绵羊KRTAP20-1基因变异及其在不同组织的表达特征

【目的】研究角蛋白关联蛋白(keratin-associated proteins,KAPs)编码基因的遗传变异对绒毛性状的影响,以丰富绵羊功能基因组学并开发基因标记。【方法】采用PCR-SSCP和DNA测序技术,检测KAP20-1编码基因(KRTAP20-1)在甘肃高山细毛羊(细毛羊)、青海半细毛羊(半细毛羊)和藏绵羊(粗毛羊)3个群体中的变异情况;利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术,检测KRTAP20-1基因在甘肃高山细毛羊、小尾寒羊(粗毛羊)成年母羊和羔羊不同组织中的表达情况。【结果】3个绵羊群体KRTAP20-1基因共检测到4个SNPs,其中3个为非同义突变导致氨基酸的改变(P.Gly10Ser、P.Tyr29Phe和P.Ser61Gly),1个为同义突变。等位基因A在3个绵羊群体中均为优势等位基因,其余3个等位基因在不同绵羊群体中分布差异较大。甘肃高山细毛羊KRTAP20-1基因的遗传杂合度、有效等位基因数和多态信息含量均高于其他2个群体。KRTAP20-1基因只在绵羊皮肤中表达,在其他组织中均无表达;在小尾寒羊和甘肃高山细毛羊2个群体中,羔羊皮肤组织中KRTAP20-1表达量均高于母羊,且在小尾寒羊皮肤组织中的表达量高于同期甘肃高山细毛羊,即表现出明显的群体差异性和时空差异性。【结论】绵羊KRTAP20-1基因在不同用途毛用绵羊中的等位基因分布差异及组织表达的种群特异性和时空特异性提示,该基因对羊毛相关性状的形成和表型均有影响。     

内蒙古绒山羊皮肤KRTAPs表达谱与日照时长的相关性

【目的】研究绒山羊皮肤部分角蛋白关联蛋白(keratin-associated protein,KRTAPs)基因的表达谱及其与全年日照变化规律间的相关性。【方法】以3只周岁阿尔巴斯型内蒙古绒山羊体侧皮肤为样本,进行高通量转录组测序(RNA-Seq),对获得的部分KRTAPs基因一年内不同月份间的转录本进行表达丰度分析,并结合当地全年日照变化规律与RT-PCR试验方法,验证KRTAP24-1、KRTAP3-1、KRTAP8-1在关键节点月份的表达谱,确定全年皮肤KRTAPs表达丰度变化与日照变化规律间的相关性。【结果】Illumina solexa高通量转录组测序表明,内蒙古绒山羊全年皮肤部分KRTAPs基因的表达具有规律性差异。RT-PCR试验验证表明,部分基因表达谱与测序表达丰度具有一致性,并且基因差异变化规律与全年日照时长的变化具有相关性。【结论】全年日照时长由长变短(夏-冬)时皮肤KRTAPs表达丰度上调,日照时长由短变长(冬-夏)时皮肤KRTAPs表达丰度下调。     

中国美利奴超细型与哈萨克羊毛囊兴盛期皮肤组织消减cDNA文库的构建

【目的】筛选影响绵羊羊毛性状的重要候选基因,为研究羊毛性状形成的分子机制奠定基础。【方法】利用抑制性消减杂交技术构建中国美利奴超细型和哈萨克羊兴盛期皮肤组织间正、反向消减cDNA文库,并对差异基因进行测序和生物信息学分析;应用半定量RT-PCR和实时荧光定量RT-PCR对部分差异基因进行鉴定。【结果】①从所构建绵羊皮肤组织的正、反向消减cDNA文库中分别获得153和143个ESTs,其中分别包括5和4个未知功能的ESTs,推测可能是新基因;对部分已知功能ESTs进行了GO聚类分析、通路分析和蛋白互作分析,结果显示粗、细毛羊之间存在一定差异;②文库中的3个差异基因KRTAP8-2、Trichohyalin和KRTAP3-2均能在皮肤中特异性地高表达,其中KRTAP8-2和Trichohyalin基因在中国美利奴超细型羊皮肤组织中的表达丰度分别是哈萨克羊的3.45和2.07倍,而KRTAP3-2基因在哈萨克羊皮肤组织表达丰度是中国美利奴超细型羊的1.87倍。【结论】成功构建了中国美利奴超细型和哈萨克羊皮肤组织间抑制性消减cDNA文库,初步筛选出一批可能影响羊毛性状的差异表达ESTs。     

