山羊痘病毒疫苗株与野毒株PCR-RFLP鉴别方法的建立及应用

为了建立区分疫苗株与广西分离株的检测方法,根据GenBank上的山羊痘病毒序列设计1对引物,用来扩增山羊痘病毒P32基因,通过对国内疫苗株及6株广西分离株的P32基因进行克隆、测序比较发现,所有广西分离株核苷酸651位的碱基全部由T变为C,647位~652位核苷酸构成由TGTATA变异为TGTACA,多了1个限制性内切酶Bsp1407Ⅰ位点,因此用特异性引物扩增出739 bp的目的片段后,再用限制性内切酶Bsp1407Ⅰ进行酶切分析,疫苗株可以切成135 bp和604 bp 3个片段,广西分离株可以切成135、226、378 bp 3个片段。结果表明,所建立的PCR-RFLP方法可以区分疫苗株和广西分离株。     

山羊痘病毒ITR基因片段的克隆与序列分析

应用PCR方法扩增山羊痘病毒QL、LD、Y和B株ITR基因片段,插入pMD18-T载体,转化DH5α感受态细胞,提取重组载体经PCR和酶切鉴定后测序,并与GenBank上8株羊痘病毒相应序列进行同源性分析。结果经PCR扩增,4株病毒均可得到一条均一的DNA片段,该片段可被内切酶AluⅠ特异酶切,而且该PCR的DNA模板最小检出量为24.40pg。经测序,该基因片段长度为289bp;序列比较发现,4株病毒ITR片段与GenBank上2株山羊痘病毒的核苷酸与氨基酸序列同源性均为100%,与3株绵羊痘病毒分别为98.2%和96.5%,与3株牛疙瘩皮肤病病毒为98.2%～99.3%和96.5%～97.7%。这表明ITR基因片段在羊痘病毒属中较为保守,可以针对ITR基因建立羊痘病毒的PCR检测方法。     

快速鉴别诊断山羊痘病毒和羊口疮病毒二联PCR方法的建立

参照GenBmk已发表的山羊痘病毒(GPV)和羊口疮病毒(ORF)的核苷酸序列设计了两对引物,建立了一种可以快速鉴别山羊痘病毒和羊口疮病毒二重PCR方法,检测结果显示,对山羊痘病毒和羊口疮病毒可以分别扩增出413 bp和595 bp的特异性片段,经敏感性测定,最低能检测到4 pg的DNA。对广西的送检的山羊病料20份进行检测,其中7份可扩增出413 bp的山羊痘特异片段、1份可扩增出595 bp的羊口疮特异片段。该方法能在4 h内完成整个检测过程,不仅快速,而且特异强、敏感性高,很适合于快速诊断。     

山羊痘弱毒疫苗株TK基因的克隆及序列分析

以提取的山羊痘弱毒疫苗株HLJ—V9 DNA为模板，设计特异性引物并进行PCR扩增，获得了2078bp的DNA片段，并将PCR产物克隆至pGEM—T Easy载体。酶切鉴定、PCR鉴定和测序结果表明，成功获得了TK基因，获得的TK基因内存在一个Kpn Ⅰ酶切位点和编码区的早期转录终止信号TTTTTN（T）T。核苷酸和氨基酸同源性分析表明，弱毒疫苗毒株HLJ—V9 TK基因与参考毒株的同源性在95．5％～100％之间，说明羊痘病毒TK基因具有高度的保守性。     

山羊痘病毒基因组DNA的提取及酶切分析

对山羊痘病毒贵州分离株（LD株和QL株）和参考株（Y株和B株）,采用Vero细胞增殖和差速离心浓缩后,以SDS-蛋白酶K法提取病毒基因组DNA,以3种核酸内切酶EcoRⅠ、HindⅢ和PstⅠ进行酶切图谱分析。接种山羊痘病毒48h～60h后,Vero细胞呈现典型的细胞病变;病毒基因组提取样本的纯度在1．8～1．9之间,经琼脂糖凝胶电泳均出现一条纯净的DNA条带;经3种内切酶酶切后,贵州分离株的酶切图谱与参考疫苗毒株Y株基本一致,比参考弱毒株B株少3条～4条酶切片段。这为山羊痘病毒毒力基因的进一步研究奠定了基础。     

