新城疫病毒HN蛋白酵母双杂交诱饵载体的构建及鉴定

【目的】应用酵母双杂交技术构建新城疫病毒的血凝素-神经氨酸酶(HN)蛋白线性中和表位区的诱饵载体pGBKT7-HN-neu,为筛选靶向新城疫病毒HN蛋白的中和性纳米抗体奠定基础。【方法】合成HN蛋白的线性中和表位区HN-neu,将其克隆至酵母双杂交系统诱饵载体pGBKT7中,构建诱饵载体pGBKT7-HN-neu,经酶切鉴定和测序验证正确后,将pGBKT7-HN-neu转化酵母菌Y2H Gold,检测其在酵母细胞中的毒性和自激活作用。【结果】成功合成了HN-neu,构建的pGBKT7-HN-neu在酵母细胞Y2H Gold中无毒性和自激活能力。【结论】成功构建了诱饵载体pGBKT7-HN-neu。     

水稻NBS-LRR类抗稻瘟病蛋白Pik-h的互作蛋白筛选

【目的】利用酵母双杂交系统,以组成抗稻瘟病基因Pik-h介导的抗病反应途径。【方法】以含抗稻瘟病基因Pik-h的近等基因系IRBL8为材料,取稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)GD0193接种12和24 h后的水稻叶片,等量混合后提取总RNA,按照2个紧密连锁且功能独立的Pikh-1和Pikh-2蛋白为诱饵,在水稻叶片中筛选与之互作的蛋白,以便深入研究抗病基因Pik-h的酵母双杂交试剂盒（Make Your Own “Mate&Plate” Library System）的要求构建水稻叶片靶标cDNA文库。利用快速重组克隆的方法构建pGBKT7-Pikh1和pGBKT7-Pikh2诱饵载体,并分别将它们转化至酵母菌株Y2H Gold,提取细胞总蛋白后利用Western blot检测Pikh1和Pikh2的表达情况,并对这2个诱饵载体自激活和毒性分析后进行酵母双杂交筛选。提取SD/-Ade/-Leu/-Trp/ -His/X-α-Gal筛选平板培养基上呈蓝色的酵母单克隆的质粒,将其分别与对应的诱饵载体共转化酵母菌株Y2H Gold,涂布于筛选平板培养基上进行互作的重复验证,将通过重复验证的质粒测序分析所得的序列比对水稻基因组数据库以确定目的基因,并对这些基因进行gene ontology（GO）注释分析以确定其分子功能、生物过程及细胞组成。【结果】靶标cDNA文库的库容量约为2.2×10⁶,插入片段长度均大于400 bp,表明水稻cDNA文库质量高。诱饵载体pGBKT7-Pikh1和pGBKT7-Pikh2均能在酵母细胞中正确表达出对应的Pikh1及Pikh2蛋白,无自激活活性而且对酵母无毒性作用,符合文库筛选的要求。利用含有诱饵载体的酵母菌株Y2H Gold与靶标文库菌株Y187结合（Mating）的方式筛选,获得13个与Pikh-1相互作用的蛋白、5个与Pikh-2相互作用的蛋白,其中有2个与Pikh-1及Pikh-2同时存在相互作用。这些蛋白包括4个在逆境响应或激素信号转导过程中起到重要作用的（辅）转录因子、3个信号蛋白、4个参与光合作用的叶绿体蛋白、1个含有U-BOX结构域的蛋白及4个未知功能蛋白。【结论】成功构建了适宜于研究抗病基因（R基因）介导反应途径的酵母双杂交cDNA文库,筛选出Pik-h的互作蛋白,为进一步研究Pik-h或其他抗稻瘟病基因介导的抗病机制打下了基础。     

