蜜蜂幼虫芽胞杆菌金属蛋白酶基因的原核表达及多克隆抗体的制备

克隆蜜蜂幼虫芽胞杆菌金属蛋白酶基因PLMP,构建其原核表达载体后进行重组蛋白的表达及纯化,接种公兔制备多克隆抗体,以期为研究幼虫芽胞杆菌快速检测方法奠定基础。用PCR方法扩增幼虫芽胞杆菌PLMP基因,扩增产物克隆至表达载体pGEX-4T-1并转化至E.coliBL21(DE3)感受态中。经不同的诱导时间、IPTG浓度诱导表达PLMP重组蛋白,经SDS-PAGE电泳切胶回收纯化目的蛋白。用目的蛋白对公兔进行4次免疫后,采集血清制备多抗。PCR扩增得到1 242bp的PLMP基因片段;构建原核表达载体pGEX-4T-1-PLMP,经终浓度0.8mmol/L IPTG、37℃诱导表达5h得到分子质量为70ku目的蛋白;用目的蛋白免疫公兔得到的多抗经间接ELISA检测效价达到1∶12 800,Western blot检测出现条带,证明所制备的多抗能够用于PLMP抗原的检测。研究结果构建了表达幼虫芽胞杆菌金属蛋白酶基因PLMP的原核载体,获得了PLMP蛋白,制备了兔抗PLMP多克隆抗体,为建立幼虫芽胞杆菌快速检测方法奠定了基础。     

鸭TLR3基因胞外区的原核表达及抗体制备

采用PCR方法扩增鸭TLR3基因胞外区,将其克隆至原核表达载体p ET-32a(+)中,转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株,经IPTG诱导后,表达重组TLR3蛋白,并从包涵体中纯化重组蛋白。结果显示,PCR扩增得到972 bp的TLR3基因胞外区,用纯化的重组TLR3蛋白免疫实验兔,制备TLR3的多克隆抗体,用Western blot和ELISA检测其特异性及效价。本研究成功表达了TLR3基因胞外区,用该蛋白免疫实验兔后,制备的多抗能与TLR3特异性反应。     

猪NLRP3蛋白的原核表达与多克隆抗体制备

为了获得猪源NLRP3重组蛋白以及针对猪NLRP3蛋白的多克隆抗体,本试验采用原核表达技术对猪源NLRP3蛋白的主要抗原区域进行了截短表达与鉴定,并以重组蛋白为免疫原免疫兔制备兔抗NLRP3蛋白多克隆抗体。结果显示,经RT-PCR方法扩增到大小为864 bp的NLRP3蛋白的主要抗原区域基因;将目的片段定向克隆至pET-32α原核表达载体,转化大肠埃希菌BL21,经IPTG诱导获得了大小为50 000的重组蛋白;重组蛋白经纯化后Western blot检测其可与抗His标签单克隆抗体发生特异性反应;以纯化蛋白为免疫原制备的兔抗NLRP3蛋白多克隆抗体的抗体效价达1∶25 600,Western blot检测其可与NLRP3重组蛋白发生特异性反应。结果表明,获得了具有良好反应活性的NLRP3重组蛋白与多克隆抗体,为研究NLRP3蛋白的结构与功能、NLRP3蛋白与猪炎症性疾病的相互作用机制奠定了基础。     

猪膜联蛋白A2多克隆抗体的制备、亲和纯化与鉴定

本研究旨在制备并亲和纯化兔抗猪膜联蛋白A2多克隆抗体。通过PCR从质粒pA2-EGFP中将编码猪膜联蛋白A2与增强型绿色荧光蛋白融合基因(Annex A2-EGFP)亚克隆到pET-30a(+),构建了原核表达质粒p30a/AE,转化大肠杆菌Rosetta(DE3),经IPTG诱导以包涵体形式表达了猪ANNXA2-EGFP融合蛋白,用Ni-Resin HP树脂对表达的目的蛋白进行亲和纯化。用纯化的ANNXA2-EGFP融合蛋白免疫兔,制备兔抗猪膜联蛋白A2多克隆抗体。将以前纯化的猪可溶性GST-ANNXA2融合蛋白偶联NHS活化琼脂糖凝胶FF,亲和纯化多克隆抗体。用GST-ANNXA2亲和纯化的多抗效价达到1∶12800,Western blot和免疫组化结果证实具有高特异性。制备的高效价和高特异性兔抗猪膜联蛋白A2多克隆抗体,为进一步研究膜联蛋白A2在病毒感染中的作用奠定了基础。     