山羊痘病毒NM株的分离鉴定

从内蒙古牛场疑似山羊痘病毒感染的病羊中分离到1株病毒,命名为NM株。取病羊的皮肤痘疹和水疱作病料样品,分别接种BHK-21传代细胞和10日龄SPF鸡胚。结果表明,BHK-21细胞出现了明显的、规律的细胞病变,鸡胚接种部位出现了明显的痘斑;NM株细胞毒和胚毒均能够被山羊痘病毒阳性血清所抑制。利用1对山羊痘病毒特异性检测引物对NM株病毒进行PCR扩增,获得445 bp片段,与预期大小一致。将扩增产物提纯后克隆至pMD18-T载体,经酶切鉴定正确后,对阳性克隆株进行序列测定,结果表明,NM株的基因片段与已发表的山羊痘病毒毒株的相应基因片段具有高度同源性,同源性在99.2%~100%之间。     

鸡传染性喉气管炎病毒gB基因的扩增及酶切分析

以从内蒙古区分离的2株传染性喉气管炎病毒(ILTV)株的DNA为模板，用设计好的1对引物对这2株毒株的gB基因进行了PCR扩增，并对扩增产物分别用BglⅡ、PstⅠ、HindⅢ限制性内切酶酶切分析。结果表明，2个分离株均能特异性地扩增出该病毒gB基因片段，片段大小完全一致，为2．6kb；扩增产物的酶切图谱与参考株完全一致。     

山羊痘病毒疫苗株RR基因的克隆与序列分析

用绵羊睾丸细胞培养山羊痘病毒疫苗株G14-STV44-55,提取其基因组为模板,设计还原酶(RR)基因的特异引物进行PCR扩增,并克隆至pGEM-TEasy载体,蓝白斑筛选,酶切和测序签定,并对目的基因进行了序列分析。结果获得了RR基因的阳性克隆PGM-RR,DNA片段长度2 669 bp,内存在BglII等4个单一限制性内切酶酶切位点,编码区5′端含有早期转录终止信号TTTTTN(T)T。RR基因核苷酸和推测的氨基酸同源性与GENEBANK中发表的9个参考毒株的同源性分别在97%和99%以上,说明羊痘病毒RR基因具有高度的保守性。     

禽腺病毒-Ⅰ群PCR-RFLP分型方法的建立

为快速确定临床禽腺病毒-Ⅰ群(FAdVs)的血清型,本研究根据FAdVs的Hexon基因设计引物,对12个血清型FAdVs标准毒株进行PCR扩增,并根据扩增目的片段进行酶切位点分析和相应酶切反应研究,建立聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)方法。结果显示,利用该引物可同时扩增12个血清型FAdVs标准毒株,扩增片段大小为894 bp;扩增片段酶切位点分析显示,Eco130 Ⅰ、Pf123Ⅱ、Mlu Ⅰ、Psy Ⅰ和BgⅡ为主要酶切位点,这5种酶切反应结果显示12个血清型FAdVs标准毒株可以得到不同的酶切图谱,且能区分12种血清型FAdVs;应用该酶切方法对本实验室保存的2株已知血清型的分离株进行分析,其结果与已确定的血清型一致。表明本试验建立的PCR-RFLP方法简便、特异性和区分度好,可用于12个血清型FAdVs的分型。     

