FQ-PCR检测肌注小鹅瘟病毒VP3基因疫苗在雏鹅体内的动态分布

将30日龄四川白鹅分别肌肉注射接种50μg、100μg和200μg的GPV-VP3基因疫苗(pcDNA-GPV-VP3),以生理盐水和空载体质粒pcDNA3.1(+)为对照,于免疫接种后1h、12h、1d、3d、7d、21d、35d、63d、105d和217d采集全血以及各组织器官,用实时荧光定量PCR(FQ-PCR)检测pcDNA-GPV-VP3在雏鹅体内的动态分布。结果表明:①pcDNA-GPV-VP3各剂量免疫雏鹅1h即可在各组织中被检测到,其中注射部位含量最高,肝、淋巴器官(脾、法氏囊、胸腺、哈氏腺)含量较高;②到217d时,50μg组免疫雏鹅各个组织器官内仍检测到pcDNA-GPV-VP3的存在,但多数组织器官中的含量比1h时约少了103～104;③血液中pcDNA-GPV-VP3的含量较少,且1h～217d各时间点的差异不显著(P≥0.05);④不同剂量pcDNA-GPV-VP3免疫雏鹅各组织中的含量呈现的总体规律为200μg组>100μg组>50μg组,但差异不显著(P≥0.05)。因此,pcDNA-GPV-VP3免疫雏鹅后1h时可分布至雏鹅体内各组织器官中并持续存在217d以上。     

鸭α-干扰素基因疫苗肌肉注射免疫鸭抗鸭瘟强毒感染的研究

将本实验室构建的鸭α-干扰素基因疫苗(pcDNA-SDIFN-α)分别按每只50、100、200μg3个剂量肌肉注射免疫樱桃谷鸭,以PBS、空载体质粒pcDNA3.1(+)和鸭瘟弱毒疫苗为对照,免疫15d后攻击感染鸭瘟强毒,于攻毒后2h、6h、12h、24h、3d、6d、9d、14d、22d、26d、33d和40d采全血,同时取死亡鸭的各组织器官,采用实时荧光定量PCR对鸭瘟病毒在鸭外周血中的动态变化和在各组织器官中的分布及含量进行检测。结果表明:①3个剂量pcDNA-SDIFN-α和鸭瘟弱毒疫苗都对鸭产生良好保护作用,免疫鸭未发生死亡;而PBS和空载体对照组3只鸭中有1只鸭死亡,死亡鸭心、肝、脾、肾、胰和各段肠管中均检测到鸭瘟病毒DNA且其含量大于pcDNA-SDIFN-α免疫鸭外周血病毒DNA含量;②3个剂量pcDNA-SDIFN-α免疫鸭外周血鸭瘟病毒DNA含量比PBS和空载体对照组低,差异显著(P<0.05),特别是在2h差异极显著(P<0.01);攻毒后24h内,3个剂量pcDNA-SDIFN-α免疫鸭外周血鸭瘟病毒DNA含量均低于鸭瘟弱毒疫苗免疫鸭,差异显著(P<0.05);3个不同剂量pcDNA-SDIFN-α免疫组之间外周血鸭瘟病毒DNA含量差异不显著(P>0.05),攻毒初期,200μg免疫鸭外周血鸭瘟病毒DNA含量最低,100μg次之,50μg最高。研究表明,pcDNA-SDIFN-α肌肉注射免疫鸭后能产生一定的抗鸭瘟强毒感染的作用,并在攻毒初期表现出一定的量效关系。     

太子参茎叶多糖对小鼠免疫器官指数和血清免疫球蛋白、补体含量的影响

将60只小鼠随机分为空白对照组,太子参茎叶多糖(RPSLP)低、中、高剂量组,每组15只.空白对照组小鼠灌服0.2m L·d~(-1)蒸馏水,低、中、高剂量组小鼠分别灌服50、100和200 mg·kg~(-1)·d~(-1)RPSLP,14 d后检测各组小鼠的免疫器官指数和血清免疫球蛋白、补体含量,研究RPSLP对小鼠免疫功能的影响.结果表明:与空白对照组相比,高剂量组小鼠的脾脏指数显著提高(P0.05),胸腺指数显著降低(P0.05);低、中剂量组小鼠的IgA含量显著提高(P0.05),低剂量组小鼠的IgM含量显著提高(P0.05),高剂量组小鼠的IgM含量显著降低(P0.05);中、高剂量组小鼠的C_3含量显著提高(P0.05);各剂量组小鼠的IgG和C_4含量无显著差异(P0.05).由此可见,一定剂量的RPSLP可以促进小鼠免疫器官的发育,增强免疫力.     