稻瘟病新抗性基因Pi36候选基因双元载体的构建

为了验证Pi36候选基因的功能,利用长片段PCR(long-range PCR,LR-PCR)技术从Pi36基因的供体品种Q61中扩增了3个候选基因Pi36-1,Pi36-2,Pi36-3,长度分别为5.9 kb,9.6 kb和16.5 kb,电泳回收目的片段,将Pi36-1和Pi36-2分别克隆到双元载体pCAMBIA1300,而将Pi36-3克隆到双元载体pYLTAC27的AscI位点.为了将Pi36-3也克隆到具有高效转化效率的双元载体pCAMBIA1300中,首先在不改变pCAMBIA1300基本骨架的前提下,在其多克隆位点增加了AscI酶切位点,获得新载体pCAMBIA1300AscI;然后将克隆在载体pYLTAC27上的Pi36-3片段切下来,组装到新载体pCAMBI-A1300AscI上.经过酶切鉴定和测序分析,已成功地获得了3个候选基因的重组阳性克隆,为进一步地研究Pi36基因的功能奠定了基础.     

节瓜始雌花节位遗传分析

选用始雌花节位有差异的节瓜品种配制组合K36×G1,对其P1、P2、F1、F2代群体植株始雌花节位进行调查,并利用主基因 多基因混合遗传模型联合分离分析始雌花节位的遗传规律.结果显示:K36×G1组合的始雌花节位遗传符合2对加性-显性-上位性主基因 加性-显性多基因遗传模型,F2群体主基因遗传率为64.299%、多基因遗传率为0,环境方差占表型方差的比例为35.701%.说明节瓜始雌花节位是由主基凶和多基因控制的数量性状,早熟性(较低的始雌花节位)可以通过杂种优势来实现;始雌花节位遗传不稳定,易受环境因素的影响,但定向选择会有较好的效果.     

弱光下黄瓜幼苗叶片下胚轴长的遗传分析

通过主基因-多基因联合遗传分析方法分析弱光下黄瓜自交系组合M22×M14、M22×M36两个组合及其6个世代幼苗叶片下胚轴长的遗传效应,结果表明,弱光下下胚轴长符合加性-显性遗传遗传模型,但主基因和多基因在两个不同组合的遗传控制上所起的作用有所不同,组合M22和M36下胚轴长的遗传受1对主基因控制;而M22和M14为微效多基因控制并存在上位性作用。     

高淀粉玉米“郑单958”主要农艺性状主基因+多基因遗传分析

利用植物数量性状主基因+多基因混合遗传模型,以高淀粉玉米杂交组合"郑单958"的P1、F1、P2、B1∶2、B2∶2和F2∶36个家系世代为材料,多世代联合分析了高淀粉玉米主要性状的遗传效应。结果表明:穗长、穗位高由多基因控制;百粒重、单穗重、行粒数、株高由1对加性主基因+加性-显性多基因控制;秃尖长由1对加性-显性主基因+加性-显性多基因控制。     

鸡GNAS基因c.36-2277T>C突变对萤光素酶表达的影响

为分析探讨鸡GNAS基因ENSGALT00000062075.1:c.36-2277TC突变对转录调控的影响,本试验选择乌骨鸡和芦花鸡血液样本,构建了c.36-2277TC突变点的不同基因型质粒,并转染鸡胚成纤维细胞后,检测双萤光素酶报告基因分析系统的表达。结果表明:样本芦花鸡均为TT基因型,乌骨鸡均为CC基因型;c.36-2277TC突变点的上下游-175～+818 bp片段具有显著增强转录活性作用(P0.01),且CC基因型活性极显著高于TT基因型(P0.000 1)。转录因子预测结果表明:此993 bp片段中TGGCA结合蛋白位点数量最多;紧邻突变点分别为AP-1和ER-alpha/T3R-alpha结合位点。研究认为,GNAS基因c.36-2277TC突变点的碱基类型会对基因转录调控进程产生重要影响,且该突变可能是通过与上下游转录因子结合位点共同作用来发挥效用。     

