单增李斯特菌、大肠杆菌O157的检出率分别为20%、3.3%、21.7%(屠宰线样品)和25%、21.9%、6.25%(超市样品)。【结论】成功建立了可同时检出鸡肉中沙门氏菌、单增李斯特菌和大肠杆菌O157的三重PCR方法,可为生产一线的致病菌检测提供参考。     

基质效应在生物样品质谱分析中的优化措施研究

高效液相色谱-质谱联用法(LC-MS/MS)由于其高灵敏度和高选择性现阶段被广泛应用于食品检测、环境评估等方面的样品定量分析。然而,由于实际样品特别是复杂样品分析中基质效应的存在,样品分析进程以及检测结果的特异性、灵敏度和准确度都会受到影响。本文立足于实际的生物样品质谱分析,阐述了基质效应的产生原因、检测及评定方法,其优化措施包括四个方面,即样品前处理的优化、色谱条件的优化、质谱条件的优化以及同位素内标的选择。     

植物中淀粉含量的流动注射分析

本文采用国产ZSY-1型流动注射分析仪及其附属设备,建立了植物中淀粉含量的流动注射碘比色分析法。通过对红松苗木,白皮松种籽等植物样品中淀粉含量测定及其与化学法对照实验和外加已知淀粉样品回收实验,都取得了满意结果,样品回收率在90％以上。本文系统探讨了分析检测流路及显色剂载流的选择和分析检测条件;深入讨论了该方法的准确度、灵敏度和精密度。FIA法测定淀粉具有:样品前处理简捷,干扰少、误差小、重复性好;选择性佳,灵敏度、准确度、精密度高;分析测定速度快、费用低、适于短时间内进行大批量样品淀粉含量测定等特点。     

巢式PCR检测菜豆细菌性萎蔫病菌

为了实现对进口大豆样品中菜豆细菌性萎蔫病菌的快速检测,试验根据菜豆细菌性萎蔫病菌的REP-PCR扩增测序结果,设计了1条特异性引物Cff F11,与引物Cff FOR组合,建立了巢式PCR检测方法,并进行特异性和灵敏度验证。结果表明,利用此检测方法对多种参试菌株进行检测时,只有菜豆细菌性萎蔫病菌呈阳性反应,而其他病菌不产生扩增反应;巢式PCR方法检测菜豆细菌性萎蔫病菌菌悬液时,其灵敏度达到3.1×103cfu·m L-1,比常规PCR灵敏度高1 000倍。制备带菌率为0.5%的大豆样品,用巢式PCR方法 1h内就可进行检测,检测时间大大缩短;在对实验室留存的100份进口大豆样品检测时,1份样品扩增到了特异性条带,测序分析结果证明此份大豆样品中携带的病菌为菜豆细菌性萎蔫病菌。本试验所建立的巢式PCR检测方法具有特异性强、灵敏度高、检测时间短并且检测准确率高等特点,可用于口岸菜豆细菌性萎蔫病菌的检测。     

水环境中诺如病毒RT-LAMP快速检测方法的建立及应用

[目的]基于诺如病毒(NV)基因保守区,设计一套RT-LAMP简并引物,建立能简便、特异、灵敏检测水环境样品中NV的一步法RT-LAMP技术。[方法]通过试验,优化反应温度(64℃)、反应时间(40 min)、Mg2+浓度(2 mmol/L)等参数,建立反应体系。[结果]该方法只需1台水浴锅在1 h内即可完成检测,可直接用肉眼观察结果,检测灵敏度比普通RT-PCR高100倍;简并引物的设计增强了特异性,可检测多个血清型的NV。[结论]在样品检测中,RT-LAMP技术的灵敏度达97.7%,高于RT-PCR的90.7%,更适用于野外样品和简陋实验室的快捷检测。     

抗虫转CpTI基因植物定性PCR检测技术的建立

为建立CpTI基因定性PCR检测方法,通过数据库查询和测序获得CpTI基因序列,设计特异性定性PCR引物,对引物、PCR反应条件和反应体系进行优化,并对检测方法的特异性、灵敏度等进行分析试验。结果表明,CpTI基因特异性定性PCR检测方法选择退火温度为58℃,引物浓度为0.4μmol/L较好,该方法能够特异性检测样品中CpTI基因,检测灵敏度达0.05%(质量比)。该方法符合农业转基因生物产品成分检测标准对特异性、灵敏度、重复性的要求,可为抗虫转CpTI基因植物生物安全管理提供技术支撑。     

基于液相色谱串联高分辨质谱的动物源农产品兽药残留检测研究综述

液相色谱-高分辨质谱(LC-HRMS)具有高分辨率、高通量、高精确度等优势,在动物源农产品的兽药残留检测研究中显示出极大的潜力。本文综述了2014—2018年LC-HRMS检测动物源农产品中兽药残留的应用研究进展。其中,QuEChERS方法和有机溶剂提取法是常用的兽药残留提取方法,提取液用PSA、C_(18)和氧化铝等吸附剂净化,绿色的样品前处理方法是未来的发展趋势;液相系统和色谱柱的改良,使兽药化合物得到更好的分离,提高了质谱检测的灵敏度;HRMS分辨率和灵敏度的提高,增强了LC-HRMS定性定量分析动物源农产品中兽药残留的能力;数据处理软件的开发和应用,提高了LC-HRMS在兽药残留检测中的工作效率。尽管LC-HRMS在兽药残留检测中取得了进展,但仍存在不足和发展空间。     

砂糖桔黄龙病3种检测引物灵敏性比较研究

柑橘黄龙病是柑橘毁灭性病害,给世界柑橘产业造成了巨大的损失.利用PCR检测黄龙病病原菌是目前柑橘黄龙病诊断的可靠方法,具有快速、特异、高效灵敏等优点.前期已有文献报道过用于常规PCR检测的黄龙病检测引物,但尚无比较这些引物的灵敏性的报道.为了验证相关文献报道的3对引物检测柑橘黄龙病的灵敏度,本研究选择感病砂糖桔样品作为反应模板,并设置相同PCR反应条件下,分别利用3对特异性引物(P1/P2, P3/P4和OI1/OI2c)对10份砂糖桔感病样本总DNA进行扩增.结果表明,引物P1/P2灵敏度最低,扩增不出条带;引物P3/P4灵敏度较好,扩增条带明显,但个别样品扩增条带不明显;引物OI1/OI2c灵敏度最好,所有样品扩增条带均明显.     

蔬菜农药残留检测过程中的质量控制探讨

本文阐述了质量控制在蔬菜农药残留检测过程中的重要性,分析了蔬菜农药残留检测过程中从抽采样、样品流转、制样、标准物质、检测前、样品分析、检测结果质量控制等关键步骤的质量控制措施.