基因Ⅱ型鹅星状病毒ORF2蛋白原核表达及多克隆抗体的制备与鉴定

旨在利用原核表达系统表达基因Ⅱ型鹅星状病毒(goose astrovirus, GoAstV)ORF2蛋白,制备兔源多克隆抗体,并对制备的多抗进行效价检测及鉴定。根据GoAstV-GDZJ37株ORF2基因序列设计特异性表达引物,利用RT-PCR方法进行目的基因扩增,将其连接至原核表达载体pET-32a(+);经酶切鉴定和测序正确后,转化至表达感受态细胞,并进行诱导表达及SDS-PAGE分析。以无His标签的ORF2蛋白作为免疫原免疫新西兰大白兔,制备兔源多克隆抗体。将含His标签的ORF2蛋白经Ni-NTA亲和层析法进行纯化,并以纯化后的蛋白作为检测原,通过I-ELISA方法检测兔源多克隆抗体的效价,并通过Western blot及IFA检测方法鉴定其特异性。结果显示,克隆获得GoAstV-GDZJ37株ORF2基因,并利用原核表达系统分别表达2种重组蛋白,大小分别为77、95 kDa,且均为不可溶性表达。I-ELISA结果显示,多克隆抗体的效价为1∶102 400,表明无His标签的ORF2蛋白具有良好的免疫原性;Western blot及IFA结果显示,多克隆抗体可与含His标签...     

非洲猪瘟K205R蛋白的原核表达及多抗的制备

为了表达非洲猪瘟K205R蛋白,进而制备其多克隆抗体,为非洲猪瘟血清学检测方法的建立奠定基础。以合成的K205R基因为模板,PCR扩增该基因序列,并将其克隆至原核表达载体p ET-21a中,得到重组质粒p ET-21a-ASFV-K205R。经酶切和测序鉴定后,将重组质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,IPTG诱导表达His-ASFV-K205R融合蛋白,通过亲和层析的方法纯化His-ASFV-K205R融合蛋白。通过Western Blot方法鉴定融合蛋白的抗原性,以此融合蛋白为抗原免疫兔制备多克隆抗体,通过ELISA的方法测定多抗效价。结果表明,原核表达的K205R蛋白具有很好的抗原性,制备的兔多克隆抗体效价为1∶128 000,为建立非洲猪瘟的血清学检测方法提供生物材料。     

猪细小病毒VP2的原核表达与多克隆抗体制备

克隆猪细小病毒(PPV)VP2基因全长1 740bp,构建其原核表达载体后进行蛋白的表达与纯化,接种家兔制备多克隆抗体。用PCR方法扩增PPV VP2全长基因,扩增产物克隆至表达载体pET-32a并转化至E.coli BL21(DE3)感受态中。分别用不同诱导时间、IPTG浓度、温度诱导表达VP2重组蛋白,经SDS-PAGE电泳切胶回收纯化目的蛋白。对家兔进行3次免疫后,采集血清制备抗体。PCR扩增得到1 740bp的VP2基因片段;构建原核表达载体pET-32a-VP2,经37℃,IPTG浓度1.0mmol/L诱导表达4h可得分子质量大小约为82ku目的蛋白;间接ELISA检测抗体效价可达1∶12 800;Western blot证明所制备的抗体能够有效的应用于PPV VP2抗原的检测。本研究成功构建了表达PPV VP2基因的原核载体,获得了VP2蛋白,制备了兔抗多克隆抗体,为建立检测PPV VP2蛋白ELISA方法奠定了基础。     

旋毛虫成虫DNaseⅡ—T3223-7基因的克隆及其表达特性鉴定

利用RT-PCR技术从旋毛虫成虫得到T3223-7基因,并进行扩增克隆到原核克隆载体pMD18-T中,将重组质粒转入克隆菌DH5α,提取质粒进行酶切和测序鉴定,连接至pET-28a表达载体,最后转入表达菌Rosetta(DE3)。用1mmol/L IPTG诱导培养重组表达菌,对菌体裂解物进行SDS-PAGE分析,发现重组蛋白以包涵体的形式表达,约为40 000,与理论值相符。将纯化后的重组蛋白免疫家兔,制备兔抗T3223-7蛋白多克隆抗体,间接ELISA测定多抗效价达1∶320 000,Western blot检测表明制备的多克隆抗体能与T3223-7抗原发生特异性反应,并能识别和结合旋毛虫成虫排泄分泌物(ES)。     