水稻SGR酵母双杂交诱饵载体的构建及鉴定

[目的]揭示SGR基因的作用机理。[方法]构建水稻SGR基因在酵母双杂交体系中的诱饵载体,并对其表达进行鉴定,将目的基因SGR与诱饵质粒载体pGBKT7通过双酶切定向重组构建诱饵质粒pGBKT7-SGR,将pGBKT7-SGR转入酵母菌株Y187中,利用Western印迹法检测其在酵母中的表达,通过缺陷性培养基培养进行自激活检测。[结果]将鉴定正确的重组质粒测序结果与SGR基因比较,序列完全一致,阅读框分析正确。载体pGBKT7-SGR在酵母菌株Y187中可以正确表达出融合蛋白。重组诱饵pGBKT7-SGR质粒对酵母无毒性,其表达产物不能激活酵母菌株Y187的营养缺陷型报告基因。[结论]该重组诱饵质粒可用于酵母双杂交体系,该研究为从cDNA文库筛选水稻诱饵蛋白SGR的互作蛋白奠定了基础。     

葡萄细胞分裂素响应调节因子VvRR2互作蛋白筛选与鉴定

【目的】从葡萄中克隆细胞分裂素响应调节因子VvRR2,获得VvRR2的互作蛋白,为阐明VvRR2在欧洲葡萄抗病反应中的作用机制提供依据。【方法】对葡萄接种白粉病菌,提取总RNA后反转录,利用实时荧光定量PCR检测VvRR2转录本对白粉病菌的响应;构建瞬时表达载体pBI221-VvRR2-GFP,转化拟南芥原生质体进行亚细胞定位分析;构建酵母表达载体pGBKT7-VvRR2,转化酵母菌株AH109,检测VvRR2的转录激活活性;构建酵母表达cDNA文库,以VvRR2为诱饵,通过Mating法筛选互作蛋白,对获得候选序列进行Blast分析;将候选蛋白VvTGA的全长序列克隆至pGADT7载体形成重组载体pGADT7-VvTGA,与重组诱饵载体pGBKT7-VvRR2共转化酵母,进行双杂交验证VvRR2与VvTGA的相互作用;将VvTGA的全长序列克隆至pSPYNE（R）173载体,形成重组载体pSPYNE-VvTGA,将VvRR2的全长序列克隆至pSPYCE（M）载体,形成重组载体pSPYCE-VvRR2,然后将两个重组载体共转化拟南芥原生质体,利用双分子荧光互补技术验证VvRR2与VvTGA的相互作用。【结果】葡萄接种白粉病菌后,细胞分裂素响应调节因子VvRR2呈现受白粉病菌诱导表达模式。VvRR2定位在拟南芥原生质体的细胞核,转录激活试验结果表明VvRR2在酵母体内具有转录激活活性。在含有60 mmol·L^-1的3-AT培养基上可以抑制VvRR2诱饵载体的自激活活性,VvRR2诱饵载体对宿主酵母菌没有毒性。以VvRR2为诱饵,初步筛选到287个单克隆,在高严谨条件下进一步筛选获得23个有效序列,Blast分析显示这些基因参与蛋白质合成与降解、细胞分裂素信号传导、光反应和生物钟节律、生长发育和逆境响应。酵母回复双杂交试验结果显示含有空载体（pGADT7或pGBKT7）酵母在四缺培养基（含3-AT）上不能生长,含有两种重组质粒的酵母在四缺培养基（含3-AT）上能够生长,并在含有X-α-Gal的四缺培养基上能够显色。双分子荧光互补试验结果显示共转化pSPYCE-VvRR2与pSPYNE（R）173、pSPYNE-VvTGA与pSPYCE（M）的原生质体没有黄色荧光,而共转化pSPYCE-VvRR2与pSPYNE-VvTGA的原生质体显示黄色荧光。VvTGA的表达类似于VvRR2,呈现受白粉病菌诱导表达模式。【结论】葡萄细胞分裂素响应调节因子VvRR2是一个受白粉病菌诱导表达的转录因子,能够与VvTGA相互作用,并且VvTGA受白粉病菌诱导表达。     

