埃博拉病毒抗体间接ELISA检测方法的建立及应用

为建立EBOV抗体间接ELISA检测方法,以纯化后的EBOV糖蛋白作为包被抗原,HRP标记山羊抗马IgG为二抗,EBOV阳性马血清和阴性马血清分别为阳、阴性对照,优化反应条件,以EBOV病毒样颗粒免疫获得的高免马血清评价其特异性和敏感性,并将检测结果与基于假病毒的中和抗体检测结果相比较,进一步评价EBOV抗体ELISA检测方法在EBOV免疫血清抗体水平检测中的应用。优化后的间接ELISA方法可特异性检测EBOV抗体,与西尼罗病毒等的阳性血清均不发生反应,检测结果与基于假病毒的中和抗体检测结果相平行。批内、批间试验变异系数均小于8%。本研究成功建立了EBOV抗体间接ELISA检测方法,为EBOV免疫血清抗体水平检测提供了一种简便、快速的检测方法。     

埃博拉病毒病抗原反向间接血凝检测方法的建立

为建立埃博拉病毒(Ebola virus,EBOV)抗原快速检测方法,本研究利用纯化后的埃博拉病毒样颗粒(EBOV-VLPs)免疫马匹制备阳性血清,采用饱和硫酸铵沉淀法初纯血清中的IgG,后经过Protien G柱亲和层析法精纯IgG,利用精纯后的IgG致敏醛化的绵羊红细胞,建立反向间接血凝抗原检测方法,并对该方法进行最佳反应条件的优化。将该方法用于不同批次制得的已知病毒滴度埃博拉假病毒血凝效价检测,检测结果显示:病毒滴度的高低与血凝效价检测结果呈现良好的相关性。本研究成功建立埃博拉病毒抗原反向间接血凝检测方法,该方法简单、方便、快捷,无需特殊的仪器设备,1 h内便可报告检测结果,在普通实验室中便可进行操作。此外,该方法也适用于埃博拉病毒感染及疫病暴发后临床样品的定性分析。     

牛病毒性腹泻病毒重组p80蛋白的间接ELISA方法的建立

为建立以牛病毒性腹泻病毒(BVDV)非结构蛋白p80为包被抗原的间接ELISA方法,本研究将重组质粒pET30a-p80转化至大肠杆菌BL21(DE3)表达菌,将转化菌培养并诱导后,通过SDS-PAGE证实了p80蛋白以包涵体形式获得了表达,将纯化后的重组p80蛋白作为包被抗原,通过方阵滴定优化反应条件,建立了检测BVDV血清抗体的间接ELISA方法。特异性试验结果显示,该方法与BVDV阳性血清反应呈阳性,而与牛传染性鼻气管炎病毒、牛副流感病毒3型、牛呼吸道合胞体病毒、口蹄疫病毒及猪瘟病毒等常见病原的阳性血清无交叉反应,特异性较强。敏感性试验结果显示本实验建立的间接ELISA方法在阳性血清11 280倍稀释时检测结果仍呈阳性,而病毒中和试验结果显示该阳性血清稀释度在1512时检测结果就已为阴性,表明该方法的敏感性较高。重复性试验结果显示批内批间变异系数均小于10%,表明该方法重复性较好。采用本实验建立的方法与病毒中和试验同时检测90份牛血清,结果显示二者的符合率为95%。利用本研究建立的间接ELISA方法对188份采自国内两个不同地区的牛血清样品进行了检测,检出BVDV阳性血清162份,阳性血清检出率为86.2%。本研究建立的检测BVDV血清抗体的间接ELISA方法可用于国内BVDV的血清流行病学调查,为相关疫病的防控提供技术支持。     