胸腺肽α1对H5亚型禽流感疫苗的免疫增强作用

为了研究Tα1的免疫增强效果,以120只1日龄SPF鸡作为试验对象,联合应用表达Tα1的重组质粒pcDNA-Tα1和H5亚型禽流感灭活疫苗,观察不同剂量Tα1对免疫鸡只血清HI抗体水平、免疫器官指数以及抗病毒作用的影响。结果表明:Tα1各剂量处理组在鸡只免疫后7～21 d对HI抗体水平有轻微抑制,28 d与正常免疫组达同一水平;鸡只的法氏囊、胸腺和脾脏免疫器官指数均显著增加(P<0.05),尤以低剂量组(50μg/只)效果最佳;攻毒后,Tα1各剂量组对鸡只的保护率均为100%。可见,Tα1对禽流感H5N1疫苗有较强的免疫促进作用,且呈现一定的剂量关系,以低剂量(50μg/只)的免疫增强效果最为理想。     

粗提牛白细胞抗菌肽对小鼠免疫功能的影响

将粗提牛白细胞抗菌肽分别以低、中、高剂量(1.5,7.5,15 g·L~(-1))灌胃小鼠,0.2 mL·只~(-1);对照组分别为灌施体积分数为0.01%醋酸溶液和10 g·L~(-1)的牛血清白蛋白各0.2 mL.测定小鼠的细胞吞噬功能和免疫器官指数;同时采用流式细胞术测定小鼠外同血中T淋巴细胞亚群的总数及各亚群的百分数.结果表明,7.5 g·L~(-1)的粗提牛白细胞抗菌肽能明显提高小鼠的免疫器官指数(P<0.05),增强小鼠的细胞吞噬功能(P<0.05)以及小鼠外周血CD3~+,CD4~+及CD8~+T淋巴细胞的百分数(P<0.01),而高剂量组比中剂量有所降低.7.5 g·L~(-1)的粗提牛白细胞抗菌肽能明显增强小鼠的免疫功能,提高机体的免疫水平.     

MC-LR急性胁迫对草鱼脾脏、头肾显微结构及BAFF和APRIL基因表达的影响

为探讨微囊藻毒素-LR(microcystin-LR,MC-LR)对鱼类的免疫毒性,采用急性毒性实验方法,分别对草鱼经腹腔注射不同剂量的MC-LR并于24、48、72 h和96 h后取免疫器官脾脏和头肾进行组织显微结构分析。结果显示,随着MC-LR剂量的增加和时间的延长,脾脏组织呈现出细胞空泡化并伴随着黑色素巨噬细胞先增多后减少的现象,尤其在75μg MC-LR·kg~(-1)BW和100μg MC-LR·kg~(-1)BW剂量组染毒48 h后,黑色素巨噬细胞中心体积显著增大;头肾组织显微结构变化主要表现为血窦、血管扩张,在75μg MC-LR·kg~(-1)BW和100μg MC-LR·kg~(-1)BW剂量组中的草鱼染毒72 h和96 h后,淋巴组织松散、排列混乱,淋巴细胞空泡化甚至细胞裂解。此外,采用荧光定量PCR分析了草鱼经不同剂量MC-LR处理96 h后脾脏和头肾中BAFF和APRIL基因表达的变化。结果显示BAFF和APRIL的表达均被不同程度地抑制,其中脾脏组织中BAFF基因在75μg MC-LR·kg~(-1)BW剂量组中被显著抑制(P0.05),头肾组织BAFF基因在75、100μg MC-LR·kg~(-1)BW剂量组中均被显著抑制(P0.05),而APRIL除了在25μg MC-LR·kg~(-1)BW剂量组的脾脏组织中表达下调不显著外,在其他处理组均被显著抑制(P0.05)。以上研究结果表明,MC-LR可导致草鱼免疫器官一系列的病理变化,并有时间和剂量效应,此外,MC-LR还可抑制B淋巴细胞分裂相关基因的表达。     