幽门螺杆菌空泡毒素P58亚单位在酵母系统中的表达

【目的】构建幽门螺杆菌空泡毒素(VacA)P58亚单位酵母双杂交诱饵表达载体,为应用酵母双杂交系统筛选与空泡毒素P58亚单位相互作用的蛋白奠定基础。【方法】采用PCR方法,从幽门螺杆菌s1/m1型标准毒株NCT11637基因组中扩增空泡毒素P58亚单位,经EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切后克隆入经同样酶切处理的酵母双杂交诱饵载体pGBKT7中,构建pGBKT7-VacA P58重组质粒,并将其转化E.coliDH5α,提取质粒经BamHⅠ、EcoRⅠ双酶切、测序鉴定正确后,转化入宿主酵母菌AH109,色氨酸(Trp)缺陷压力筛选,对阳性转化酵母菌扩大培养,提取总蛋白进行Western-blot鉴定,同时检测重组蛋白有无毒性、渗漏和自激活活性。【结果】成功扩增长度为1202bp的空泡毒素P58片段,重组质粒pGBKT7-VacA P58经BamHⅠ、EcoRⅠ双酶切可得到1202bp大小的片段,测序结果显示扩增产物序列与参考序列完全匹配。重组质粒pGBKT7-VacA P58成功地转化至酵母细胞AH109中。表达的诱饵蛋白无毒性、无渗漏及无自激活活性,Western-blot分析证实酵母菌AH109细胞正确表达了重组蛋白。【结论】成功构建了幽门螺杆菌空泡毒素P58亚单位酵母诱饵表达载体,其可在酵母菌系统中成功表达,且表达产物正确。     

利用酵母双杂交系统筛选本氏烟中与RGSV P5互作的蛋白

【目的】水稻草状矮化病是由水稻草状矮化病毒引起的，给粮食产量造成了严重威胁。RGSV P5是该病毒的沉默抑制子，在抵抗寄主RNA沉默中发挥重要作用。筛选、鉴定与水稻草状矮缩病毒（RGSV）沉默抑制子P5互作的寄主蛋白，为揭示水稻草状矮化病毒致病的分子机制提供理论基础，为该病毒病的防治提供有效策略。【方法】利用酵母双杂交技术筛选与水稻草状矮化病毒P5互作的寄主蛋白。提取感染水稻草状矮化病毒的水稻叶片的总RNA。依据P5基因的CDS序列设计特异性引物。利用RT-PCR技术获得P5基因，将P5基因构建到酵母诱饵表达载体pGBKT7上，利用双酶切鉴定诱饵质粒。将诱饵载体pGBKT7、pGBKT7-P5、重组质粒pGBKT7-P5/pGADT7分别转化到酵母感受态细胞Y2H Gold中，通过观察其在缺陷培养基SD/-Trp、SD/-LeuTrp/上的生长情况及在SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/X-α-gal上的显色情况检测诱饵质粒的毒性和自激活活性。将烟草酵母cDNA文库质粒转化到含诱饵载体pGBKT7-P5的酵母感受态细胞中，先后用不同缺陷型培养基SD/-Leu/-Trp、SD/...     

应用酵母双杂交系统筛选GbVWR互作蛋白

前期研究表明海岛棉(Gossypium barbadense)GbVWR(Verticillium wilt resistance)基因参与了棉花抗黄萎病反应,但其抗病机制尚不清楚。本试验利用酵母双杂交系统筛选GbVWR互作蛋白,并通过对互作关系的分析初步探讨其介导的棉花抗病机制。结果表明:本研究成功构建了酵母双杂交诱饵载体pGBKT7-GbVWR,并利用PEG/LiAc法将其转化至酵母菌株Y2HGold感受态细胞中,结果显示重组质粒无自激活活性及毒性;用携带诱饵载体pGBKT7-GbVWR的酵母菌株与黄萎病诱导的海岛棉Pima90-53酵母双杂交cDNA文库进行杂交,通过PCR、测序和数据库比对分析插入的基因片段,共筛选到24个与GbVWR潜在互作的蛋白,为进一步探明GbVWR的抗病功能提供了理论依据。     