检测猪脑心肌炎病毒重组非结构蛋白2C间接ELISA方法的建立

以猪脑心肌炎病毒(Encephalomyocarditis virus,EMCV)重组非结构蛋白2C作为包被抗原,确定间接ELISA反应的最佳工作条件;通过病毒阻断试验和交叉试验检验方法的特异性;通过与血清中和试验比较,确定方法的敏感性;通过对试验感染猪的血清2C抗体产生动态的检测,分析建立方法用于EMCV感染早期诊断的意义。结果显示,建立的间接ELISA方法能够特异地检出EMCV感染猪的血清2C抗体,与猪瘟病毒(CSFV)、伪狂犬病病毒(PRV)、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)等的抗血清没有交叉反应;与血清中和试验检测结果的符合率为95.7%(22/23),相对敏感性为90.9%(10/11);仔猪感染EMCV后第4天,应用建立的间接ELISA方法即能够检出血清中的特异性2C抗体。结果表明,建立了可以替代血清中和试验的基于EMCV重组非结构蛋白2C的间接ELISA方法。     

猪细小病毒间接ELISA抗体检测方法的建立与应用

为建立一种敏感、特异、高通量的猪细小病毒抗体检测方法,参照猪细小病毒(PPV)VP2蛋白的基因序列设计合成1对特异性引物,PCR扩增了VP2蛋白主要抗原区域,将目的片段克隆至p ET30a原核表达载体中,获得了以可溶形式表达的重组VP2蛋白,重组蛋白纯化后,经免疫印迹检测显示具有良好的抗原性;以纯化蛋白为包被抗原,经间接ELISA反应条件的优化,建立了检测PPV抗体的间接ELISA方法。结果表明:用该方法检测猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒(PRRSV)、猪圆环病毒2型(PCV-2)、猪伪狂犬病毒(PRV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)阳性血清,结果均为阴性;批内重复性试验的变异系数小于5%,批间重复性试验的变异系数小于10%;与血凝抑制试验(HI)方法的符合率为94.49%;应用该方法检测869份疫苗免疫猪血清样品,免疫合格率为87.92%;检测248份未免疫疫苗猪血清样品,阳性感染率为7.25%。     

牛轮状病毒重组VP7蛋白抗原间接ELISA诊断方法的建立

以纯化的原核表达的牛轮状病毒VP7蛋白为包被抗原,建立了检测牛轮状病毒抗体的间接ELISA诊断方法。特异性试验表明,该抗原与其他5种常见牛病病毒(IBRV、BCV、BRSV、ETEC、Cj)的阳性血清无交叉反应,板内和板间重复性试验的变异系数均小于10%;对来自不同牛场的血清样本检测结果显示,该检测方法与病毒中和试验检测结果符合率达87.2%。本试验建立的ELISA诊断方法具有良好的重复性、敏感性和特异性,为BRV的快速诊断、免疫牛群血清抗体监测及轮状病毒流行病学调查提供了一种快速、简便的血清学诊断方法。     

塞内卡病毒A(SVA) VP1间接ELISA抗体检测方法的建立及应用

为建立快速检测塞内卡病毒A (Senecavirus A,SVA)血清学方法,以纯化的重组VP1蛋白作为包被抗原,建立了SVA VP1间接ELISA抗体检测方法。结果表明,VP1蛋白以包涵体形式表达,纯化后的蛋白经Western blot鉴定具有较好的反应原性。该ELISA检测方法阴、阳性临界值为0.278,与口蹄疫病毒(FMDV)、脑心肌炎病毒(EMCV)、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪瘟病毒(CSFV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)和猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)等猪常见病原阳性血清均无交叉反应,具有良好的特异性。批内和批间重复性试验的变异系数均小于13%,表明该方法重复性和稳定性均较好。相比于血清中和试验(SN),该方法的相对敏感性为98.0%,两种方法的符合率为84%。用该方法对来自山东、广东省的8个猪场的276份血清进行检测,阳性率为22.1%。SVA VP1间接ELISA抗体检测法可作为一种快速、简便的血清学诊断方法,用于猪群SVA感染监测和流行病学初步调查。     