RP-HPLC法测定中华绒螯蟹主要组织中的恩诺沙星及其代谢产物

建立了反相高效液相色谱法(RP-HPLC)测定中华绒螯蟹肌肉、肝胰腺、精巢和卵巢组织内的恩诺沙星、环丙沙星含量。结果表明,恩诺沙星和环丙沙星在四种组织中的平均回收率分别为70.5%±12.61%,70.25%±14.73%;日内精密度分别为3.27%±0.84%,2.14%±0.68%;日间精密度分别为5.38%±2.46%,3.48%±1.16%。恩诺沙星、环丙沙星的最低检测限分别为0.02μg/g和0.004μg/g。以10 mg/kg蟹体重剂量单次肌肉注射给药后,恩诺沙星在中华绒螯蟹肌肉、肝胰腺、精巢和卵巢内的Tmax,Cmax分别为:1 h,4.323±0.56μg/g;1 h,6.042±0.72μg/g;3 h,2.381±0.43μg/g;3 h,2.101±0.29μg/g,各组织的药物消除半衰期(t1/2β)分别为:45.186 h,73.93 h,45.577 h,38.081 h。各组织中均能检测到环丙沙星,但含量均处较低水平,且代谢和消除起伏波动较大。本方法快速、灵敏、准确,适合于中华绒螯蟹组织中恩诺沙星、环丙沙星含量分析。     

RP-HPLC法测定中华绒螯蟹主要组织中的恩诺沙星及其代谢产物

建立了反相高效液相色谱法(RP-HPLC)测定中华绒螯蟹肌肉、肝胰腺、精巢和卵巢组织内的恩诺沙星、环丙沙星含量。结果表明,恩诺沙星和环丙沙星在四种组织中的平均回收率分别为70.5%±12.61%,70.25%±14.73%;日内精密度分别为3.27%±0.84%,2.14%±0.68%;日间精密度分别为5.38%±2.46%,3.48%±1.16%。恩诺沙星、环丙沙星的最低检测限分别为0.02μg/g和0.004μg/g。以10 mg/kg蟹体重剂量单次肌肉注射给药后,恩诺沙星在中华绒螯蟹肌肉、肝胰腺、精巢和卵巢内的Tmax,Cmax分别为:1 h,4.323±0.56μg/g;1 h,6.042±0.72μg/g;3 h,2.381±0.43μg/g;3 h,2.101±0.29μg/g,各组织的药物消除半衰期(t1/2β)分别为:45.186 h,73.93 h,45.577 h,38.081 h。各组织中均能检测到环丙沙星,但含量均处较低水平,且代谢和消除起伏波动较大。本方法快速、灵敏、准确,适合于中华绒螯蟹组织中恩诺沙星、环丙沙星含量分析。     

4种合成活性肽对小鼠生长性能和免疫机能的影响

本试验选用4种合成生物活性肽(肽1、肽2、肽3、肽4分别由15、7、9、7个氨基酸构成,采用固相合成柱手工合成的直链肽)对小鼠进行灌喂饲养试验,旨在探讨其对小鼠的生长性能、免疫机能和器官发育的影响.选取清洁级健康小鼠90只,随机分为9组,每组10只,试验组分别连续灌喂10 μg/kg体重和50 μg/kg体重剂量的4种活性肽,空白对照组灌喂等量蒸馏水.试验期32 d.结果表明:(1)灌喂活性肽15 d和32 d,小鼠体重、平均日耗料量各试验组之间及与对照组间差异均不显著(P>0.05).(2)小鼠灌喂活性肽15 d,50 μg/kg体重肽3能显著提高小鼠血清IgG和IFN-γ含量(P<0.05).(3)小鼠灌喂活性肽15 d,50 μg/kg体重肽1组小鼠肝脏系数显著高于10 μg/kg体重肽1组(P<0.05),其余各组之间无显著差异(P>0.05);心脏、脾脏和肾脏系数各组之间差异均不显著(P>0.05).小鼠灌喂活性肽32 d时,50 μg/kg体重活性肽2、肽3、肽4对小鼠心脏、肝脏和肾脏系数有显著提高作用.综上可见,4种人工合成生物活性肽对小鼠生长性能未见明显影响,对免疫机能和脏器系数有一定的促进作用.     

