长春地区绵羊和兔隐孢子虫分子流行病学调查

采用抗酸染色法分别对长春地区287份兔粪便样品和167份绵羊粪便样品进行隐孢子虫检查,确认阳性的样品用巢武PCR-RFLP方法扩增隐孢子虫Small-Subunit rRNA基因,选择限制性内切Ssp Ⅰ和Vsp Ⅰ分别对该目的片段单酶切,PCR产物测序后进行RFLP及系统发育分析.结果共检出97份兔粪便和45份羊粪便含有隐孢子虫卵囊,感染率为33.8%和26.9%.巢式PCR-RFLP检测发现由绵羊和兔粪便中分离的隐孢子虫分别是C.parvum和C.bovis,系统发育分析显示隐孢子虫虫种形成了2个群,一个群包括C.parvum,C.boris,C.baileyi,C.meleagridis,C.feti,和C.wrairi,另一个群包括C.andersoni,C.muris和C.serpentis.     

隐孢子虫卵囊不同计数方法的比较

应用PBS液计数法、孔雀绿染色计数法和3种甘油卵囊原液(甘油∶卵囊原液分别为1∶2,1∶1,2∶1)计数法,对同一样本中牛安氏隐孢子虫卵囊进行了计数和比较。结果表明,孔雀绿染色计数法具有灵敏、特异和易操作等特点,是一种比较好的隐孢子虫卵囊计数方法。     

不同条件下蔗糖溶液对隐孢子虫卵囊分离纯化效果的比较

[目的]探索以蔗糖溶液作为介质分离纯化隐孢子虫卵囊的最佳条件。[方法]以隐孢子虫感染阳性奶牛粪样为材料,设计5个蔗糖浓度、3个离心时间和3个离心速度进行隐孢子虫卵裳的分离纯化。[结果]蔗糖浓度为1：2．0和1：2．5时,分离出的卵囊总数极显著大于其他3组（P〈0．01）,其中1：2．5组卵囊平均数最大;不同离心时间分离出的卵囊总数在数量上差异均不显著（P〉0．05）,其中离心20min时卵囊平均数最大;不同离心速度分离出的卵囊总数的比较表明,3000r／min得到的卵囊数量最多。[结论]蔗糖浓度为1：2．5、离心速度为3000r／min、离心时间为20min是隐孢子虫卵囊分离纯化的最佳条件。     

奶牛隐孢子虫SYBR Green Real-time PCR检测方法的建立

为建立一种方便快捷的检测奶牛隐孢子虫的实时荧光定量PCR(Real-time PCR)方法,根据GenBank中已发表的隐孢子虫18s rRNA基因设计一对引物,并以从卵囊中提取的DNA为模版,初步建立了检测奶牛隐孢子虫的SYBR Green Real-time PCR方法,进而对采集的奶牛粪便进行了特异性、敏感性和重复性检测。结果显示,本研究建立的Real-time PCR方法敏感性高,最低检测阈为10个拷贝的质粒DNA和1g粪便中的10个卵囊,扩增产物的特异性良好,重复性试验的标准差为0.494,重复性良好。研究表明,建立的Real-time PCR快速、特异、敏感,可用于奶牛隐孢子虫病的流行病学调查。     

间接ELISA法检测贝氏隐孢子虫特异性IgY抗体的研究

应用蔗糖密度梯度离心法纯化贝氏隐孢子虫卵囊,冰浴超声波破碎、反复冻融卵囊,低温离心获得贝氏隐孢子虫卵囊蛋白质抗原.免疫产蛋鸡,6次免疫后获得高免特异性卵黄抗体IgY.制备辣根过氧化物酶(HRP)标记免抗鸡IgG,其最佳工作浓度为1:4 000～1:6 000,贝氏隐孢子虫卵囊抗原包被浓度8.15 mg·L-1,4℃包被过夜(≥10 h);1×106mg·L-1 BSA-PBST稀释卵黄,建立了检测抗贝氏隐孢子虫特异性卵黄抗体的间接ELISA方法.     

