悬浮MDCK细胞源与鸡胚源H9亚型禽流感疫苗免疫效力比较研究

为探讨MDCK纯悬浮细胞制备的H9亚型禽流感灭活疫苗的免疫效果,使用10日龄SPF鸡胚和MDCK纯悬浮细胞分别接种H9亚型禽流感 BX13株病毒,收获抗原液,制备2种单价油佐剂灭活疫苗,按照不同免疫剂量对21日龄SPF鸡进行免疫接种,测定免疫后不同时间的血清HI抗体,免疫后21 d翅静脉攻毒,测定疫苗的保护率。结果表明：2种疫苗分别以0.3、0.2、0.1、0.02 mL/只的剂量接种21日龄SPF鸡后,7 d HI抗体均为0log2,免后14 d、21 d时2种疫苗相同免疫剂量组间HI抗体无明显规律性差异。免疫后21 d,2种疫苗0.1mL/只～0.3mL/只的免疫剂量,各组间HI抗体水平无明显差异,可以达到1∶128以上。攻毒试验表明,鸡胚源疫苗0.1 mL/只、MDCK细胞源疫苗0.2mL/只的免疫剂量可以达到10/10保护。本研究为使用MDCK纯悬浮细胞制备的H9亚型禽流感疫苗的深化研究和应用奠定了基础。     

禽流感H9亚型油乳剂灭活疫苗的改进

用新引进的6株禽流感病毒(AIV)H9亚型和现制苗用的AIV-H9毒株分别制备AIV-H9、AIV-H5、NDV二联三价油乳剂灭活疫苗，免疫5日龄和10日龄雏鸡，于免疫当日直至80日龄鸡出栏期间定期采血，用HI法检测相应的AIV-H9、AIV-H5和NDV抗体。结果表明，10日龄免疫鸡的AIV-H9抗体效价最高，5日龄和10日龄免疫鸡的AIV-H5抗体效价差别不明显；用引进的3号AIV-H9毒株制备的联苗对10日龄雏鸡免疫后20d产生AIV-H9保护性抗体，一直持续到80日龄以上，期间的抗体平均效价为6．72(1b)，而现制苗用的AIV-H9毒株制备的联苗免疫力较差；现制苗用的A1V-H5毒株制备的联苗免疫效力仍较好；分别接种0．25、0．30mL／只联苗的雏鸡AIV-H5抗体效价没有明显差别，而AIV-H9抗体效价以接种0．30mL／只剂量的为高；不同日龄、不同免疫剂量的试验鸡NDV抗体效价没有明显差异。     

免疫鸡血清新城疫病毒抗体水平与攻毒保护效果的相关性研究

为了明确不同血清新城疫病毒(NDV)抗体水平对鸡的保护效果,本研究采用重组NDV灭活疫苗(A-Ⅶ株)对鸡进行免疫,通过交叉血凝抑制(HI)试验比较A-Ⅶ株与La Sota株间的血清学差异,并采用NDV标准强毒株F₄₈E₈和基因Ⅶ型强毒株JSC0804对不同抗体水平免疫鸡进行了攻毒保护试验。结果显示：抗A-Ⅶ株血清用A-Ⅶ株抗原测得的平均HI抗体效价显著高于La Sota株抗原(P<0.01),约高1.5log2,而抗La Sota株血清用La Sota株抗原测得的平均HI抗体效价稍高于A-Ⅶ株抗原,但无显著差异(P>0.05),表明2种疫苗株存在一定的血清学差异。在试验条件下,所有免疫鸡经点眼滴鼻攻毒后均未表现明显临床症状,但存在不同程度的排毒现象,排毒率总体上随抗体效价升高呈逐渐下降趋势。A-Ⅶ株疫苗免疫鸡血清HI抗体效价分别达≥13log₂和≥14log₂时可完全阻止F₄₈E₈株和JSC0804株排毒。免疫鸡排毒一般仅限于攻毒后5 d内。本...     