藏药川西獐牙菜抗小鼠免疫性肝损伤的研究

【目的】探讨川西獐牙菜对卡介苗(BCG)/脂多糖(LPS)所致的免疫性肝损伤小鼠免疫器官脏器指数和血清免疫球蛋白含量的影响。【方法】采用尾静脉注射BCG和LPS构建小鼠(体质量20g)免疫性肝损伤模型。制备川西獐牙菜提取物,按高剂量(5.380mg/只)、中剂量(2.690mg/只)、低剂量(0.538mg/只)灌胃免疫性肝损伤小鼠,连续10d后,取小鼠肝脏、脾脏和胸腺,计算其脏器指数,并取血清,测定其中IgG、IgA、IgM的含量。【结果】川西獐牙菜的各给药组能有效防止BCG/LPS对小鼠各脏器的免疫性损伤,并能影响IgG、IgA、IgM的含量,调节B淋巴细胞网络的紊乱,使异常的免疫状态恢复正常。【结论】川西獐牙菜预防性给药能减轻免疫性肝损伤对小鼠肝脏的破坏,减弱体液免疫功能的亢进,从而起到保肝、抗病、抗损伤的作用。     

猪胸膜肺炎放线杆菌外膜蛋白对小白鼠的最适免疫剂量

以猪传染性胸膜肺炎放线杆菌血清5型外膜蛋白为试材,分别用1、4、7、10、13、16、19、22、25μg/只的剂量对80只30日龄的小白鼠进行攻毒试验,结果其对小白鼠的最适免疫剂量为16μg/只。     

转基因下游MAR在稳定转化的CHO细胞中对基因表达的调控作用

[目的]探讨转基因下游MAR在稳定转化的CHO细胞中对基因表达的调控作用。[方法]将PCR扩增得到的人β-珠蛋白MAR插入到真核表达载体pCATG的下游,构建转基因表达盒3’端含MAR的表达载体。酶切鉴定正确后,转染CHO细胞,G418筛选出稳定转化的细胞株,ELISA分析转基因的表达水平,半定量PCR分析转基因相对拷贝数。[结果]结果表明,表达盒3’端含MAR序列能使转基因表达水平降低,其基因拷贝数则有一定程度的增加。转基因下游β-珠蛋白MAR在一定程度上能抑制外源基因的表达水平;外源基因表达量与基因拷贝数不成正比,未呈现出“拷贝数依赖性”。[结论]该研究结果为进一步研究MAR的调控机制奠定基础。     

小鹅瘟病毒VP3真核表达质粒与弱毒疫苗诱导鹅体免疫应答的比较

 【目的】比较小鹅瘟病毒（GPV）VP3基因疫苗（pcDNA-GPV-VP3）和弱毒疫苗免疫鹅体内的免疫应答,以期为进一步研究和阐明pcDNA-GPV-VP3免疫发生机理、免疫持续期等提供基础数据。【方法】将pcDNA-GPV-VP3和小鹅瘟弱毒疫苗分别免疫30日龄四川白鹅,用免疫组织化学方法检测免疫鹅体内GPV抗原的分布,用淋巴细胞增殖实验和间接ELISA分别检测免疫鹅的细胞免疫水平和血清抗体滴度,比较GPV基因疫苗与弱毒疫苗诱导鹅体免疫应答的能力。【结果】①弱毒疫苗组于免疫鹅的心、肝、脾、肺、肾、法氏囊、胸腺、哈氏腺、十二指肠、空肠、回肠、直肠、盲肠、胰腺、大脑及注射部位肌肉均中检测到GPV抗原;基因疫苗组于免疫鹅的心、十二指肠、空肠、回肠、直肠、盲肠及注射部位肌肉中检测到GPV抗原。②弱毒疫苗免疫雏鹅外周血T淋巴细胞14 d后对ConA的反应开始增强,35 d达到最高值后下降;基因疫苗免疫雏鹅外周血T淋巴细胞OD值先下降,14 d后开始上升并高于空白质粒对照鹅和PBS对照鹅,35 d时达最大值,以后又逐渐下降,第21-63天极显著（P＜0.01）高于PBS对照鹅和空白质粒对照鹅,第21-63 天时极显著（P＜0.01）高于弱毒疫苗免疫鹅。③弱毒疫苗免疫鹅血清抗体第3天开始高于PBS对照鹅,第28天达到最大值后逐渐下降;基因疫苗免疫鹅血清体从第14天开始高于PBS对照组,第28天达最大值,第21-217天显著（P＜0.05）或极显著（P＜0.01）高于PBS和空白质粒对照鹅;基因疫苗免疫鹅血清抗体除第28天极显著(P＜0.01)高于GPV弱毒疫苗免疫鹅外,其余时间与弱毒疫苗免疫鹅差异不显著。【结论】pcDNA-GPV-VP3免疫雏鹅后能在免疫部位皮肤、心肌和各肠段中表达并能够诱导鹅体产生良好的细胞免疫和体液免疫,基因疫苗诱导鹅体产生免疫应答的能力优于弱毒疫苗,结果为阐述pcDNA-GPV-VP3的免疫机制和临床应用提供了数据资料。     