牛诱导型热休克蛋白72多克隆抗体的制备

将扩增的诱导型Hsp72的部分基因片段克隆到pMD-18Tvector中测序。将阳性克隆的PCR产物克隆到质粒pET-32a-c(+)中,并将重组表达载体转化E.coliBL21(DE3)。重组表达载体酶切鉴定,在大肠杆菌中经IPTG诱导表达有活性的可溶性蛋白。采用纯化后的Hsp72免疫家兔,制备抗血清,Western-blot检测重组抗原的反应原性。Western-blot检测证明,所制备的多克隆抗体可以与Hsp72特异性结合。     

猪源牛病毒性腹泻病毒SD0803株E2蛋白的表达及抗体制备

表达去除SD0803E2基因跨膜疏水区的sE2蛋白并制备其抗体,为猪源BVDV诊断奠定基础。RT-PCR扩增SD0803株sE2基因,构建重组原核表达载体pGEX-4T-1-sE2,转化BL21(DE3),IPTG诱导蛋白表达,以纯化的重组蛋白为抗原免疫家兔制备多克隆抗体。采用间接ELISA、Western blot、间接免疫荧光等方法鉴定获得的抗体。结果显示,抗体效价最高可达1∶256 000;制备的抗体可与rsE2蛋白特异性结合;该抗体可特异性识别BVDV感染MDBK细胞表达的E2蛋白,显示抗体高度的特异性。成功构建pGEX-4T-1-sE2原核表达质粒,诱导其表达的蛋白免疫家兔,成功制备的猪源BVDV SD0803株E2抗体。     

基于Cap蛋白研制的猪圆环病毒2型疫苗研究进展

猪圆环病毒相关疾病(PCVAD)是危害世界养猪业的主要疫病之一,主要由猪圆环病毒2型(PCV-2)引起。该病毒可引起感染猪免疫系统的破坏,造成严重的免疫抑制,继而引发多种病毒/细菌的混合感染与继发感染,给世界养猪业造成了巨大经济损失。近年来疫苗免疫接种是防控PCVAD的有效手段,由于衣壳蛋白(capside,Cap)是PCV-2的主要免疫保护性抗原,因此常被用作研制PCV-2基因工程疫苗的理想靶抗原。论文就PCV-2Cap蛋白基因工程疫苗的研究进展进行综述,以期为今后PCV-2新型疫苗的研究提供参考。     

刺五加提取物对断奶仔猪生长性能、免疫功能和肠道菌群的影响

文章旨在研究刺五加提取物对断奶仔猪生长性能、免疫功能和肠道菌群的影响,并探讨其替代抗生素的效果。试验选取150头健康、体重相近的21日龄杜×长×大断奶仔猪,随机分为3组,每组5个重复,每个重复单独一栏饲养,每栏10头仔猪。3个处理组分别为:只饲喂基础日粮的对照组,在基础日粮中添加20 mg/kg硫酸粘杆菌素的抗生素组,以及在基础日粮中添加0.1%刺五加提取物的刺五加组。试验开始前预饲3 d,正式试验28 d。结果表明:与饲喂基础日粮相比,日粮添加抗生素和刺五加提取物显著提高了断奶仔猪的平均日增重(P <0.05),降低了料重比和腹泻率(P <0.05),且日粮添加刺五加提取物的效果优于添加硫酸粘杆菌素;与对照组相比,抗生素组和刺五加组均显著提高了断奶仔猪血清中IgG和IgM水平(P <0.05),且日粮添加抗生素有提高血清中IgA水平的趋势,但差异不显著(P> 0.05);此外,抗生素和刺五加提取物的添加还显著降低了断奶仔猪盲肠中大肠杆菌和沙门氏菌的数量(P <0.05),添加抗生素显著降低了盲肠中双歧杆菌和乳酸杆菌的数量(P <0.05),添加刺五加提取物反而显著提高了盲肠中双歧杆菌的数量(P <0.05)。综上所述,刺五加提取物在提高断奶仔猪生长性能、免疫功能和调节肠道菌群方面均具有一定的优势,是一类潜力较大的抗生素替代品。     