鸡胚成纤维细胞cDNA文库构建及其与禽呼肠孤病毒σA相互作用宿主蛋白的筛选

[目的]构建鸡胚成纤维细胞(CEF)的cDNA文库并筛选与禽呼肠孤病毒(ARV)σA蛋白相互作用的宿主蛋白,为揭示互作蛋白对ARV复制及凋亡的分子调控机制打下基础.[方法]采用TRIzol法提取CEF细胞总RNA,以SMART技术和LD-PCR合成双链cDNA(ds cDNA),ds cDNA和pGADT7-Rec共转化Y187酵母感受态细胞,构建cDNA文库;将pGBKT7-σA诱饵质粒转至Y2HGold酵母感受态细胞中,并与构建的cDNA文库进行酵母双杂交筛选,筛选出的候选文库菌经质粒提取后与pGBKT7-σA诱饵质粒再共转化Y2HGold酵母菌,筛选出能在SD-/Trp/-Leu/-Ade/-His/X-α-Gal/Aba固体培养基上生长且明显变蓝的菌落,最后提取蓝色酵母菌质粒进行测序分析.[结果]构建的CEF细胞cDNA文库库容为1.6×106 CFU,文库滴度为3.1×108 CFU/mL,插入片段大小集中在300~2000 bp,重组率为91.67%.以含有pGBKT7-σA的Y2HGold酵母菌与cDNA文库酵母菌进行双杂交,阳性克隆能在SD-/Trp/-Leu/-Ade/-His/X-α-Gal/Aba(SD/-4/X/A)固体培养基上长出菌落且明显变蓝,测序结果显示共筛选出4个能与σA蛋白相互作用的宿主蛋白,分别是初期多肽相关复合体α亚基(NACA)、核苷二磷酸激酶2(NME2)、假定蛋白及线粒体核糖体蛋白S9(MRPS9).[结论]通过SMART技术构建的CEF细胞cDNA文库具有较好的库容和滴度,且从cDNA文库中筛选出4种与ARVσA蛋白相互作用的宿主蛋白,为后续研究互作蛋白对ARV复制及凋亡的分子调控机制提供了可靠数据.     

葡萄DFR蛋白的生物信息学分析及自激活检测

[目的]生物信息学分析葡萄DFR蛋白的功能结构域和蛋白互作预测,构建DFR酵母双杂交诱饵载体,并检测其自激活活性。[方法]利用NCBI中的CDD分析DFR蛋白保守区域,STRING在线软件对DFR蛋白互作情况进行预测,采用PCR技术扩增出葡萄DFR基因,克隆至酵母双杂交诱饵载体pGBKT7中,PEG/LiAc法将阳性质粒pGBKT7-DFR转化至酵母AH109中,通过缺陷型培养基培养进行自激活检测。[结果]DFR蛋白保守区域有NADP结合位点,预测到DFR蛋白与MybPA1蛋白有互作关系。成功构建了诱饵载体pGBKT7-DFR,并且对酵母菌无毒性,对报告基因无自激活功能。[结论]本研究通过生物信息学分析得出,酵母诱饵蛋白表达载体pGBKT7-DFR,可以作为酵母双杂交诱饵载体筛选与DFR相互作用的蛋白,进而对其进行功能性研究。     