强筋小麦品种川麦36的抗条锈病性状遗传研究

优质强筋小麦品种川麦36自育成以来对条锈病成株期抗性为高抗-免疫,是一份重要优质抗病资源。为研究川麦36抗条锈基因组成及遗传特点,本研究用条锈病条中30(CY30)、条中31(CY31)和条中32(CY32)混合菌种对抗感病双亲、F1、F2、BC1和BC2进行人工接种并做抗性遗传分析。根据F1及BC1、BC2的抗感反应确定抗性基因的显隐性,根据F2的抗感分离比例,经卡方测验确定抗性基因对数。结果表明,川麦36对条锈病条中30(CY30)、条中31(CY31)和条中32(CY32)混合菌种的成株期抗性是由1对显性基因控制。     

爆裂玉米淀粉含量主基因+多基因遗传效应分析

【目的】研究爆裂玉米淀粉含量的遗传方式,为爆裂玉米育种和分子标记辅助选择(MAS)提供理论基础。【方法】以爆裂玉米杂交组合吉爆902(吉812×吉704)的P1、F1、P2、B1∶2、B2∶2和F2∶36个家系世代群体为材料,应用植物数量性状主基因+多基因混合遗传模型,对其淀粉含量进行多世代联合分析。【结果】爆裂玉米淀粉含量由1对加性主基因+加性-显性多基因控制遗传。该杂交组合的B1∶2、B2∶2和F2∶3群体淀粉含量的主基因遗传率为13.86%～82.55%,多基因遗传率为2.91%～70.51%。主基因的加性效应为-10.0643,多基因的加性效应为8.6371,显性效应为-5.1797。【结论】爆裂玉米在早代可以加强淀粉含量的选择。     

内蒙古绒山羊长绒后期褪黑激素埋植时间对其生产性能的影响

为研究内蒙古绒山羊长绒后期褪黑激素埋植时间对绒山羊产绒性能、生长性能和繁殖性能的影响,于2013年4月底抓绒时选用体重相近、产绒量基本一致的3周岁左右的内蒙古绒山羊30只,随机分成3组,分别为对照组、2013年12月和2014年2月2次埋植组(即12月底开始2次埋植组)以及2014年2月单次埋植组(即2月底单次埋植组),埋植褪黑激素剂量为2mg/kg(BW)。埋植开始至试验结束(2014年4月底抓绒)逐月观察山羊绒生长情况,并采集绒样,用于分析埋植对山羊绒生长的影响。称量试验羊的初始和结束体重,并统计产羔数和羔羊初生重。结果表明:1)单次埋植褪黑激素组在4月底抓绒时绝大多数羊颈部存在明显的脱绒损失,而对照组和2次埋植组并未出现脱绒现象;2)埋植褪黑激素对试验结束时羊体重和日增重没有影响(P0.05),对产羔数和羔羊的初生重也无影响(P0.05);3)各组间羊绒长度和细度无差异(P0.05),2次埋植组羊绒产量与对照组没有差异(P0.05),而单次埋植组羊绒产量因提前脱落损失而显著降低(P0.05);4)1—3月份山羊绒生长速率逐渐降低,各组间没有差异(P0.05),且均在4月份停止生长。因此,2月底单次埋植褪黑激素有促使山羊绒提前脱落的作用,12月底开始2次埋植褪黑激素虽没有促使山羊绒提前脱落,但也没有促进山羊绒生长,并未延长山羊绒生长期。     

