非洲猪瘟病毒p72蛋白原核表达及单克隆抗体制备

【目的】表达与纯化非洲猪瘟病毒(African swine fever virus, ASFV)p72蛋白,并制备其单克隆抗体。【方法】构建原核表达载体pET-28b-p72,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞并进行诱导表达和蛋白纯化;用纯化后的p72蛋白免疫BALB/c小鼠,将免疫小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞进行细胞融合并制备单克隆抗体,通过间接ELISA法和亚克隆筛选出分泌抗体的阳性杂交瘤细胞;通过小鼠抗体类型检测试剂盒检测抗体类型;通过体内诱生法制备抗ASFV p72蛋白的单克隆抗体腹水,使用饱和硫酸铵沉淀法进行抗体纯化,通过间接ELISA法、间接免疫荧光试验(IFA)和Western blotting检测单克隆抗体效价和特异性。【结果】ASFV p72重组蛋白在大肠杆菌中以包涵体形式表达,将纯化的p72蛋白制备单克隆抗体,获得4株分泌IgG1抗体的单克隆细胞株,分别命名为6F8、7C3、8H7和9G2。间接ELISA结果显示,6F8与8H7细胞株分泌的抗体效价均为1∶64 00,7C3与9G2细胞株的抗体效价均为1∶12 800,且4株细胞株分泌的抗体与p72蛋白反应结果均呈...     

非洲猪瘟病毒p17蛋白的哺乳动物细胞表达及鉴定

研究旨在利用哺乳动物细胞悬浮培养系统表达非洲猪瘟病毒(ASFV)p17蛋白,纯化并免疫小鼠,制备针对ASFV p17蛋白的特异性多克隆抗体。根据GenBank中公布的ASFV SY18毒株p17蛋白编码基因序列,设计特异性引物扩增p17基因片段,构建重组真核表达质粒pCDNA3.1-p17-strep。将其瞬时转染293i细胞,并利用下游strep标签进行蛋白纯化。纯化后的重组p17蛋白配合MnJ(β)胶体锰佐剂免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体血清。利用Western blot、间接免疫荧光试验鉴定该多克隆抗体的反应原性和特异性。结果显示：本试验成功构建pCDNA3.1-p17-strep真核表达质粒,转染293i细胞后纯化获得重组p17蛋白。免疫小鼠后制备的多克隆抗体与真核表达的p17蛋白及表达ASFV p17蛋白的猪繁殖与呼吸综合征病毒均有良好的特异性免疫反应。本试验为深入探讨ASFV p17蛋白的生物学功能奠定了基础。     

鸡IRF7原核表达及多克隆抗体制备

为了制备鸡干扰素调节因子7(interferon regulatory fator 7,IRF7)抗体,本研究通过分离鸡的外周血淋巴细胞,抽提RNA并反转录获得鸡淋巴细胞c DNA,利用聚合酶链式反应扩增获得鸡IRF7基因(ch IRF7),将该基因克隆入原核表达载体p COLD-TF中,构建成p COLD-TF-ch IRF7原核表达质粒。将测序正确的表达质粒转化入大肠杆菌BL21(DE3)感受态中,经0.25 mmol/L异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)低温诱导20 h。SDS-PAGE结果显示,融合蛋白获得高效表达,大小为107 k Da。切胶免疫BALB/c小鼠,制备鼠抗鸡IRF7多克隆抗体。激光共聚焦、Western blot实验结果显示,该抗鸡IRF7多克隆抗体能与真核质粒表达的ch IRF7蛋白发生特异性反应。该抗体的成功制备为进一步研究鸡IRF7的表达调控机制奠定了基础。     

I型鸭肝炎病毒3C蛋白的原核表达和免疫学检测

本研究采用原核表达载体p ET-32a在大肠杆菌中表达血清I型鸭甲型肝炎病毒(Duck hepatitis virus serotype I,DHV-I)SH株的3C蛋白,经超声波裂解结果显示,p ET-3C融合蛋白呈现可溶性表达。利用His-bind Resin试剂盒纯化该产物,作为免疫原免疫小鼠,制备特异性抗体进行免疫学检测。结果表明,该抗体与原核表达产物、DHV感染的SPF尿囊液总蛋白呈现特异性反应。由此可见,3C基因在大肠杆菌中可获得成功表达,制备的多抗血清可用于3C蛋白的检测。     