PEDV流行株重组截短N蛋白间接ELISA检测方法的建立

为了建立猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)抗体检测的间接ELISA方法,本研究以纯化的原核表达的PEDV截短N蛋白作为包被抗原,建立了PEDV抗体检测的间接ELISA方法,将该方法命名为rnPED-ELISA。该抗原不与其他常见的7种猪病的阳性血清发生交叉反应,批内和批间重复性试验的变异系数均小于13%;rnPED-ELISA相对于血清中和试验(SN)试验的敏感性为93.33%,特异性为90.00%;rnPED-ELISA与TSZ全病毒抗体检测试剂盒的符合率达91.67%。采用rnPED-ELISA方法检测200份临床样品,PEDV抗体阳性检出率为69.5%。本试验建立的rnPED-ELISA方法具有良好的敏感性和特异性,可为免疫猪群抗体监测和猪流行性腹泻流行病学调查提供一种快速、简便的血清学诊断方法。     

基因C型鸭甲肝病毒竞争ELISA抗体检测方法的建立

为建立检测基因C型鸭甲肝病毒(DHAV-C)血清抗体的方法,本研究以纯化的DHAV-C作为包被抗原,抗DHAV-C单克隆抗体(MAb)5E3-9与待检血清竞争结合抗原,采用方阵法确定包被抗原、MAb及待检血清的最佳工作浓度,经过对反应条件的优化,建立了DHAV-C抗体的竞争ELISA检测方法。该方法仅对DHAV-C血清检测为阳性,与DHAV-A、鸭圆环病毒、鸭乙型肝炎病毒等相关病原的鸭阳性血清无交叉反应。敏感性试验表明,标准阳性血清1:128倍稀释时,检测结果仍为阳性,比中和试验灵敏性更高。批内批间变异系数分别为4.64%~5.21%和6.02%~8.68%,具有良好的重复性。与中和试验比较,阳性符合率为100%(15/15),阴性符合率为77.8%(14/18)。本研究基于纯化的DHAV-C及其特异性MAb建立的MAb竞争ELISA检测方法可以用于DHAV-C流行病学调查以及抗体的检测。     

猪血凝性脑脊髓炎病毒抗体间接ELISA检测方法的建立及山东省猪血清抗体检测分析

首先应用血凝抑制试验(HI)对从山东省部分地区采集的178份猪血清样品进行了猪血凝性脑脊髓炎病毒(HEV)抗体检测。结果显示,这些猪群中HEV的HI抗体总体阳性率高达61.24%(109/178),说明HEV的感染较为普遍。同时,以纯化的病毒作为包被抗原,通过优化反应条件,成功建立了HEV抗体间接酶联免疫吸附试验(ELISA)检测方法。应用该ELISA方法对从山东地区猪血清中随机抽取的44份样品进行检测,结果显示,HEV抗体阳性率为72.73%(32/44);而HI抗体阳性率为56.82%(25/44)。两种检测方法的阳性符合率为92.00%。结果表明,建立的ELISA方法较HI方法敏感性高。     

牛支原体P48蛋白及其片段的表达、纯化及间接ELISA检测方法的建立

为了建立一种快速、特异、敏感的检测牛支原体血清抗体的方法,对牛支原体(M.bovis)P48膜蛋白基因进行密码子优化,并在编码基因两端加入酶切位点。利用生物学软件对P48蛋白进行抗原位点和亲水性分析,选择P48蛋白的主要抗原表位区和亲水性区域以及全基因进行原核表达。采用SDS-PAGE和Western blot对重组蛋白进行鉴定及反应原性分析。结果显示,表达的P48全蛋白、28～185、221～455位氨基酸区域蛋白均能与牛支原体阳性血清发生特异性反应,P48(221～455)效果最好。采用Ni-NTA对目的蛋白进行纯化,并基于纯化的P48(221～455)蛋白建立了一种间接ELISA检测方法。该方法组内及组间变异系数均小于7%,重复性较好。临床样本检测结果表明,建立的检测方法符合率较高。     