梨幼果FWL1膜系统酵母双杂交三框cDNA文库构建及互作蛋白的筛选

【目的】筛选与FWL1互作的蛋白,为研究FWL1基因调节果实大小机理提供依据。【方法】以杜梨、库尔勒香梨、鸭梨、早美香为材料,提取4个梨品种果实细胞分裂关键时期的果肉组织混样RNA。构建梨幼果FWL1膜系统酵母双杂交三框cDNA文库,并鉴定文库质量。构建诱饵载体并转化酵母菌,筛选与FWL1互作的蛋白,对初步筛选出的阳性酵母克隆进行测序并在NCBI中进行Blast比对,确定候选互作蛋白。【结果】文库库容约为3×10⁷ CFU,大于1×10⁷ CFU,平均插入片段大于1 000 bp,阳性率为≥98%。诱饵载体无自激活功能,利用共转化方法,筛选出272个与FWL1互作的蛋白质。【结论】梨幼果膜系统酵母双杂交三框cDNA文库符合酵母双杂文库的基本条件,适用于后期筛选相互作用的蛋白。筛选出的272个互作蛋白在果实发育过程中表达不同,其中collagen and calcium-binding EGF domain-containing protein 1和metallothionein-like protein可能与梨果实大小发育有关。     

斜卧青霉转录调控蛋白Hac1过表达菌株的构建

【目的】以增强型绿色荧光蛋白为报告基因,构建斜卧青霉转录调控蛋白Hac1激活形式基因(Hac1i)随机插入过表达菌株和非激活形式基因(Hac1u)原位插入过表达菌株,并初步观察Hac1基因的2种不同编码蛋白在菌丝内部的运动情况,为进一步研究转录调控蛋白Hac1的功能奠定基础。【方法】分别克隆ptrA筛选标记、gpdA启动子、Hac1i编码区、eGFP编码区及终止子,利用融合PCR融合克隆片段,构建Hac1i随机插入表达盒;再分别克隆Hac1上游臂及编码区、eGFP编码区及终止子、ptrA筛选标记、Hac1下游臂序列,融合克隆片段,构建Hac1u原位插入表达盒。将2种表达盒分别转化斜卧青霉原生质体,通过吡啶硫胺素筛选标记、PCR扩增等检测获得阳性转化子,荧光显微镜观察融合蛋白的表达及运动情况。【结果】成功构建了Hac1i基因随机插入表达盒和Hac1u基因原位插入表达盒,利用原生质体转化将2种表达盒转入宿主斜卧青霉菌株,经PCR初步验证,得到了阳性转化子。阳性转化子在麸皮培养基上培养2~4d后,可在菌丝内部清晰观察到强烈的绿色荧光信号,表明融合蛋白在菌丝体内得到了正确表达。【结论】成功构建了Hac1i基因随机插入和Hac1u基因原位插入菌株。     

oleosin-MT融合蛋白在拟南芥中的表达及鉴定

【目的】获得转金属硫蛋白(MT)基因的拟南芥植株,为利用植物生物反应器规模化生产MT奠定基础。【方法】利用融合PCR方法,扩增拟南芥MT基因与油体蛋白oleosin基因的融合基因,将融合基因克隆至表达载体pOP上,构建重组质粒pOP-oleosin-MT。采用冻融法将质粒pOP-oleosin-MT转入根癌农杆菌EHA105中,通过农杆菌介导法转化拟南芥,用PCR检测并筛选转基因拟南芥阳性植株,采用SDS-PAGE法检测oleosin-MT融合蛋白的表达,用邻苯三酚自氧化法和结晶紫法测定融合蛋白的体外抗氧化活性。【结果】成功构建了植物油体特异表达载体pOP-oleosin-MT,融合蛋白oleosin-MT在拟南芥种子中成功表达,其分子质量为26ku;总蛋白质量浓度达到50μg/μL时,超氧阴离子的清除率最高,为58.5%;总蛋白质量浓度为10μg/μL时,羟自由基清除率可达69.7%。【结论】成功获得转MT基因的拟南芥株系,并证明融合蛋白oleosin-MT在拟南芥中具有良好的体外抗氧化活性。     

甘蓝型油菜无花瓣品系的选育研究

对品种间杂交选育成的甘蓝型无花瓣品系及其有花瓣的近等基因系初步研究表明,无花瓣品系的花器组成明显比有花瓣品系增大,除一次有效分枝和一次有效角果略多外,农艺性状较差,有待继续提高。幼蕾蛋白质反相高效液相色谱分析表明,无花瓣品系花蕾较有花瓣品系多一种蛋白,其他几种蛋白含量也有明显变化。     