两株H1N1亚型重组流感病毒的猪致病性研究

选取2种不同宿主来源的新型甲型重组H1N1亚型流感病毒(犬流感病毒(A/canine/Guangxi/QZ5/2013)(简称CIV-QZ5)和猪流感病毒(A/swine/Guangxi/QZ5/2014)(简称SIV-QZ5),以猪为动物模型,分别以106 PFU/mL病毒剂量和气管攻毒的方式感染3周龄仔猪,从而探究新型甲型重组犬流感病毒对猪的致病性。试验发现CIV-QZ5及SIV-QZ5均能有效感染仔猪,攻毒仔猪均出现发热(≥39.5℃)、流鼻涕、食欲减退、活动减少等流感症状,其中CIV组出现1头仔猪(A3)死亡。通过对肺脏灌洗液进行病毒滴定,发现CIV组在攻毒后3d和5d在肺脏的复制能力较SIV组强,最高达到3.12log10PFU/mL。病理剖检发现,肺脏出现不同程度的实变。肺脏病理切片发现两组均出现不同病变,其中以死亡仔猪(A3)最为明显,主要以支气管上皮细胞坏死脱落,肺泡壁增厚,肺泡腔以及支气管内有大量的弥漫性浸润的单核细胞为主要特征。结果表明,猪源甲型重组CIV不仅能引发猪出现明显流感症状,而且能有效地在肺脏复制,为了解潜在的猪-犬跨宿主传播机制奠定了基础。     

玉林市犬狂犬病流行状况调查

通过调查问卷方式得知2010-2016年玉林市犬只饲养量年均20.13万头,免疫犬年均为13.64万头,免疫密度年均为67.74%,仍存在未经免疫的犬。ELISA方法检测免疫犬抗体阳性率为91.57%(1509/1648),非免疫犬为4.13%(10/242);RT-PCR方法检测520份犬脑组织,病原检出率为5.00%(26/520)。通过数据分析与实际情况结合,表明玉林市犬狂犬病免疫抗体合格率较高,疫苗效果表现稳定,外观健康犬仍携带狂犬病病毒。     

2016—2018年广西病死番鸭细小病毒感染检测

为了解番鸭细小病毒(MDPV)在广西病死番鸭中的感染情况,通过PCR方法,对2016—2018年广西地区送检的362份病死番鸭样品进行MDPV检测,并进行群间和时间分布以及混合感染分析。结果显示:2016—2018年广西病死番鸭平均MDPV样品检出率为10.22%(37/362),其中未免疫MDPV疫苗的样品检出率(16.36%)高于已免疫的(1.35%),20日龄以内的(19.51%)高于21日龄以上的(2.53%),2018年的(12.84%)高于2017年(8.62%)和2016年的(8.16%),3—5月(15.46%)和9—11月(11.49%)的高于1—2月(9.68%)和6—8月(3.53%)的;群阳性检出率在10.20%~21.62%之间,分布特点同样品检出率基本相同。送检的MDPV阳性和阴性样品中,均检出鸭黄病毒、鸭圆环病毒、鸭I型肝炎病毒以及禽多杀性巴氏杆菌、大肠杆菌等5种病原菌。结果表明:广西地区存在一定程度的MDPV流行且有加重趋势;MDPV在春、秋季流行较为严重,主要侵害20日龄以内幼鸭;免疫对于控制MDPV感染具有较好效果,病死番鸭中多种病毒和细菌的混合感染现象较为普遍。结果提示,要加强春、秋季节的MDPV疫苗免疫,尤其是对20日龄以内的幼鸭,同时要采取综合措施,控制病原的混合感染。     

陕西省部分地区山羊隐性乳房炎调查及灭活苗效果观察

在对陕北白绒山羊和关中奶山羊乳房炎阳性率调查的基础上,以乳房炎山羊乳中分离的大肠埃希菌和金黄色葡萄球菌制成二联灭活疫苗,对处于妊娠期的陕北白绒山羊进行免疫接种,观察制备的灭活疫苗对陕北白绒山羊的免疫效果。结果显示,陕北白绒山羊乳房炎发病率(11.5%)显著低于关中奶山羊(66%),说明山羊乳房炎发病率受不同经济用途和环境因素的影响。免疫试验结果显示,免疫后14d和28d,免疫山羊抗大肠埃希菌和金黄色葡萄球菌的抗体水平均显著高于免疫前的水平(P<0.5),表明制备的乳房炎二联疫苗能有效激发山羊机体的体液免疫应答,刺激机体产生高水平的抗体,研究结果对不同品种山羊乳房炎的防控和乳房炎疫苗的研发具有重要的参考意义。     