猪ELF4基因的克隆、蛋白表达及其多克隆抗体制备

本研究旨在克隆猪转录因子ELF4基因,体外表达ELF4蛋白并制备抗该蛋白的多克隆抗体。采用RTPCR扩增猪ELF4基因,运用生物信息学软件分析其核苷酸和编码氨基酸序列特征,将其克隆至原核表达载体pET28a,构建重组表达载体pET28a-pELF4,转化Rosetta(DE3)菌株,在不同温度、IPTG浓度、诱导时间等条件下进行诱导表达,采用SDS-PAGE和Western blot分析蛋白表达,重组pELF4蛋白(rpELF4)经纯化免疫鸡制备抗pELF4抗体。结果表明,pELF4开放阅读框为1 989bp(GenBank No.:KU097322),编码662个氨基酸,该基因与已经测定的人、牛、小鼠的ELF4的核苷酸相似性依次为89.4%、90.7%和81.1%,与牛等大动物的亲缘关系相对较近,与人和小鼠亲缘关系相对较远;结果显示,成功表达了重组蛋白pELF4,rpELF4分子量为95ku,该蛋白以可溶性和包涵体两种形式存在,在37℃条件下,以终浓度为0.8mmol·L-1IPTG诱导8h包涵体表达量达到最高。第4次免疫后第13天,鸡抗rpELF4抗体滴度达到1︰256 000倍以上。本试验利用原核表达系统成功制备了重组pELF4蛋白,并制备了免疫活性和特异性良好的鸡抗pELF4多克隆抗体,为该蛋白生物学功能及相关疾病研究提供了基础材料。     

鸡毒支原体烯醇化酶单克隆抗体研制及黏附阻断

通过对鸡毒支原体烯醇化酶的克隆和原核表达,利用表达产物免疫小鼠,制备单克隆抗体,以超声波裂解的MG全菌作为筛选抗原,结果获得了6株特异性单抗,分别命名为：1A4、2D7、2E4、2F4、384和3D8。经间接ELISA、免疫荧光试验及Western blot检测发现：1A4具有荧光效价和高滴度的ELISA效价,但无免疫印迹效价;而其他5株单抗,免疫印迹呈阳性,但无表面染色的活细胞免疫荧光。在所有6株单抗中,仅1A4单抗有MG细胞黏附抑制作用,可导致MG的黏附率降低34．40％,而且1A4与其他5种单抗混合后,则黏附率可下降57．69％。这些抗体的制备将为烯醇化酶生物学活性研究奠定基础。     

抗猪瘟病毒NS3(p80)蛋白单克隆抗体的制备及其特性鉴定

在大肠杆菌Rosetta（DE3）中表达猪瘟病毒石门株NS3基因部分功能片段,以纯化的重组NS3（p80）蛋白免疫BALB／c小鼠,取其脾细胞与骨髓瘤细胞SP2／0进行融合,经间接ELISA筛选及3次连续克隆化获得了4株可分泌抗NS3单抗的杂交瘤细胞（2G7,2F11,5D2和6F11）,通过小鼠体内诱生法制备腹水,并对杂交瘤细胞和单克隆抗体的特性进行鉴定。结果表明,杂交瘤细胞染色体正常,抗体分泌稳定,单抗效价高,亲和力各不相同,Ig亚类鉴定均为IgGl。Western blot分析证明4株单抗均能与原核表达的NS3蛋白特异性结合,6F11株与真核表达的NS3蛋白有较强的特异性反应。     

鸡Shp-Shp-2基因的克隆表达及多克隆抗体制备

Shp-2被认为与细胞生长调控及肿瘤发生密切相关。为探究鸡Shp-2在禽类疾病中所起作用,研究对鸡源Shp-2基因进行了克隆、表达及多克隆抗体制备。利用同源重组技术,将Shp-2分别插入pGEX-6P-1原核表达载体以及pcDNA3.1真核表达载体中,并获得可溶性GST-Shp-2原核融合表达产物。将纯化的GST-Shp-2蛋白免疫小鼠制备了抗GST-Shp-2多克隆抗体。间接免疫荧光试验以及Western blot分析证明制备的多克隆抗体不仅能与外源性高表达的Shp-2反应,而且也能很好地识别人、鸡及小鼠的内源性Shp-2蛋白。Shp-2表达载体的构建、表达产物及获得的小鼠多克隆抗体,为进一步研究鸡Shp-2生物学功能及其在禽类疾病中所起的作用奠定了基础。     