山羊痘病毒PCR/酶切检测方法的建立

为了建立一种快速的山羊痘检测方法,根据山羊痘病毒基因组保守区T3A/T3C基因设计了1对引物,以山羊痘病毒DNA为模板进行PCR扩增并连接到pMD18-T载体进行序列测定,测序结果显示片段长491 bp,与已报道的山羊痘病毒对应序列进行比对,同源性高达98%。特异性和灵敏性试验及PCR产物的酶切位点分析表明,该引物特异性好,敏感性强。本研究建立的山羊痘病毒PCR/酶切检测方法可应用于山羊痘病毒感染的临床诊断。     

鸡传染支气管炎病毒H52、H120和M41株的PCR鉴别方法研究

根据GenBank发表的序列,对鸡传染性支气管炎病毒（IBV）H52、H120和M41株全基因组序列进行比较,设计并合成了两对特异性引物,其中一对引物能以M41株为模板,特异性扩增出1791bp的目的片断,从而特异鉴定IBVM41株;另一对引物能以H52株和H120株为模板,特异性扩增1700bp的目的片断,再用限制性内切酶NaeI对PCR产物进行酶切,H120株能够被切成1000bp和700bp两个片段,而H52株的PCR产物不存在该酶切位点,从而能区分H52株和H120株。本研究建立的PCR方法和技术具有快速、简单、特异性强等优点,可用于IBVH52、H120和M41株活疫苗的分子鉴别。     

山羊痘病毒的分离鉴定及生物学特性的研究

本研究对2003年广西部分地区山羊群发生的疑似山羊痘进行了病毒分离鉴定及生物特性的研究。取疑似山羊痘病羊的皮肤丘疹、水泡或脓泡组织的病毒悬液，接种初生羔羊睾丸细胞观察到明显的细胞病变，免疫荧光试验结果显示，病毒能与山羊痘标准阳性血清反应，在感染的细胞浆内发出特异性的黄绿色荧光。病毒悬液接种乳鼠、小鼠、豚鼠、兔子都未发病，而接种3月龄山羊则出现典型的山羊痘症状和病理变化，接种9～10日龄鸡胚绒毛尿囊膜，未见出现痘斑，连传3代，均无异常变化。通过病理组织学观察可以看到在细胞浆内有大小不一圆形或椭圆形的包涵体，在电子显微镜下可以观察到150nm～300nm大小，卵圆形、砖形，有囊膜的病毒颗粒。利用一对山羊痘病毒P32基因引物进行了PCR扩增，将所得序列与GenBank收录的5株山羊痘病毒P32基因的核苷酸及氨基酸序列比较分析。结果与疫苗株的同源性分别为99．8％和99．4％。与国外其它毒株的同源性为99．6％和98、8％～99．4％。研究结果表明，所分离的病毒为山羊痘病毒，在生物学特性上与资料记载存在一定的差异，P32基因与疫苗毒和国外毒株之间同源性非常高。将该毒株命名为山羊痘病毒LiuJiang／2003株。     

猪瘟病毒野毒株与疫苗株酶切检测方法的建立、优化及应用

为有效鉴别猪瘟病毒强毒株(Shimen)与弱毒疫苗株(HCLV),根据GenBank上已发表的猪瘟病毒囊膜糖蛋白E2基因高度保守区设计一对特异性引物,在其跨越区内部有Shimen株独有的限制性内切酶Bgl Ⅱ酶切位点,采取酶切RT-PCR产物的方法鉴别Shimen株和疫苗株,同时对该方法的特异性和敏感性进行检测。结果表明,应用该方法从Shimen株和疫苗株中均能扩增出一条大小为750 bp的特异性片段,疫苗株的RT-PCR产物不能被Bgl Ⅱ酶切,Shimen株的RT-PCR产物则被酶切为大小分别为520和230 bp的两条带。此方法可扩增猪瘟病毒的E2基因保守片段,对病毒RNA的最小检出量为3.96×10^-4 μg/mL。采用此方法检查了30例临床疑似猪瘟病料,结果3例感染猪瘟病毒强毒,21例为猪瘟弱毒疫苗株,其他为猪瘟阴性。     