栝楼籽核糖体失活蛋白的纯化及性质研究

用改进的方法从栝楼籽制得一种单链核糖体失活蛋白,研究其性质,ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和ＩＥＦ显示为单一条带,分子量为２９ｋＤ,ｐＩ≥９．３,含糖量约为１．７５％。在兔网织红细胞裂解液系统中对蛋白质合成有较强的抑制活性ＩＣ５０为６．７＊１０＾－１０ｍｏｌ／Ｌ。     

文冠果种子蛋白质提取及组分分析

探索文冠果种子蛋白质及其蛋白质组分的提取方法,采用凯氏定氮法及聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDSPAGE)进行分析,为文冠果种子蛋白的高效提取与开发利用奠定基础。结果表明,文冠果种仁的蛋白质质量分数为26.29%,经脱脂后其脱脂粉中蛋白质量分数为62.04%。采用连续分级提取法得到文冠果种脱脂粉中球蛋白、清蛋白、谷蛋白及醇溶蛋白组分的质量分数分别为26.38%、21.50%、2.49%和1.99%,并采用一次直接提取法可得到水溶蛋白、盐溶蛋白、醇溶蛋白与碱溶蛋白的提取率分别为34.63%、75.57%、7.26%和80.09%。采用碱溶酸沉法对脱脂后的文冠果种进行蛋白提取,蛋白质提取率达84.06%,得率为36.40%,可得到纯度为83.92%的蛋白粉。SDS-PAGE分析图谱表明文冠果种子蛋白的主要亚基分子质量分布在20～60ku,并计算得出4种蛋白组分的主要亚基分子质量,为文冠果蛋白组分的进一步研究提供依据。     

稻瘟病菌磷酸甘露糖基转移酶（PMT）蛋白家族 基因结构特征分析

为阐述稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae）磷酸甘露糖基转移酶PMT基因的结构特征及可能的生物学功能,采用序列比对分析方法,明确了稻瘟病菌PMT蛋白家族成员在氨基酸水平的保守性。研究发现它们与来自灰葡萄孢(Botrytis cinerea)、粗糙脉孢霉菌(Neurospora crassa)、玉米赤霉(Gibberella zeae)及构巢曲霉(Aspergillus nidulans)等丝状真菌的PMT蛋白高度同源;进一步生物信息学分析表明,稻瘟病菌PMT蛋白不含有信号肽,为非分泌蛋白,含有跨膜结构域,作用于内质网膜上,具有保守的PMT motif 和MIR motif。研究结果可为进一步阐明PMT蛋白在稻瘟病菌生长发育及致病过程中的作用机理奠定基础。     

基于Iclp的拟态弧菌OmpUAP真核表达重组质粒的构建及其免疫效果初步评价

为了探明鱼类恒定链类似蛋白(Iclp)能否作为免疫载体,提高基因疫苗的免疫效果,以拟态弧菌OmpU蛋白的黏附功能域(OmpU_(AP))为疫苗靶点,构建真核表达重组质粒pcDNA3.1-OmpU_(AP)和基于草鱼Iclp的pcDNA3.1-Iclp-OmpU_(AP)。用2种真核表达重组质粒分别免疫草金鱼,同时设置空质粒pcDNA3.1(+)对照组与PBS对照组。于免疫后不同时间(7、14、21、28和35 d)采用PCR和RT-PCR方法检测重组质粒在鱼体不同组织中的分布与转录水平的表达情况,使用双抗体夹心ELISA检测血清抗体水平,并于免疫后第35天进行攻毒保护性实验,检测其免疫保护率。结果显示,免疫后第7天在肌肉、鳃、头肾、肝脏和脾脏中均有重组质粒分布,并在35 d内持续表达。pcDNA-OmpU_(AP)免疫组草金鱼的血清抗体水平缓慢上升,除第21天外,其余检测时间点的抗体水平与空质粒对照组无显著差异。pcDNA3.1-Iclp-OmpU_(AP)免疫组草金鱼在免疫后7 d即有血清抗体产生,随着免疫时间延长,抗体水平不断上升,至28 d达到峰值,随后抗体水平开始下降;除第7天外,其余各检测时间点的血清抗体水平均显著或极显著高于pcDNA3.1-OmpU_(AP)免疫组与空质粒对照组。攻毒后pcDNA3.1-Iclp-OmpU_(AP)和pcDNA-OmpU_(AP)免疫组草金鱼的相对免疫保护率为别为46.7%和20%,而空质粒对照组和PBS对照组的实验鱼全部发生死亡。表明Iclp可以作为免疫载体,提高鱼类基因疫苗的免疫效果。     