Ⅱ型鸡星状病毒衣壳蛋白在昆虫细胞中的表达以及多克隆抗体的制备

为构建Ⅱ型鸡星状病毒衣壳蛋白昆虫细胞表达载体,并免疫小鼠制备多克隆抗体,研究根据病毒衣壳蛋白基因序列设计引物,采用RT-PCR扩增衣壳蛋白基因全长,亚克隆至杆状病毒转移载体p Fast-Bac-HTA,经过蓝白斑筛选获得重组杆状病毒质粒r Bacmid-cap,将鉴定正确的阳性质粒转染至昆虫Sf9细胞获得重组杆状病毒。Western-blot和间接免疫荧光检测结果表明,Ⅱ型鸡星状病毒衣壳蛋白在昆虫Sf9细胞中成功表达,利用表达衣壳蛋白的昆虫细胞免疫小鼠制备的多克隆抗体血清与天然病毒也具有良好的反应性。试验结果为进一步研究鸡星状病毒衣壳蛋白的生物学功能以及病毒检测方法的建立提供了生物材料。     

猪丁型冠状病毒ns7、ns7a蛋白原核表达及多克隆抗体的制备

为获得免疫原性好的猪丁型冠状病毒(porcine deltacoronavirus, PDCoV)辅助蛋白ns7和ns7a,并制备特异性的多克隆抗体,以用于ns7和ns7a蛋白功能的初步研究,本试验构建原核表达载体pGEX-PDCoV-ns7和pGEX-PDCoV-ns7a,测序正确后转入E.coli BL21(DE3)中诱导表达。利用GST-Resin进行蛋白纯化,将获得的重组蛋白以皮下注射方式免疫BALB/c小鼠,成功制备4份PDCoV ns7和2份ns7a小鼠多克隆抗体,并用ELISA、Western blot和IFA对抗体效价、反应性及特异性进行鉴定。结果显示,本试验成功应用大肠杆菌表达了可溶性ns7和ns7a蛋白,制备的PDCoV ns7和ns7a多克隆抗体效价分别为1∶409 600和1∶12 800,并在Western blot和IFA试验中具有良好的反应性及特异性。结果表明,制备的PDCoV辅助蛋白ns7和ns7a多克隆抗体为深入研究ns7及ns7a蛋白的生物学功能提供了重要工具。     

鸡CTLA-4蛋白在昆虫细胞中的表达及其单克隆抗体的制备

旨在制备鸡细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4(CTLA-4)的特异性单克隆抗体,为家禽免疫检查点和疫苗研发提供有益制剂。利用杆状病毒表达系统体外表达鸡的CTLA-4蛋白,以其为免疫原免疫8周龄Balb/c小鼠,经B淋巴细胞融合技术制备、筛选出针对鸡CTLA-4蛋白的单克隆抗体。通过间接免疫荧光、蛋白免疫印迹、流式细胞术等方法分析抗CTLA-4单克隆抗体的生物学特性。结果显示：构建了在Sf9昆虫细胞中表达CTLA-4蛋白的重组杆状病毒,成功筛选出3株能稳定分泌抗鸡CTLA-4蛋白的单克隆抗体,分别命名为：mAb-CTLA4-3D7、mAb-CTLA4-5A4、mAb-CTLA4-6A12。亚类鉴定表明,mAb-CTLA4-3D7为IgG2a, Lambda链;mAb-CTLA4-5A4为IgG3,Kappa链;mAb-CTLA4-6A12为IgG2a, Kappa链。3株单克隆抗体均能与转染真核表达质粒pCAGGS-CTLA-4-Flag的DF-1细胞和感染重组杆状病毒rBac-CTLA-4的Sf9昆虫细胞反应。单克隆抗体mAb-CTLA4-3D7与鸡的PBMC有较好的结合活性,且能与CD3<...     

禽白血病病毒衣壳蛋白单克隆抗体研制及其双夹心ELISA的建立

为制备禽白血病病毒(ALV)核衣壳蛋白p27的单克隆抗体,本研究以原核表达的融合蛋白GST-ALV p27免疫小鼠,取其脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0进行融合,通过间接免疫荧光(IFA)和间接ELISA进行筛选,制备了5株能够稳定传代并分泌抗p27单抗的杂交瘤细胞株,分别命名为5D3、4F12、5B10、1C5和3C6,亚类鉴定3C6为IgG2b,其余为IgG1.通过IFA、Western-blot及竞争抑制ELISA,表明该5株单抗与J亚群禽白血病病毒(ALV-J)呈阳性反应,而与其他常见禽源病毒无交叉反应.利用5D3和4F12单抗建立了双抗体夹心ELISA方法,经663份临床样本验证,该方法与商品化试剂盒的符合率达到95.17％,证明所研制的针对ALV p27蛋白的单抗及建立的双抗体ELISA方法具有较高的应用价值.     