西番莲颗粒的急性和亚慢性毒性试验

旨在考察西潘莲颗粒对小鼠的急性毒性和大鼠的亚慢毒性作用,以评价其安全性,为临床用药提供理论依据。在急性毒性试验中,分不同浓度给小鼠灌胃给药,测试西番莲颗粒的半数致死量(LD50)和最大耐受剂量,在亚慢性毒性试验中,西番莲颗粒以3.3、1.65、0.825g/kg的剂量对SD大鼠连续灌胃4周,并观察其生理状况及其体重变化情况,在第4周周末对大鼠组织病理学、血液生化指标和血常规进行检测。结果表明,西番莲颗粒各剂量组均不引起小鼠死亡,无法测出LD50,最大耐受剂量为16.5g/kg体重;在对大鼠的亚慢毒性试验中,连续给药期间未见大鼠有不良反应,试验组大鼠在增重、血常规和血液生化指标上与对照组无显著差异或均在95%正常值范围内波动,在各脏器未发现异常组织病理学变化。说明受试药物西番莲颗粒实际无毒,安全可靠。     

PEDV、TGEV、PDCoV、PRoV多重TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法的建立及应用

为建立鉴别检测猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)和猪轮状病毒(PRoV)的方法,本研究分别针对PEDVN基因、TGEVM基因、PDCoVM基因和PRoVVP6基因设计特异性引物和TaqMan探针,经过优化反应条件,建立了同时检测4种病毒的多重TaqMan荧光定量RT-PCR方法。结果显示,该方法仅特异性扩增PEDV、TGEV、PDCoV和PRoV,与猪其它主要病毒无交叉反应,特异性较强;对PEDV、TGEV、PDCoV和PRoV的质粒标准品的最低检出限分别为2.06×10^2拷贝/μL、2.06×10^2拷贝/μL、2.06×10^1拷贝/μL、2.06×10^3拷贝/μL,具有较高敏感性;组内与组间变异系数均小于1.1%,具有良好的重复性。应用该方法和普通多重RT-PCR检测临床采集的243份腹泻病料样品,两者的符合率为96.71%。本研究建立的方法为临床PEDV、TGEV、PDCoV、PRoV的鉴别检测及流行病学调查提供了一种快速、特异、敏感、高效的技术手段。     

沙门菌非编码小RNA RyhB研究进展

非编码小RNA(small non-coding RNA,sRNA)是一类基因组中被转录但不翻译成蛋白质的RNA分子,可在转录后水平调控基因表达。与蛋白质介导的调控系统不同,当细菌遇到不利的生长环境时,sRNA介导的调控可对环境变化做出快速应答。沙门菌RyhB-1和RyhB-2是两种相似性较高的sRNA,通过碱基互补配对方式,在调控因子作用下共同或单独调控靶基因表达。铁匮乏时,RyhB-1和RyhB-2可促进沙门菌摄取铁元素、限制胞内非必需含铁蛋白生成以及加快铁硫蛋白的储存,是沙门菌在转录后水平调控铁稳态的主要元件。此外,当沙门菌遭遇氧化应激、缺氧或酸性环境等不利环境胁迫时,RyhB可分别控制活性氧自由基的生成、平衡硝酸盐等无机物稳态、调节细菌运动性以及沙门菌毒力等应对环境变化。本文就沙门菌RyhB生理特征及其调控机制和功能进行阐述,以期为后续沙门菌RyhB的研究提供指导信息。     

2015年-2017年广西规模化猪场主要病毒性疫病流行调查

为了解广西地区近3年规模化猪场主要病毒性传染病的流行情况,应用PCR及RT-PCR方法对2015年-2017年广西的1648份疑似猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪圆环病毒2型(PCV-2)、猪圆环病毒3型(PCV-3)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)和猪流行性腹泻病毒(PEDV)感染的病料进行病原学检测。结果显示,CSFV、PRRSV、PRV、PCV-2、PCV-3、TGEV和PEDV的阳性率分别是2.06%(13/632)、14.43%(192/1331)、12.10%(88/727)、14.32%(132/922)、53.85%(42/78)、10.87%(20/184)和32.00%(72/225)。PRV、TGEV和PEDV的感染率呈逐年上升趋势,PCV-2的感染率呈逐年递减趋势。二重感染以PCV-2和其他病毒感染为主,其中PRRSV和PCV-2的二重感染率最高,平均感染率为2.93%。CSFV、PRRSV、PRV、PCV-2、PEDV的感染率在冬季比较高,分别为3.75%、23.86%、19.02%、27.73%和57.78%。检测结果表明,PRRSV和PCV-2是目前对广西规模化猪场危害较为严重的主要病毒性疫病。PCV-3作为一种新发现病毒,引起母猪皮炎肾病综合征与繁殖障碍和仔猪腹泻,对养猪业造成了一定的威胁。规模化猪场流行的腹泻性病毒主要是PEDV和TGEV。