人工感染鸭源新城疫病毒对绍鸭β-防御素和细胞因子基因表达的影响

试验旨在探讨人工感染鸭源新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)对绍鸭β-防御素(avianβ-defensins,AvBDs)和细胞因子基因表达的影响。选用45只20日龄SPF绍鸭,随机分为攻毒组(27只)和对照组(18只),攻毒组采用滴鼻点眼的途径(108.38 EID50)接种鸭源NDV强毒株(Md/CH/LGD/1/2005),对照组接种磷酸盐缓冲液。在攻毒后24和48h,从对照组及攻毒组各随机取6只鸭屠宰,分别采集肾脏、肺脏、气管、腺胃、骨髓、脾脏、盲肠扁桃体、哈德氏腺、法氏囊9个组织,运用实时荧光定量PCR法检测组织样品中9种AvBDs和细胞因子的表达量;剩余鸭每天持续观察,每隔4d采血1次,直至24d,检测血清抗体水平;于攻毒后24、48、72和120h采集咽喉及泄殖腔拭子,以确定排毒周期。结果表明,感染该NDV毒株后,鸭没有临床发病症状和死亡情况发生;感染后鸭排毒开始于攻毒后第1天,到第5天停止,在攻毒组咽喉及泄殖腔拭子中均检测到NDV。抗体水平检测结果显示,该NDV能够诱导鸭体内产生抗NDV特异抗体。实时荧光定量PCR结果发现,与对照组相比,感染后24h,部分鸭组织中AvBD1、AvBD2、AvBD5、AvBD6、AvBD9和AvBD16表达量均显著升高(P<0.05);感染后48h,AvBD1和AvBD6在部分鸭组织中表达量均显著上调(P<0.05);感染后48h法氏囊中白细胞介素6(IL-6)和脾脏中干扰素γ(IFN-γ)的表达量明显低于感染后24h的表达量。综上所述,该鸭源NDV毒株感染可诱导绍鸭体内在早期产生天然免疫反应,这些反应可能与病毒在机体内复制有关。     

进口白羽肉种鸡J亚群禽白血病病毒的全基因组序列分析

为研究引起我国部分地区进口白羽肉种鸡发生禽白血病疫情的病毒来源及其变异趋势,本研究对从进口白羽肉种鸡分离的8株J亚群禽白血病病毒(ALV-J)的全基因组序列进行测序分析。8株ALV-Jgp85氨基酸遗传演化分析显示,其与ALV-J肉鸡分离株(包括ALV-J原型病毒株HPRS-103、美国肉鸡ALV-J分离株、国内肉鸡分离株)及蛋鸡分离株氨基酸序列同源性均低于92.5%,而与国内2014年父母代白羽肉种鸡ALV-J分离株GD14J2同源性较高,为93.5%~95.1%,处于同一分支。8株ALV-J的3'非编码区(3'UTR)在rTM区缺失203bp,DR-1区缺失7bp,E元件位置缺失125bp,仅保留了22个碱基,这一缺失特征与GD14J2一致。8株ALV-J的3'LTRU3区序列与ALV-J肉鸡分离株及蛋鸡分离株的相应基因序列同源性均低于91.5%,而与GD14J2病毒株的同源性较高,为94.3%~96.3%。序列分析发现U3区存在连续11bp缺失和164位碱基突变(C/T),该突变形成2个新的转录调控元件AIBREP1、AIBREP2。综合gp85、3'UTR和U3区序列特征,推测引起本次进口白羽肉种鸡禽白血病的ALV-J与国内2014年父母代白羽肉种鸡ALV-J分离株GD14J2为同一来源。但本次分离到的ALV-J病毒株也有新的变异趋势,这些变异是否与ALV-J致病性相关,还需进一步研究。本研究为ALV-J有效防控和净化提供数据支持。     