非洲猪瘟病毒p30蛋白单克隆抗体的制备与鉴定

为制备非洲猪瘟病毒(ASFV)p30蛋白的单克隆抗体,以原核表达的重组p30蛋白为免疫原免疫6～8周龄雌性BALB/c小鼠,3次免疫后分离小鼠脾细胞并将其与SP2/0细胞进行融合,通过间接ELISA方法筛选,获得2株能稳定分泌抗ASFV p30蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株。2株杂交瘤细胞从第10代开始均能稳定分泌抗体,细胞上清抗体效价均为1∶6 400。亚型鉴定结果显示,2株单克隆抗体的重链均属于IgG1,轻链均为κ型。Western blot和间接免疫荧光试验(IFA)结果显示,2株单克隆抗体均能与ASFV感染的猪肺泡巨噬细胞发生特异性反应。试验结果为p30蛋白生物学和诊断方法研究提供了技术支持。     

鸡Hsp60基因的克隆表达及多克隆抗体制备

研究对鸡Hsp60基因进行了扩增以及原核与真核表达载体构建。构建的原核表达载体GST-HSP60经IPTG诱导,SDS-PAGE分析获得了Hsp60的融合表达蛋白。采用纯化的GST-HSP60蛋白免疫小鼠制备抗Hsp60多克隆抗体。Western blot以及间接免疫荧光分析证明,所制备的抗Hsp60多克隆抗体不仅能识别转染真核表达载体pcDNA3.1-Hsp60表达的外源性鸡源Hsp60蛋白,而且能有效识别内源性鸡源以及人源的Hsp60蛋白。这些Hsp60基因表达载体的构建以及抗Hsp60蛋白特异性多克隆抗体的制备为进一步研究Hsp60生物学功能及其在家禽疫病中的潜在作用奠定了基础。     

非洲猪瘟病毒p54蛋白单克隆抗体制备及其抗原表位鉴定

旨在制备非洲猪瘟病毒(ASFV)p54蛋白的特异性单克隆抗体。本研究利用大肠杆菌表达系统表达p54蛋白,免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与SP2/0细胞进行细胞融合。利用纯化的p54蛋白作为包被抗原,采用间接ELISA方法筛选获得阳性杂交瘤细胞。经4次亚克隆后,取杂交瘤细胞上清进行单克隆抗体亚型鉴定,利用体内诱生法制备单克隆抗体并进行纯化。间接ELISA方法检测单克隆抗体的效价,利用交叉反应性试验、间接免疫荧光试验和蛋白印迹对所获单克隆抗体的特异性进行鉴定。根据预测的p54蛋白二级结构,采用逐步截短法分析鉴定单克隆抗体识别的抗原表位区域,并在p54的三级结构中进行标注。结果显示：成功筛选了6株分泌p54单克隆抗体的杂交瘤细胞,分别命名为28G12-1、31G7-1、31G7-2、35F10-1、35F10-2、38D3-1。其中28G12-1、31G7-1、31G7-2重链为IgG2a型,35F10-1、35F10-2、38D3-1重链为IgG1型;轻链均为κ链。单克隆抗体的最低效价为1∶25 600,与猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪伪狂犬病病毒、猪流行性腹泻病毒、猪细小病毒、猪急性腹泻综...     

鸡粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子的原核表达及生物学活性分析

通过PCR方法扩增不含信号肽的鸡GM-CSF成熟蛋白基因,克隆至原核表达载体pET-32a（＋）,构建原核表达质粒p32GM-CSF,通过IPTG诱导重组鸡GM-CSF蛋白表达,经镍离子亲和层析纯化后,用MTT法检测表达重组蛋白的生物学活性,并制备兔抗鸡GM-CSF多克隆抗体。结果表明成功地构建了p32GM-CSF原核表达质粒,SDS-PAGE结果显示表达的重组蛋白约34 ku,主要以包涵体形式表达,纯化后得到高纯度目的蛋白。West-ern Blot结果表明,该重组蛋白能与制备的抗鸡GM-CSF抗体特异性结合。MTT试验证实,该重组蛋白具有明显增强鸡骨髓细胞增殖的生物学活性;这些研究结果表明,表达的重组chGM-CSF蛋白及其多克隆抗体拥有相应的生物学功能,这将为进一步研究鸡GM-CSF蛋白的生物学功能及其应用奠定基础。     