山羊痘病毒反向末端重复序列的克隆与序列分析

应用PCR方法扩增山羊痘病毒QL、LD、Y、B-株反向末端重复序列片段,将其克隆至pMD18-T载体,构建了重组质粒pMD18-ITR,再将该重组质粒转化DH5α感受态细胞进行培养,对通过PCR、酶切鉴定为阳性的重组菌进行序列测定,并将所得序列与GenBank收录的2株山羊痘病毒、3株绵羊痘病毒全基因序列进行比较分析。结果:所测4个毒株序列与GenBank上收录的山羊痘病毒该片段核苷酸序列的同源性均为100%,与绵羊痘病毒该片段核苷酸序列的同源性均为98.3%。研究结果表明,山羊痘病毒反向末端重复序列与已收录的羊痘毒株之间该片段的同源性非常高,为今后兽医临床上应用PCR方法检测羊痘病毒提供了另一更为特异、保守的基因片段。     

山羊痘云南流行毒株及疫苗株P32基因序列分析

将本实验室分离到的山羊痘病毒云南流行毒株MYS、XW、XD及疫苗株VF4主要结构蛋白基因P32基因克隆到PMD18T载体后进行双向测序,所得序列与Genbank中羊痘病毒属成员:山羊痘病毒(GTPV)、绵羊痘病毒(SPPV)、疙瘩皮肤病病毒(SLDV)参考毒株相应序列作对比分析(ByClustalWMethod),结果显示:(1)MYS、XD毒株P32基因全长969bp,疫苗株VF4为974bp,XW毒株为975bp。(2)XW、疫苗株VF4在100～105bp位置处均插入6个A,在947bp位置缺失一个T;SPPV参考毒株在169～171bp位置插入GAT。(3)由于疫苗株VF4P32基因核苷酸序列第414位置处发生了T/A突变,在该处形成一个新的终止密码子TAA,导致完整的开放读码框架(ORF)被打断,只表达第1～411bp(137个Aa)的基因片段,而不能表达出完整的P32蛋白。其余6株毒株的开放读码框架均很相似。(4)在所构建的系统发生树中,LSDV与SPPV参考毒株、MYS和XD株、VF4和XW株、GTPV参考毒株各被划分为一组。所有7个毒株P32基因核苷酸序列的同源性都很高,均在97%以上。其中疫苗株VF4与SPPV参考毒株的同源性最低,为97.6%。XD与XW毒株的同源性最高,为99.8%。(5)酶切位点分析结果显示,MYS、XW、XD、VF4及GTPV和SLDV参考毒株具有唯一的HinfI酶切位点,大约在第694bp位置。SPPV参考毒株具有2个HinfI酶切位点,分别在第391bp和691bp位置处,该酶切位点较适合用来鉴别山羊痘和绵羊痘病毒,而疙瘩皮肤病在临床上就很容易与山羊痘和绵羊痘鉴别开来。     

猪瘟病毒野毒株和兔化弱毒疫苗株RT-PCR-RFLP鉴别检测方法的建立

本研究旨在建立猪瘟病毒野毒株和兔化弱毒疫苗株RT-PCR-RFLP鉴别检测方法。根据Shimen株设计1对特异性引物,建立猪瘟病毒RT-PCR-RFLP检测方法;对20份疑似猪瘟临床样品进行检测,并对检出的山东8株流行野毒株和2株疫苗株PCR产物进行克隆与序列分析,验证上述方法。结果RT-PCR扩增片段为825bp,产物经RFLP分析,野毒株的PCR产物能被ApaⅠ酶切为322bp和503bp 2个片段,兔化弱毒疫苗株则不能被酶切,检测出RNA的最低浓度为0.028 6μg.mL-1;8株流行野毒株都含GGGCCC序列(ApaⅠ酶切位点),2株疫苗株相应序列为GAGCCC,不能被ApaⅠ酶切;8株流行野毒株属于基因2群,2株疫苗株与HCLV遗传关系近,为基因1群。建立了可鉴别猪瘟病毒野毒株和兔化弱毒疫苗株RT-PCR-RFLP检测方法,为猪瘟的防控提供有效手段。     