绒山羊非长绒期埋植褪黑激素对其产绒性能和血浆褪黑激素浓度的影响

为研究内蒙古绒山羊非长绒期埋植褪黑激素对其产绒性能和血浆褪黑激素浓度的影响,采用完全随机试验设计方法,将18只体重基本一致、上一年产绒量较为接近的3周岁内蒙古绒山羊半同胞母羊,随机分为2组,一组为对照组,另一组为试验组,每组9只羊。试验组于抓绒后在羊颈部皮下2次埋植褪黑激素(5月中旬和7月中旬),试验期共5个月。试验开始后逐月观察山羊绒生长情况;当埋植组或对照组开始长绒时,剪取绒毛样品用于生长量和细度测量;每月采集血样分析血浆褪黑激素含量。结果表明:1)埋植组大部分绒山羊6月底羊绒已经长出体表,7月底所用试验羊均已长绒,而对照组8月底大部分羊开始长绒,直至9月底才全部长绒。2)7月底,当对照组还没有长绒时,埋植组羊绒平均长度达34.95mm;9月底,当对照组全部长绒,平均羊绒长度达到22.45mm时,埋植组羊绒平均长度已达57.51 mm,显著高于对照组(P0.05);埋植褪黑激素对羊绒细度无影响(P0.05)。3)对照组从6月起无论白天还是黑夜褪黑激素浓度均逐渐升高,至8月达到最大水平,埋植组在7月达到最高浓度,后缓慢下降至自然水平。在6和7月份,埋植组白天和夜晚血浆褪黑激素含量均显著高于对照组(P0.05),而8和9月份2组间差异不显著(P0.05),但8月份埋植组有高于对照组的趋势。因此,内蒙古绒山羊抓绒后,按2mg/kg(BW)的剂量分2次埋植褪黑激素,可提高血浆中褪黑激素的浓度并诱导山羊绒提前萌发,并且不会影响细度。     

陕西关中某羊场羊口疮病毒的分离鉴定与基因序列分析

羊口疮疫病的暴发可严重影响畜牧的经济效益,为探明陕西地区该病的发病原因。本研究从陕西关中地区某羊场出现特征症状病羊嘴部痂皮中分离病原,经过感染MDBK细胞系,获得1株病毒,经形态学、理化学、PCR检测及病理组织学等方法鉴定,该病毒分离株为羊传染性脓疱病毒(Orf virus,ORFV),命名为ORFV-SXGZ。依据GenBank中发表的ORFV特异性B2L、F1L及VIR基因的核酸序列,设计并合成3对引物,应用PCR方法成功对ORFV-SXGZ毒株的B2L、F1L及VIR基因进行克隆,并将其基因序列及推导的氨基酸序列与其他不同来源ORFV分离株进行比较分析。序列分析结果表明,ORFV-SXGZ毒株的B2L、F1L和VIR基因与其他已发表ORFV毒株之间的核苷酸同源性分别为96.7%~99.6%、95.8%~97.9%和95.0%~99.3%,氨基酸同源性分别为95.3%~99.7%、95.8%~98.2%和95.5%~98.4%。系统进化树分析结果显示,ORFV-SXGZ毒株与国内新疆和甘肃等西北部地区分离株的亲缘关系更近,证实陕西关中地区养殖场中存在羊口疮病毒感染。     

安徽3株柔嫩艾美耳球虫cox1基因部分序列的比对分析

为研究柔嫩艾美耳球虫不同地理株的线粒体细胞色素c氧化酶第1亚基(cox1)基因与球虫种群之间的遗传关系,以安徽3个地区的3株柔嫩艾美耳球虫为研究对象,通过卵囊的分离与纯化获得纯种虫株,然后应用PCR技术对柔嫩艾美球虫3个地理株的cox1序列进行扩增,并与GenBank上登录的鸡柔嫩艾美耳球虫、巨型艾美耳球虫、布氏艾美耳球虫和堆形艾美耳球虫虫株的相应序列进行比对分析。结果显示,每个虫株都成功扩增出800 bp左右的cox1部分有效序列(pcox1),与柔嫩艾美耳球虫pcox1序列种内无差异,pcox1相应序列种间的差异程度为9.9%～14.9%。表明柔嫩艾美耳球虫的cox1序列可作为艾美耳球虫种间遗传变异研究的标记,为进一步研究艾美耳球虫的群体遗传学特性和耐药性奠定了基础。     