旋毛虫53kuES重组蛋白单克隆抗体的制备及其免疫金标试纸条的研制

为建立一种简易、快速检测动物血清中的旋毛虫排泄分泌(Excretory-secretory,ES)抗原的胶体金免疫层析试纸法,本研究选用旋毛虫53 ku ES重组蛋白免疫BALB/c小鼠,应用杂交瘤细胞技术制备单克隆抗体(MAb).利用辛酸-饱和硫酸铵法和亲和层析柱联合法纯化MAb及兔抗旋毛虫53 ku ES多克隆抗体,利用枸橼酸三钠还原法制备的胶体金颗粒标记MAb,制备免疫金标试纸条.结果表明,获得的2株IgG1型杂交瘤细胞系4D10和5A2能够稳定分泌抗体,且效价高;胶体金标记MAb 4D10所制备的试纸条具有重复性好、灵敏性和特异性高的优点;该试纸条4℃条件下可密封保存6个月以上.     

产肠毒素大肠杆菌FaeG-mSTa-LTb-STb融合表达及其包涵体口服免疫小鼠诱导的免疫应答

为研究产肠毒素大肠杆菌(ETEC)F4菌毛主要结构蛋白Fae G、STa、LTb和STb毒素融合蛋白的免疫原性,本研究采用重叠延伸PCR(SOE-PCR)扩增编码Fae G-m STa(STa突变体)-LTb-STb 4种蛋白融合基因,将其克隆于p Pro EXHTa表达载体中进行原核表达。并以表达的包涵体口服免疫BALB/c小鼠,通过检测免疫鼠的体液和细胞免疫反应,评价其免疫效果。实验结果显示,融合蛋白在大肠杆菌中以包涵体的形式高效表达,并可以被特异性抗体所识别,具有良好的反应原性。免疫小鼠后均能够产生特异性Ig G和s Ig A,并诱导产生细胞免疫应答。免疫记忆反应试验证明,免疫鼠至少在3个月内保持对特异性抗原的免疫记忆应答。本研究结果表明,Fae G-m STa-LTb-STb融合蛋白具有良好的免疫原性,口服包涵体免疫是一种可行的免疫途径,提示所制备的融合蛋白作为口服疫苗抗原具有潜在的应用价值。     

鸡源EphrinA2基因的克隆表达及其单克隆抗体研制

研究旨在研制抗鸡EphrinA2蛋白的特异性单克隆抗体。试验用PCR和同源重组技术构建了鸡EphrinA2真核及原核表达载体,以纯化的EphrinA2原核表达产物免疫小鼠,将小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0融合,用间接ELISA方法筛选出阳性细胞克隆;用SDS-PAGE、间接免疫荧光试验和Western blot验证表达产物及单抗的特性。结果显示：原核表达的重组蛋白His-EphrinA2-RBD主要位于细菌包涵体中;获得2株能稳定分泌抗EphrinA2蛋白特异性抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为4H6和1G9;单克隆抗体4H6不仅能特异性识别真核表达载体pcDNA3.1-EphrinA2在DF-1细胞中表达的EphrinA2蛋白,而且能有效识别LMH和DF-1细胞中内源性的EphrinA2蛋白。结果表明,单克隆抗体4H6与鸡EphrinA2蛋白反应性和特异性均良好,能够应用于鸡EphrinA2相关基础研究。     

鸡PPAR-γ基因表达载体构建及抗血清制备

为构建鸡PPAR-γ基因的原核和真核表达载体并制备鸡PPAR-γ的抗血清,根据鸡PPAR-γ基因cDNA序列设计一对引物,采用RT-PCR的方法扩增鸡PPAR-γ基因的cDNA片段并将其分别插入到原核表达载体pGEX-4T-1和真核表达载体pcDNA3中;进而诱导重组原核表达载体pGEX-4T-1/PPAR-γ在大肠杆菌BL21中表达;同时利用重组真核表达载体pcDNA3/PPAR-γ免疫注射小鼠使其产生免疫应答。SDS-PAGE结果显示pGEX-4T-1/PPAR-γ在大肠杆菌BL21中得到了高效的表达。ELISA和Western blot结果表明,pcDNA3/PPAR-γ免疫小鼠产生了效价较高和特异性较强的抗体。本研究所构建的真核表达载体pcDNA3/PPAR-γ为在细胞水平上研究鸡PPAR-γ基因超表达提供了有力的工具;所获得的重组蛋白和抗血清为在蛋白水平上研究鸡PPAR-γ基因的功能奠定了基础。