棘孢木霉M45a的定殖能力及其对水稻促生作用研究

为研究棘孢木霉M45a在水稻体内的定殖规律及促生作用,利用其绿色荧光标记菌株M45a-GFP实时动态观测标记菌的定殖情况,并探究其对大田水稻的促生作用.结果 表明,M45a浸种处理对水稻苗期促生效果最好,其标记菌株M45a-GFP能有效定殖于水稻根系组织.大田促生试验表明,与清水对照相比,M45a浸种处理的水稻在生长50 d时其株高、地上部干重、根际土壤总氮和硝态氮含量显著增加,分别为8.1％、10.0％、14.92％和22.34％.因此,棘孢木霉M45a具有很好的开发潜力,为木霉菌肥部分替代化肥提供了一定的理论基础.     

A型产气荚膜梭菌青海分离株virR基因序列与蛋白结构分析

为了探究产气荚膜梭菌virR基因功能及其蛋白结构特点,提取了产气荚膜梭菌青海分离株的基因组,设计引物对virR基因进行PCR扩增和测序,使用生物软件对该基因进行序列分析和蛋白预测。结果显示,产气荚膜梭菌分离株virR基因长为759 bp,其编码252个氨基酸;分离株virR基因与参考菌株SM101、13、ATCC 13124、CP15、Del1、EHE-NE18、FORC 003、FORC 025、JIR4025、JP55、JP838、LLY N11、NCTC2837以及NCTC13170的virR基因核苷酸序列同源性和氨基酸同源性均在97%以上;二级结构预测显示分离株virR蛋白主要由α螺旋结构和β折叠组成;三级结构预测表明分离株virR蛋白有5种可信度较高的结构,蛋白功能位点预测表明分离株virR蛋白具有1个N-糖基化位点、1个cAMP和cGMP依赖性蛋白激酶磷酸化位点、2个蛋白激酶C磷酸化位点、3个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点以及1个N-豆蔻酰化位点。     

转录因子Prm1和Mit1对毕赤酵母产外源蛋白的影响

【目的】研究转录因子Prm1和Mit1在毕赤酵母表达外源蛋白中的作用,为提高毕赤酵母中的外源蛋白产量提供参考。【方法】以毕赤酵母GS115为出发菌构建8种菌株,以绿色荧光蛋白(GFP)为报告基因,过表达Prm1、Mit1或敲除Prm1、Mit1和Mxr1,以GFP的表达量为指标,分析其对毕赤酵母产外源蛋白的影响。在甲醇和甘油2种碳源下,利用实时定量PCR分析Prm1和Mit1在转录水平的表达情况,探究Prm1和Mit1的关系。【结果】成功构建了表达GFP的菌株、单因子过表达Prm1和Mit1的菌株及敲除Prm1、Mit1、Mxr1的菌株等8种菌株。利用P_AOX1诱导型过表达Prm1,毕赤酵母细胞内的GFP表达量极显著提高(P<0.01),而用P_GAP组成型过表达Prm1,GFP的表达量无明显变化;利用P_AOX1诱导型和P_GAP组成型过表达Mit1,GFP表达量均极显著提高(P<0.01),较对照分别提高3.2和2.5倍;敲除Prm1后,GFP的表达量显著下降(P<0.05);敲除M...