应用PCR-RFLP技术检测短喙矮小综合征鹅细小病毒

为准确诊断鸭短喙矮小综合征(SBDS)以及鉴别鹅细小病毒感染鸭群中新发短喙矮小综合征鹅细小病毒(SBDS-GPV),本研究通过对GenBank登录的水禽细小病毒基因组核苷酸序列的比对分析,根据该病毒5'非编码区基因序列特征设计一对特异性引物,建立了SBDS-GPV聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)检测方法。特异性试验和敏感性试验显示,水禽细小病毒特异性引物可以扩增得到约200 bp的目的片段,SBDS-GPV PCR产物能够被SspⅠ酶切为140 bp和60 bp两个片段,番鸭细小病毒与德兹西氏病小鹅瘟病毒则不能被酶切,检出SBDS-GPV DNA的最低浓度为2.28×10~7拷贝/μL。利用该方法对14份疑似SBDS临床样品检测,阳性样本采用SPF鸭胚进行病毒分离,结果显示SBDS-GPV PCR-RFLP检测的阳性样本经病毒分离均为SBDS-GPV。上述研究表明,该SBDS-GPV PCR-RFLP检测方法特异性强、敏感性高,为SBDS的防控提供了有效手段。     

江苏地区2株山羊痘病毒的分离与鉴定

为对江苏部分地区羊场羊痘病毒进行有效的监测和防控,及时了解病毒遗传进化趋势,降低规模化养羊业的风险,本研究从江苏部分地区养羊场采集疑似羊痘病羊的皮肤丘疹、水疱或脓疱组织病料样品,分别接种9日龄SPF鸡胚绒毛尿囊膜、胎羊睾丸细胞(LT)和牛肾细胞(MDBK),观察鸡胚病变和细胞病变情况。同时通过PCR方法扩增羊痘病毒p32基因进行序列分析,并进行p32基因限制性片段长度多态性分析。结果显示,接种鸡胚绒毛尿囊膜形成典型的痘斑,胚体出血;系统进化分析显示,两株分离株属于山羊痘病毒(GTPV);限制性片段长度多态性分析结果也显示符合GTPV的特征。本研究所分离到的2株GTPV,为当地制定山羊痘的防控策略提供依据。     

猪伪狂犬病病毒疫苗株与野毒株鉴别PCR检测方法的建立及初步应用

本试验根据疫苗株缺失gE基因、野毒株和疫苗株均有gB基因的特点,设计两对引物,建立了PCR方法,使用该方法分别对PRV、PCV2、PPV、CSFV、PRRSV进行PCR检测,结果只能从PRV Fa野毒株DNA提取物中扩增出354、237 bp的核苷酸片段,从PRV Bartha-K61疫苗株扩增出237 bp的片段,其他病毒均未扩出条带,达到了区分疫苗株与野毒株的目的。同时,应用该方法对吉林省各大猪场进行了临床病料检测,结果表明,在采集的205份病料中有32份检测为猪伪狂犬病病毒野毒感染,阳性率为15.6%。     

犬瘟热病毒疫苗株附着蛋白基因的克隆及同源性比较

根据发表的犬瘟热病毒(CDV)参考株Ondetstepoort的序列设计1对引物,以犬瘟热病毒疫苗株感染Vero细胞总RNA为模板,利用RT-PCR扩增出附着蛋白基因843 bp片段,将这个片段连接到pMD18-T载体上,经过PCR鉴定、酶切鉴定得到1个阳性克隆,将阳性质粒进行序列测定,结果表明,该片段与Onderstepoort株核苷酸同源性为95.9%。从基因角度为犬瘟热的预防、诊断和治疗提供理论依据。