牛副流感病毒3型感染MDBK细胞后影响天然免疫基因表达的筛选与验证

为筛选与验证牛副流感病毒3型(BPIV3)感染MDBK细胞后天然免疫相关基因的差异表达变化,通过细胞病变观察、Western blot验证病毒HN蛋白表达,以及病毒增殖复制动力学曲线,确定病毒复制情况。利用转录组测序技术,对1MOI基因C型SD2014BPIV3毒株感染MDBK细胞的12h对照组与感染组的差异表达基因进行筛选,最后收集BPIV3感染MDBK不同时间点细胞样本,应用RT-qPCR在转录水平验证了天然免疫相关显著差异基因的表达变化情况。结果表明,BPIV3毒株在MDBK细胞上有较强的复制能力,从病毒感染12h的转录组数据中获得了1 401个显著差异基因,经过筛选获得了9个与天然免疫相关的基因,最后在转录水平验证了MDA5、IRF7、STAT1、ISG65、TRIM25等9个与天然免疫相关基因的表达变化,并验证了其上、下游通路或同一家族基因的表达变化。结果表明,筛选与验证的BPIV3感染MDBK细胞差异表达天然免疫相关基因,为宿主细胞影响病毒复制的分子机制研究奠定了基础。     

长春狐狸、貉和家兔养殖场十二指肠贾第虫基因型分析

为了解长春地区狐狸、貉和家兔养殖场的十二指肠贾第虫感染情况,基于十二指肠贾第虫GDH基因位点分别设计2对引物,对养殖场的120份狐狸粪便样品、60份貉粪便样品和148份家兔粪便样品十二指肠贾第虫进行检测和基因型分析。结果表明,在来自狐狸的粪便中检测出阳性样品44份,阳性率为36.7%,基因型均为基因亚型AI;6份貉阳性样品,阳性率为10.0%,基因型均为集聚体D;41份家兔阳性样品,阳性率为27.7%,其中4份是集聚体B,其他是集聚体A中的基因亚型AI。结果发现在长春地区貉感染贾第虫集聚体D,长春地区的狐狸感染人兽共患型的集聚体A,家兔感染人兽共患型的集聚体A和B。研究结果为该地区十二指肠贾第虫病的防控提供了参考。     

进口白羽肉种鸡禽白血病疫情鉴定

2018年以来,某进口品种肉种鸡发生疑似禽白血病病例,流行范围广,危害严重,为确定该次疫情的病原,本研究从辽宁、山东等地发病鸡场采集55份疑似禽白血病病料样品。病理组织切片观察显示,病料样品肝脏和脾脏均有髓细胞样肿瘤细胞增生。针对禽白血病病毒(ALV)、鸡马立克氏病病毒(MDV)和网状内皮组织增生症病毒(REV)的特异性PCR检测结果显示,55份病料样品中ALV阳性样品12份(21.8%),MDV阳性样品1份(1.82%),REV均为阴性。将12份ALV阳性病料样品经处理后接种DF-1细胞进行病毒分离,ELISA检测结果显示有8份ALV群特异性抗原阳性。ALV多重PCR检测结果表明,8个分离株均为J亚群ALV(ALV-J),测序结果显示,8个分离株之间核苷酸序列同源性为99.5%~100%,与A、B、C、D、E亚群ALV的同源性仅为56.5%~58.8%,与ALV-J的同源性为90.7%~96.6%,进一步表明所有分离株均为ALV-J。上述结果表明,引起该次进口白羽父母代肉种鸡发生禽白血病的病原主要以ALV-J为主,该研究结果为疫情的溯源和有效防控奠定了基础。     