安氏隐孢子虫ITS-1基因PCR检测方法的建立

[目的]建立针对安氏隐孢子虫的PCR快速检测方法,为安氏隐孢子虫的检测和分子流行病学调查提供技术支撑.[方法]根据GenBank中安氏隐孢子虫的ITS-1基因序列设计1对特异性引物,建立基于ITS-1基因的PCR方法,并通过特异性试验、敏感性试验、临床检测以及与经典巢式PCR检测方法进行比较等,验证其可行性.[结果]基于ITS-1基因的PCR检测方法能扩增出安氏隐孢子虫的特异条带,而对猪源隐孢子虫、贝氏隐孢子虫、微小隐孢子虫、牛泰勒氏虫、牛巴贝斯虫、伊氏锥虫、食道口线虫的扩增结果均为阴性;将测序结果进行BLAST比对,发现其与GenBank中安氏隐孢子虫的同源性均在99%以上.敏感性最低可检测每克牛粪中5个卵囊;用于检测广西不同地区的1613份牛粪样品时,与经典巢式PCR检测方法相比,发现两者的阳性检出率均为11.72%,且吻合率达100%.[结论]安氏隐孢子虫ITS-i基因PCR检测方法具有快速、敏感、特异的特点,适用于安氏隐孢子虫的检测和分子流行病学调查分析.     

抗安氏隐孢子虫单克隆抗体的制备与鉴定

将纯化的安氏隐孢子虫卵囊超声波破碎,反复冻融后免疫BALB/C小鼠,取其脾细胞与SP2/0细胞融合,经3～5次有限稀释克隆化,筛选出4株持续分泌抗体的杂交瘤细胞株.通过ELISA,IFA和EITB测其反应性.结果表明,4株杂交瘤细胞培养上清效价为1:100～1:12 800,诱生腹水效价为1:6 400～1:102 400;4株单抗均特异性识别安氏隐孢子虫卵囊壁抗原;免疫印迹表明,4株单抗分别与38.0～97.2 kD的主要抗原蛋白条带起反应.     

牛的鼠隐孢子虫（Cryptosporidium muris）在小鼠体内的发育研究

应用光镜及电镜技术对牛的鼠隐孢子虫在小鼠体内的发育进行了研究。结果表明：鼠隐孢子虫的内生发育是在位于鼠胃腺上皮细胞表面、由微绒毛形成的带虫空泡中进行的。其发育过程包括裂殖生殖、配子生殖和孢子生殖3个阶段。鼠隐孢子虫所有内生发育阶段的虫体均较小隐孢子虫（C.parvum）大,其中卵囊为1.4倍,子孢子为2.5倍,第一代裂殖体为1.3倍,第二代裂殖体为1.5倍,大小配子体均是1.3倍。对虫体透射电镜观察发现,在虫体和宿主细胞的结合处,虫体前部呈结节状突起,并被宿主细胞的纤维素样增生所包裹,形成一发达的营养器。鼠隐孢子虫的这一结构在小隐孢子虫及相关种中未曾发现。     

贝氏隐孢子虫在鸡胚绒毛尿囊膜上发育过程的研究

 借助微分干涉显微镜（NIC）对贝氏隐孢子虫（C. Baileyi）在鸡胚CAM上的发育过程进行了研究。整个发育周期为96小时，全部发育过程包括：脱囊 — 裂殖生殖 — 配子生殖 — 孢子生殖，共4个阶段。裂殖生殖共产生3代裂殖体，在第Ⅰ、Ⅲ代裂殖体中分别含有8个裂殖子，在第Ⅱ代裂殖体中含有4个裂殖子。孢子化过程在CAM内胚层上皮细胞表面的带虫空泡内完成，并产生薄壁型和厚壁型两种卵囊。首次提出虫体具有群体寄生现象和同步发育特征；描述了C. Baileyi的运动期虫体离开母体和发育为滋养体的动态变化过程；应用由粪便中纯化的卵囊直接感染鸡胚成功 。并用37℃水浴脱囊，脱囊率达60%左右，表明温度对隐孢子虫的脱囊具有重要作用，无需胰酶和牛胆酸钠的参与。动物回归试验表明：C. Baileyi不能经胚胎途径造成感染，在CAM上发育的C. Baileyi卵囊对雏鸡具有较强的感染性。     