鸡传染性鼻炎(三价)和新城疫二联灭活疫苗的研究

利用Page A型、B型、C型副鸡禽杆菌和新城疫病毒La Sota株,研制鸡传染性鼻炎(三价)和新城疫二联油乳剂灭活疫苗。用3个批次疫苗进行单剂量(0.5mL/次)3次接种和大剂量(2.0mL)单次接种的安全性试验、SPF鸡的免疫效力试验、商品鸡的免疫持续期试验和疫苗的保存期试验。结果表明,3批疫苗对试验鸡安全无副作用;免疫接种SPF鸡只30d后对A、B、C型副鸡禽杆菌攻毒的保护率≥80%,用20μL/只疫苗免疫接种SPF鸡21d后新城疫的平均HI抗体24;商品鸡42日龄首免,110日龄二免,二免后9个月对A、B、C型副鸡禽杆菌攻毒的保护率≥70%,对新城疫病毒强毒100%保护;用4℃~8℃保存12个月和15个月的3批疫苗进行了SPF鸡的近期免疫效力试验,结果对A、B、C型副鸡禽杆菌攻毒的保护率≥70%,用20μL/只疫苗免疫SPF鸡,免疫接种后21d新城疫病毒的平均HI抗体24,对新城疫病毒强毒的攻毒保护率70%。说明研制的疫苗安全有效。     

鸡新城疫、禽流感（H9亚型）二联灭活疫苗的安全性和免疫效力试验

将鸡新城疫、禽流感(H9亚型,SY株)二联灭活疫苗分别以肌肉注射和皮下注射的方式单剂量、单剂量重复、超剂量分别接种28日龄SPF鸡和6月龄产蛋鸡进行安全性试验.同时,将不同剂量疫苗分别接种30日龄SPF鸡,接种后定期采血,分离血清测定HI抗体水平,并于免疫后1、2周从每组试验鸡中抽取10只攻击AIV SY株病毒.结果显示,疫苗以不同剂量接种试验鸡后未见任何不良反应,对产蛋鸡的生产性能基本无影响;试验鸡在免疫后2周即可产生较高水平的HI抗体,其中ND HI抗体几何平均值不低于1∶128,AI HI抗体几何平均值不低于1∶74,攻击AIV SY株病毒后病毒分离率为0,在免疫后20周其HI抗体仍在保护水平以上.表明鸡新城疫、禽流感(H9亚型,SY株)二联灭活疫苗安全性良好,免疫效果确实.     

H9亚型禽流感病毒HF株灭活疫苗对流行毒株的免疫保护研究

为评价H9N2亚型禽流感病毒HF株灭活疫苗对流行毒株的免疫保护效果,将禽流感病毒HF株灭活疫苗和商品化鸡新城疫、禽流感(H9亚型)二联灭活疫苗分别以0.3 mL/只接种21日龄SPF鸡,3周后采血测定HI抗体效价,并用2018年-2019年分离的4株H9亚型禽流感病毒分别进行攻毒。结果显示,免疫后21 d, HF株灭活疫苗免疫组HI抗体效价达到9.1 log2以上,商品化疫苗HI抗体效价几何平均值则为6.3 log2以内。4株H9亚型禽流感病毒流行毒株以10~(7.0)EID_(50)的剂量静脉攻毒后,HF株灭活疫苗免疫组可抵抗流行毒株的攻击,保护率为100%;而商品化疫苗对流行毒株的攻毒保护率仅为40%～60%。说明H9N2亚型禽流感病毒HF株灭活疫苗具有较强的免疫原性,能使免疫鸡抵抗流行毒株的攻击。     

禽流感灭活疫苗（H5N2亚型，D7株）与同类产品对鸭和鸡免疫后血清学比较试验

为评价禽流感灭活疫苗（H5N2亚型,D7株）与同类产品对不同日龄鸭及SPF鸡的免疫效果,将该疫苗与国内两家禽流感生产企业的2批重组禽流感灭活疫苗（H5N1亚型,Re-5株）分别免疫鸭和SPF鸡,免疫后14、21、28、42 d采血测定各免疫组的HI抗体效价。禽流感灭活疫苗（D7株）以0.25 mL剂量免疫鸭后14 d,所有免疫组鸭的HI抗体几何平均滴度（GMT）即能达到6㏒2以上,28 d HI抗体GMT达到峰值9.1㏒2,而两批重组禽流感灭活疫苗以0.5 mL剂量免疫鸭21 d后HI抗体GMT均没有达到6㏒2;两种疫苗分别免疫21日龄SPF鸡21 d后各免疫组的HI抗体GMT基本相似。试验结果表明,禽流感灭活疫苗（D7株）对鸭的免疫效果要明显优于重组禽流感灭活疫苗(Re-5株),而对鸡的免疫效果相似。     

