用于活体成像裸鼠肺癌肿瘤模型的建立

本研究构建1株能够稳定表达荧光素酶的人肺癌细胞,并进行生物学特性鉴定及体内成瘤情况验证。将携带有萤火虫荧光素酶基因的pGL4.50质粒转入A549细胞中,利用G418一直加压筛选出能够表达荧光素酶的阳性细胞克隆,并对阳性细胞克隆进行稳定性和体外活体成像检测。测定A549-luc细胞和A549细胞的生长曲线、迁移、侵袭及细胞周期,确定转染前后细胞生物学特性变化。为检测A549-luc细胞在体内成瘤和发光情况,建立裸鼠皮下荷瘤模型并应用小动物活体成像系统观察。结果表明,通过G418一直加压筛选和荧光素酶活性检测,筛选出2株荧光素酶活性高的克隆Clone20和Clone28,并连续传至40代,每5代检测1次荧光素酶活性,最终保留荧光素酶活性和稳定性最高的Clone28,Clone28通过体外活体成像检测显示生物发光值与细胞数目呈正相关的线性关系(R2=0.994 8)。A549-luc细胞和A549细胞具有相似的生长特性、迁移和侵袭能力以及细胞周期。成功建立了裸鼠皮下荷瘤模型,其发光强度与肿瘤体积呈正相关的线性关系(R2=0.971 5)。本研究稳定表达荧光素酶的人肺癌细胞的构建并成功建立裸鼠皮下荷瘤模型,可通过活体生物成像系统动态监测肿瘤的变化。     

携带Apoptin及hTERT启动子的双重特异性重组腺病毒的构建及鉴定

从质粒pMT-E1a和pIRES-neo中获得目的基因E1a和PolyA并连接入质粒pKS-hTERTp,用XhoⅠ和SpeⅠ双酶切后连接入线性化的pAd-Apoptin,获得穿梭载体pAd-apoptin-PolyA-hTERTp-E1a。穿梭载体pAd-ApoptinPolyA-hTERTp-E1a和腺病毒骨架质粒(pAd5)共转染HEK293细胞,获得重组腺病毒Ad-Apoptin-hTERTp-E1a,采用RT-PCR和Western blot对重组腺病毒进行鉴定,MTS法检测病毒对A549细胞的抑制作用;绘制重组腺病毒生长曲线,监测重组腺病毒在细胞内的复制能力。结果显示:构建出的重组腺病毒中包含有了目的基因Apoptin和E1a,并且目的基因在细胞中正确的表达;MTS结果显示重组腺病毒对A549具有抑制作用,且抑制作用具有一定的时效及剂效关系;重组腺病毒具有在A549细胞中正常复制的能力。结果表明:成功的构建出了具有特异性杀伤和特异性复制能力的双重特异性重组腺病毒Ad-Apoptin-hTERTp-E1a。     

牛支原体P48蛋白及其片段的表达、纯化及间接ELISA检测方法的建立

为了建立一种快速、特异、敏感的检测牛支原体血清抗体的方法,对牛支原体(M.bovis)P48膜蛋白基因进行密码子优化,并在编码基因两端加入酶切位点。利用生物学软件对P48蛋白进行抗原位点和亲水性分析,选择P48蛋白的主要抗原表位区和亲水性区域以及全基因进行原核表达。采用SDS-PAGE和Western blot对重组蛋白进行鉴定及反应原性分析。结果显示,表达的P48全蛋白、28～185、221～455位氨基酸区域蛋白均能与牛支原体阳性血清发生特异性反应,P48(221～455)效果最好。采用Ni-NTA对目的蛋白进行纯化,并基于纯化的P48(221～455)蛋白建立了一种间接ELISA检测方法。该方法组内及组间变异系数均小于7%,重复性较好。临床样本检测结果表明,建立的检测方法符合率较高。