牛SRY基因的克隆与测序

以牛基因组DNA为模板,在一对特异性引物的引导下,利用PCR技术成功地扩增了牛SRY基因。纯化回收目的片段,克隆到pMD 18-T载体上,筛选阳性克隆测序,得到SRY基因两端的序列(5′端641 bp,3′端786bp)。与网上公布的牛SRY基因序列进行同源性比较,结果显示,牛SRY基因长度为2 713 bp,克隆的5′和3′端2个片段与网上公布的牛SRY基因序列对应片断的同源性分别为98.7%和98.1%。     

鸵鸟源隐孢子虫的种类鉴定及其生物学特性研究

 【目的】掌握鸵鸟隐孢子虫病的流行范围和流行动态，以及研究鸵鸟源隐孢子虫的生物学特性。【方法】应用饱和蔗糖溶液漂浮法检查鸵鸟新鲜粪样404份，详细观察、测量卵囊形态大小；收集纯化阳性样品中的隐孢子虫卵囊，分别人工经口感染幼鸵鸟、雏鸡和小白鼠并利用组织病理学试验技术研究其生物学特性。【结果】检测到阳性样品10份，总阳性率为2.48% (10/404)，且感染率与鸵鸟日龄有一定的关系。其卵囊平均大小为5.43×4.38μm（4.0～6.0×3.7～5.0μm）,形状指数1.24（长/宽）,（n=50）。分离到的卵囊能成功感染雏鸡和幼鸵鸟，但不能感染小白鼠。受试雏鸡具有明显的呼吸道症状，而幼龄鸵鸟呼吸道症状较轻微。此外，在两种动物体内的排卵囊规律差别较大，在鸵鸟体内出现多个排卵囊高峰。虫体主要寄生于雏鸡和幼鸵鸟的泄殖腔和法氏囊，引起法氏囊萎缩、微绒毛大量脱落等病理变化。【结论】根据其卵囊形态、宿主范围和虫体寄生部位等生物学特性，结合文献报道，笔者在国内发现并初步鉴定出鸵鸟源隐孢子虫为贝氏隐孢子虫（Cryptosporidium baileyi）。     

河南省畜禽隐孢子虫病流行病学调查

作者对河南省郑州市开封市及信阳地区牛群、鸭群和鸡群的隐孢子虫病流行情况进行了流行病学调查结果表明:郑州市郊奶牛隐孢子虫感染的平均感染率为40%,随着牛的年龄增大,感染率有呈下降的趋势。经鉴定,郑州市郊奶牛场的隐孢子虫为小鼠隐孢子虫。郑州市开封市及信阳地区家鸭的群体隐孢子虫感染率为69.57%,1～8月龄感染率(87.5%)明显高于8月龄以上鸭的感染率(60%).阳性鸭群粪中卵囊数均较少.郑州市郊8个猪场的粪样中有7个猪场粪样呈阳性.粪样的平均阳性率为17.7%,郑州猪场的隐孢子虫亦为小鼠隐孢子虫.郑州地区12个鸡扬中没有发现隐孢子虫感染。     