内蒙古绒山羊非生绒期内褪黑激素埋植时间对山羊绒生产性能的影响

为研究内蒙古绒山羊非生绒期内褪黑激素埋植时间对山羊绒产量、长度以及细度的影响,于当年4月底抓绒时,选用体重相近、上年度产绒量基本一致的2~3岁内蒙古绒山羊母羊30只,随机分为3组,包括1个对照组和2个褪黑激素埋植组(4和6月2次埋植组、6月单次埋植组),试验开始后逐月观察山羊绒生长情况。结果表明:1)无论是4和6月2次,还是6月单次埋植褪黑激素均能够诱导非生绒期内山羊绒生长,整个羊绒生产周期内没有二次生绒和提前脱绒;2)埋植褪黑激素对山羊绒细度没有影响(P0.05),4和6月埋植褪黑激素组绒山羊产绒量和山羊绒长度显著高于6月埋植组和对照组(P0.05),6月埋植组与对照组间差异不显著(P0.05);3)相比于上年山羊绒品质指标,除4和6月埋植组山羊绒长度显著增加(P0.05)外,其他处理组长度和细度均无差异(P0.05)。因此,4和6月份埋植褪黑激素能够有效诱导山羊绒生长,诱导产生的长绒期与自然长绒期衔接,无提前脱绒,显著提高山羊绒的生产性能。     

海岛棉GbHCT基因的表达分析

通过海岛棉基因组数据库和GSDS 2.0在线生物信息学软件,分析GbHCT基因的结构,利用实时荧光定量PCR技术,检测GbHCT基因在海岛棉不同组织和棉纤维不同发育时间的表达量。结果表明,该基因DNA序列长度为1 953bp,开放阅读框长度为1 311bp,编码436个氨基酸,在海岛棉基因组中对应scaffold3453序列,含有1个内含子和2个外显子。GbHCT基因在不同组织和纤维发育不同时期中均有表达,在各个组织中,苞叶和花中表达量最高,在棉纤维不同发育时期开花后5d和25d表达量最强。该基因可能参与棉纤维发育伸长期和次生壁增厚期。为深入研究该基因的功能,构建植物表达载体pEGAD-GbHCT并转入根癌农杆菌,为下一步研究奠定试验基础。     

基于线粒体Cytb序列的3个宽体金线蛭群体遗传多样性分析

对江苏省扬州高邮、苏州张家港、泰州海陵3个地区宽体金线蛭自然群体的线粒体Cytb基因全序列进行了测定和分析。结果显示:宽体金线蛭Cytb基因全长1 146 bp,样本的A、G、T、C平均含量分别为27.57%、15.77%、43.49%、13.17%,A+T含量(71.06%)明显高于G+C含量(28.94%)。在77个宽体金线蛭样本中,共检测到96个多态位点,其中有58个简约信息位点,获得47个单倍型,共享单倍型数目1个。3个宽体金线蛭群体的平均单倍型多样性、核苷酸多样性、平均核苷酸差异数分别为0.9781、0.0133、15.20,其中泰州海陵群体的单倍型多样度(0.987 7)和核苷酸多样度(0.013 1)最高。3个群体间的遗传分化指数F_(st)为0.065 1～0.175 6,且差异显著(P0.05),不同群体间存在一定的遗传分化。分子方差分析(AMOVA)表明,11.13%的变异来自群体间,88.87%的变异来自群体内。用邻接法构建的单倍型系统发育进化树显示,不同地理群体的个体呈交错分布,没有形成明显的地理谱系。中性检验和核酸不配对分布结果表明,3个宽体金线蛭野生群体总体大小保持相对稳定,没有发生明显的种群扩张。     