牛fabp3和fabp4基因真核表达载体的构建 及在小鼠成肌细胞中的表达

【目的】分别构建牛fabp3和fabp4基因真核表达载体,并观察载体转染小鼠成肌细胞后基因的表达以及对内源fabp3和fabp4基因表达的影响,检测肉质性状形成相关基因在转基因细胞中的表达及对内源功能基因的影响。【方法】 以pDsRED质粒为骨架载体,分别将人肌红蛋白启动子与目的基因相连、CMV启动子与红色荧光蛋白报告基因相连构建肌肉特异性表达fabp3基因的载体pDsHF3和表达fabp4基因的载体pDsHF4;用脂质体瞬时转染小鼠成肌细胞,72 h后用2%孕马血清诱导成肌细胞向肌管的分化;利用real-time PCR技术检测转染前后成肌细胞中外源牛fabp3和fabp4基因和内源小鼠fabp3和fabp4基因的表达量。【结果】与对照组相比,小鼠成肌细胞分别转染pDsHF3和pDsHF4表达载体,24 h后外源牛fabp3和fabp4基因均获得高水平的表达,48 h后有所回落;而内源小鼠fabp3和fabp4基因在成肌细胞和诱导分化的肌管细胞中的表达均受到不同程度的影响。【结论】构建的真核表达载体能在成肌细胞中高效表达,外源牛fabp3或fabp4基因的转入能够影响小鼠成肌细胞及肌管中内源fabp3和fabp4基因的表达。     

利用SYBR Green实时定量PCR法检测转基因植物外源基因的拷贝数

[目的]探讨SYBR Green实时定量PCR技术应用于检测转基因植物外源基因拷贝数的可行性。[方法]使用SYBR Green实时定量PCR技术,以转CYCD3;1的拟南芥为材料,通过CYCD3;1基因与单拷贝内参基因以及转基因株系中的CYCD3;1基因与野生型植株的比较来确定外源基因的拷贝数。[结果]该法计算所得外源基因拷贝数与传统高准确性的Southern blot法结果相符。[结论]使用该法检测外源基因拷贝数简单易行,可操作性强。     

Gene amplification of c-myc and N-myc in small cell carcinoma of the lung

The relationship of the copy numbers of the c-myc and N-myc oncogenes to tumor formation and progression was studied in small cell carcinoma of the lung. When 96 neoplastic lesions from 45 patients were examined, these lesions could be grouped into three categories: high copy (tumors with greater than 3 copies of the N-myc or c-myc gene per haploid genome), middle copy (1.5 to 3 copies per genome), and normal copy. Fourteen of the patients had middle copy tumors, but this was almost always a result of chromosome duplication rather than the amplification of a small genetic locus. In contrast, five patients had high copy tumors, with the increased copy number in each case due to gene amplification. The amplification did not occur in a heterogeneous fashion within individual patients, since all metastatic lesions from patients with high copy lung tumors were also high copy, while none of 41 metastatic lesions from the other patients were high copy. These data suggest that gene amplification is an important step in neoplastic growth in a subset of patients with small cell carcinoma of the lung and that this genetic event occurs relatively early (before metastasis) in this subset.