保存在重铬酸钾中的微小隐孢子虫卵囊活性及传染性研究

探索保存在4℃2.5%重铬酸钾(K2Cr2O7)中1～30个月的微小隐孢子虫卵囊(CPO)的活性和对免疫抑制BALB/c小鼠的传染性.通过体外脱囊技术评价卵囊的活性,以BALB/c小鼠为感染模型,通过检测CPO感染小鼠的潜伏期、排卵囊数量和回肠末端绒毛中的隐孢子虫数量来评价卵囊的传染性.结果表明:保存在K2Cr2O7中1～16个月的卵囊出现脱囊;免疫抑制BALB/c小鼠在感染保存1～16个月的卵囊后3～8天开始排出大量的卵囊,且在末端回肠绒毛中寄生有大量的隐孢子虫;卵囊的保存时间与潜伏期之间存在强烈的相关性(R2=0.92).因此,CPO在4℃K2CCr2O7中能保持活性和传染性至少16个月,k2Cr2O7是保存CPO的良好介质.     

安氏隐孢子虫卵囊壁蛋白的原核表达及其免疫原性研究

[目的]验证安氏隐孢子虫卵囊壁蛋白(COWP)的免疫原性,为建立安氏隐孢子虫病免疫学诊断方法奠定基础.[方法]根据GenBank已公布的安氏隐孢子虫COWP同源基因序列(DQ060431)设计引物,克隆COWP基因并构建原核表达载体,经IPTG诱导表达后,采用蛋白印迹法检测其免疫原性.[结果]扩增获得的COWP基因片段为549bp,其序列与GenBank已公布CO WP同源基因序列(DQ060431)的同源性达100％,将其插入pET-32a载体可构建pET-32a-COWP表达载体.重组菌在30℃下经0.5 mmol/L IPTG诱导5h后,其表达形式以可溶性表达为主;NTA-Ni亲和层析柱层析时用200 mmol/L咪唑洗脱液洗脱,即能得到纯化的重组蛋白,重组蛋白分子量约40 kDa.以抗His标签鼠单克隆抗体或鼠抗安氏隐孢子虫高免血清为一抗进行Western blotting检测,均能获得预期的目的条带.[结论]重组COWP蛋白具有良好的免疫原性,可作为安氏隐孢子虫病免疫学诊断的候选抗原.     

贝氏隐孢子虫对雏鸡的感染性实验

采用鸭源贝氏隐孢子虫卵囊经口感染2日龄雏鸡,感染剂量分别为8×10~5,16×10~5,32×10~5,64×10~5个/只,设空白对照组.在 PID5,PID10,PID25各取2只鸡进行病理剖检并取其喉头、气管、法氏囊进行扫描电镜观察.在 PID20和 PID25对各试验组动物进行称重,并在 PID25全剖杀实验动物采摘法氏囊并称重;计算各组动物法氏囊与体重元比.结果表明:接种后第4 d 在各组鸡粪便中查到隐孢子虫卵囊.持续排卵囊时间25 d 左右;排卵囊高峰期分别为8×10~5为 PID8～15,16×10~5为 PID12～16,32×10~5为 PID5～16,64×     

PCR技术在住肉孢子虫虫种鉴定上的应用

采用 RAPD 方法对水牛梭形住内孢子虫、待定种及黄牛枯氏住内孢子虫缓殖子基因组 DNA 进行了分析,待定种 PCR 产物的电泳带型与枯氏住肉孢子虫的差异较梭形住内孢子虫大,这与二者表型性状一致的研究结果不吻合.对3种包囊种特异性的 PCR 指纹进行了筛选,回收和纯化了3种包囊种特异性的 DNA 片段,待定种0.7kb 片段经α-~(32)PdATP 标记后用作探针,只与同源 DNA 杂交,不与其它包囊、宿主细胞和艾美耳球虫杂交,用 pGEM-T Easy Vector 对该片段克隆成功,并测出其全长序列,为进一步设计特异引物建立标准 PCR 诊断方法和用作核酸探针奠定了基础。     

牛SRY序列的体外扩增

建立了用PCR(polymerase chain reaction)技术扩增牛SRY序列的方法.在牛、猪、山羊和绵羊的SRY同源序列高度保守区设计一对引物,两条引物均为22NT,对公牛SRY序列的163 bp进行体外扩增.提取牛基因组DNA,用作PCR扩增的模板,采用3×2×3因子组合,建立了PCR扩增牛SRY序列的最适条件.应用设计的引物和最适条件扩增了20头牛的DNA样品.结果表明,公牛样品均出现预期的SRY特异性扩增带,大小为163 bp,而母牛样品不能扩增出特异带.因此所扩增的序列为公牛特异的SRY序列,且片段大小与设计的序列完全一致.     