牛源耐药性金黄色葡萄球菌的分离鉴定及黏附因子基因FnBP和clfA的表达分析

为探究致奶牛乳房炎主要致病菌金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,S.aureus)的生物学特性,对新疆垦区部分奶牛场乳房炎奶样进行病原学分析,并对病原菌进行耐药性、毒力因子的表达分析。从乳房炎奶样中分离得到S.aureus,采用血浆凝固酶试验、KB法、琼脂筛选法、生化鉴定法(VITEK32)、聚合酶链式反应等法进行鉴定。针对毒力基因clfA(凝集因子A)和FnBP(纤维结合素结合蛋白)进行特异性PCR扩增,用T/A克隆法将其插入pMD18-T载体,并构建原核表达载体pET-28a(+)-FnBP和pET-28a(+)-clfA。转化BL21(DE3)菌,经IPTG诱导表达,通过SDS-PAGE和Western blot分析鉴定表达产物。常规鉴定出葡萄球菌105株,其中金黄色葡萄球菌(S.aureus)62株,从62株S.aureus中检出耐药性金黄色葡萄球菌(MRSA)13株,检出率为20.10%,2株未确检。经测序证实与GenBank中FnBP基因(J04151)和clfA基因(AB245457)序列同源性分别为100%和95.69%。SDS-PAGE显示,clfA和FnBP蛋白相对分子质量分别为45ku和58ku。Western blot分析显示,clfA蛋白和FnBP蛋白均可与金黄色葡萄球菌多克隆抗血清发生特异性反应。病畜奶样中MRSA检出率较高,新疆垦区部分牛场呈蔓延趋势,成功表达了clfA、FnBP蛋白,具有一定的免疫保护效果。     

柔嫩艾美耳球虫杨陵株3-1E基因的克隆与序列分析

根据GenBank发表的鸡柔嫩艾美耳球虫(Ei meriatenella)3-1E基因的ORF设计一对引物,用RT-PCR方法从E.tenella杨陵(YL)株总RNA中扩增3-1E基因,并将扩增产物与pMD18-T easy载体进行连接并测序,用DNAstar 5.0软件对测序结果进行分析。结果表明,2009年分离的E.tenellaYL株3-1E基因与其他虫株相比,核苷酸有9个位点发生变化,其中7个位点的变化引起了相应氨基酸位点的改变,其他2个位点的变化未引起氨基酸的改变。对2006年和2009年分离的YL株3-1E基因的核苷酸进行了比对,结果发现,有两个核苷酸位点发生了变化。系统发育树分析表明,E.tenellaYL株3-1E基因同种间与E.tenella甘肃株遗传关系最近,同属间与E.acervulina法国株遗传关系最近。     

四川省食品动物源大肠杆菌mcr-1与ESBLs基因共转移分析

为了解四川省食品动物源大肠杆菌mcr-1耐药基因流行情况,及其与超广谱β-内酰胺酶基因(ESBLs)共存和共转移的特征,采用微量肉汤稀释法检测菌株对不同抗菌药物的敏感性;采用PCR检测菌株mcr-1,以及mcr-1阳性菌株中ESBLs基因类型;采用质粒接合转移试验分析了mcr-1与ESBLs基因共转移的耐药机制。结果显示:190株大肠杆菌的mcr-1检出率为36.84%,75.71% mcr-1阳性菌株中同时检出ESBLs基因,主要以blaTEM-1、blaCTX-M-55和blaCTX-M-14为优势基因;mcr-1阳性菌对氨曲南(ATM)、头孢噻肟(CTX)和多黏菌素E(COL)耐药率极显著高于mcr-1阴性菌(P<0.01);质粒转移率为47.14%,其中获得mcr-1和ESBLs基因共转移的接合子表现出与供体菌相同的耐药表型及耐药基因。综上,在四川省食品动物源大肠杆菌中,mcr-1与ESBLs基因共存现象广泛存在,且耐药基因易发生水平传播,对菌株多重耐药性的产生具有重要意义。