益生菌对青年鸽生长、免疫和抗氧化性能及繁殖相关基因表达的影响

本试验旨在研究丁酸梭菌和乳酸菌对青年鸽生长性能、血清免疫指标和生化指标、肝脏抗氧化指标及与繁殖相关基因表达的影响。选取80日龄左右的雌性青年鸽384只,将其随机分成4组,每组6个重复,每个重复16只。其中A组饲喂基础饲粮,B、C和D组分别在基础饲粮中添加1×10^8CFU/kg丁酸梭菌、5×10^9CFU/kg乳酸菌和5×10^9CFU/kg乳酸菌+1×10^8CFU/kg丁酸梭菌。预试期7d,试验期28d。结果表明:1)与A组相比,B、C和D组青年鸽的平均日增重分别提高了22.0%、32.0%和22.0%,但差异不显著(P>0.05)。2)与A组相比,C和D组青年鸽血清中的免疫球蛋白M(IgM)含量显著提高(P<0.05),各组间血清中免疫球蛋白A(IgA)和免疫球蛋白G(IgG)含量差异不显著(P>0.05)。3)与A组相比,D组青年鸽血清中的总胆固醇(TC)含量显著降低(P<0.05),B、C和D组血清中的甘油三酯(TG)含量均显著下降(P<0.05)。4)与A组相比,B、C和D组青年鸽肝脏中的过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH Px)活性均显著提高(P<0.05),C和D组青年鸽肝脏中的超氧化物歧化酶(SOD)活性和总抗氧化能力(T AOC)显著提高(P<0.05),D组青年鸽肝脏中的丙二醛(MDA)含量显著降低(P<0.05)。5)与A组相比,C和D组青年鸽卵巢中的骨形态发生蛋白15(BMP15)、促卵泡素受体(FSHR)基因表达水平显著提高(P<0.05)。综上所述,在饲粮中添加丁酸梭菌和乳酸菌能够提高青年鸽肝脏抗氧化功能并增强机体免疫力,促进新陈代谢,从而提高青年鸽的生长性能,对青年鸽的繁殖潜力也起到促进作用。     

伪狂犬病病毒UL56蛋白与宿主蛋白Nedd4相互作用的研究

伪狂犬病病毒(PRV)UL56蛋白(pUL56)属于Ⅱ型膜蛋白。近期研究结果表明PRVpUL56与PRV对啮齿动物的致病性相关。为揭示PRVpUL56与宿主相互作用的分子基础,本研究通过免疫共沉淀(Co-IP)试验确定了pUL56与神经前体细胞表达的发育下调蛋白4(Nedd4)存在相互作用。进一步,利用激光共聚焦试验确定过表达pUL56与Nedd4在转染HEK293T细胞的高尔基体存在共定位。通过互作,pUL56可以将细胞质分布的Nedd4重新定位于高尔基体。前期研究表明,含有WW结构域的宿主蛋白可以与含有PPxY(PY)基序的病毒蛋白互作。因此,本研究构建了pUL56PY基序丙氨酸突变体(PPxY/AAxY),利用Co-IP试验对pUL56突变体和Nedd4相互作用进行验证,结果表明随着pUL56PY基序突变的增加,蛋白互作能力逐渐减弱。此外,pUL56通过其PY基序显著下调Nedd4的表达。这些结果证实了PRVpUL56与Nedd4主要通过WW结构域/PY基序模式发挥相互作用,并下调Nedd4的表达。因此,本研究为阐明PRVpUL56与宿主相互作用的分子机制提供了参考依据。     

猪细小病毒7型SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测方法的建立及临床样品的检测

采用PCR方法扩增猪细小病毒7型(PPV7)衣壳蛋白基因保守区域493 bp,将其克隆到pMD18-T载体,构建重组质粒作为标准阳性质粒,以其为模板建立用于检测PPV7的SYBR GreenⅠ实时PCR检测方法,并验证其灵敏性、特异性和重复性。结果表明,本试验建立的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法在2.85×10^1~2.85×10^8拷贝/μL呈良好的线性关系,相关系数为0.995,斜率为4.158,灵敏度可达到2.85×10^1拷贝/μL。该方法对于猪繁殖障碍性传染病常见病原如PRRSV、PCV2和PRV未出现特异性扩增,表明特异性好。所有标准曲线在溶解温度为83.103℃时出现单一的特异峰。使用本方法检测了2017年山东地区7家养猪场216份临床样品,总阳性率为12.5%。     

凝结芽孢杆菌的应用现状

凝结芽孢杆菌是一类可以形成芽孢的产乳酸细菌,凝结芽孢杆菌活菌制剂进入胃肠道系统后,以芽孢的形式存在,对胃酸有很强的抵抗力,不易失活,在胃肠道系统中可以很好的发挥其生物学特性。因此,凝结芽孢杆菌作为一种益生菌类饲料添加剂被广泛应用到实际生产中。本文综述了饲用凝结芽孢杆菌制剂在断奶仔猪、肉鸡和水产动物方面的应用现状,为进一步开发应用凝结芽孢杆菌制剂提供参考。