嵌套式PCR扩增SRY基因序列鉴定牛胚胎性别体系的建立

应用源自牛X和Y染色体同源区的1对外引物P1、P2及其各自特异区的2对内引物P3、P4和P5、P6,进行嵌套式PCR反应,对中国荷斯坦公、母牛静脉血样DNA及牛胚胎样DNA进行特异性条带的嵌套式PCR扩增,并对外、内嵌套式引物的PCR反应体系进行了优化,以准确鉴定牛早期胚胎性别.结果表明,在优化了的PCR反应体系下,中国荷斯坦公牛DNA样品得到178bp和262bp的两个条带,而母牛仅得到262bp的1个条带;静脉血样DNA性别鉴定结果与实际性别相符率为100%,表明本试验建立的体系完全可以用于牛早期的胚胎性别鉴定.     

北京鸭贝氏隐孢子虫(Cryptospridium baileyi)人工感染试验

用饱和蔗糖溶液漂浮法,从北京鸭新鲜粪便中分离贝氏隐孢子虫卵囊,经2日龄雏鸡传代纯化卵囊,收集高峰期排出的卵囊。人工感染2日龄雏鸭157,每只剂量分別为4.27×10~7和2.64×10~7个卵囊;另5只不感染作对照组。实验组在接种后第3天,首次在粪便中发现贝氏隐孢子虫卵囊,排卵囊时间长达17天,排卵囊高峰期为接种后第6-14天。在接种后第7天,实验组鸭开始出现呼吸困难等症状,严重发病多见于感染后第10-14天。临床症状为:张口呼吸、伸颈、胸腹部起伏明显、气喘、咳嗽等。第14天以后临床症状逐渐消失。在楼种后第11天,实验组死亡1只,死亡率为6.7%。剖检发病严重或死亡的雏鸭,可见泄殖腔、法氏囊及呼吸道粘膜上皮水肿,肺腹侧坏死,呈灰白色硬块等;气囊增厚、混浊,呈云雾状外观。用泄殖腔、法氏囊及呼吸道粘膜涂片染色,可见大量的淡红色球形虫体;光镜切片染色亦可见许多大小不一的虫体位于粘膜表面。虫体寄生部位的上皮细胞微绒毛脱落、上皮细胞肿胀等。     

3种牡蛎原虫的流行情况调查及多重PCR检测方法

应用聚合酶链式反应(PCR)方法对福建、广东和海南等地沿海的养殖牡蛎进行包拉米虫、派琴虫和单孢子虫检测.结果表明,这些地区的牡蛎均不同程度地感染这些原虫,经鉴定病原为牡蛎包拉米虫、奥尔森派琴虫和尼氏单孢子虫.根据基因库中奥尔森派琴虫和尼氏单孢子虫的基因序列设计多对特异性引物,检测包拉米虫的引物采用世界动物卫生组织推荐引物,通过对多重PCR反应条件的优化,建立可同时检测这3种原虫的多重PCR方法.运用该方法对样品中的牡蛎包拉米虫、奥尔森派琴虫和尼氏单孢子虫进行扩增,结果得到与试验设计相符的303、480和749 bp 3条特异性扩增条带,对其他贝类病原核酸的扩增均为阴性.多重PCR方法最低能检测到10 pg牡蛎包拉米虫、奥尔森派琴虫和尼氏单孢子虫DNA,表明该方法适用于这3种原虫的快速检测和鉴别诊断.