鸡新城疫、禽流感(H9亚型)二联油乳剂灭活疫苗免疫效力试验

为评价鸡新城疫和禽流感(H9亚型,SY株)二联灭活疫苗(以下简称"二联苗")对SPF鸡的免疫保护效力,进行了血清学效力检验与靶动物免疫攻毒保护相关性的研究及免疫持续期试验。不同抗体水平的SPF鸡攻毒试验结果表明,当NDV HI≥5.0log2,AIV HI≥6.0log2时,分别攻击NDV、AIV,试验鸡的保护率均达到100%;免疫期试验结果表明,二联苗以0.3mL和0.5mL的剂量分别免疫SPF鸡,免疫接种后各试验组鸡均产生较高的HI抗体,其免疫期分别能持续18周和36周。表明二联苗对试验鸡有较好的保护效果。     

鸡新城疫病毒分离株与La Sota株灭活疫苗效力比较试验

用NDV分离株及La Sota株为抗源液，经福尔马林灭活后，与油佐剂混合，分别制成分离株灭活苗、La Sota株灭活苗及分离株与La Sota株二价灭活苗。将这三种灭活疫苗分别免疫SPF鸡后，均获得100%抵抗NDV分离株及F48株强毒攻击的保护力；而用这3种灭活苗与La Sota活苗单独或联合使用，免疫带有ND母源抗体的普通鸡后，3种灭活苗的免疫效力不同，分离株灭活苗与价灭活苗对NDV分离株攻击的免疫保护效力明显优于La Sota灭活苗；灭活苗与活苗同时使用，其免疫效力明显优于单独使用灭活苗或活苗。     

鸡新城疫、传染性支气管炎、禽流感(H9亚型)三联灭活苗(La Sota株+M41株+Re-9株)应用效果研究

鸡新城疫、传染性支气管炎、禽流感(H9亚型)三联灭活苗(La Sota株+M41株+Re-9株)(三联苗(Re-9株))为国内首个采用基因重组H9亚型禽流感疫苗株研制的新支流三联灭活疫苗。为研究疫苗上市后的实际应用效果,使用7日龄AA肉鸡和260日龄产蛋期蛋鸡评价三联苗(Re-9株)有效性。结果显示:肉鸡免疫后14 d即可激发抗体,免疫后21 d,新城疫病毒(NDV)、传染性支气管炎病毒(IBV)、H9亚型禽流感病毒(H9 AIV)的血凝抑制(HI)抗体分别达8.6log2、6.2log2、8.3log2,出栏时仍维持在较高水平;于免疫后14 d抽样进行NDV、H9 AIV攻毒,对照组均100%发病或排毒,免疫鸡均可获得100%保护;在蛋鸡上,免疫三联苗(Re-9株)后28 d,NDV、IBV、H9 AIV的HI抗体效价分别达12.0log2、7.8log2、12.2log2,免疫后6个月仍可以维持在较高水平。结果表明:三联苗(Re-9株)在实际应用中免疫效果较好,本研究将为鸡新城疫、传染性支气管炎、H9亚型禽流感的防控提供有力支撑。     

鸡新城疫、禽流感(H9亚型)二联油乳剂灭活疫苗最小免疫剂量试验

将ND-AI(H9亚型)二联苗分别以1.0、0.5、0.2、0.1、0.05、0.02 mL 6个不同剂量免疫5周龄SPF鸡,免疫后3周采血测NDV及AIV 的HI抗体,并用H9亚型AIV及NDV F48株攻击.结果表明,这6个免疫组鸡的NDV HI抗体几何平均效价分别为2 10、2 8.8、2 8.5、2 7.0、2 6.1、2 5.7;AIV HI抗体水平分别为2 9.3、2 8.4、2 7.7、2 5.7、2 5.1、2 2.8;对照组鸡的NDV及AIV HI抗体均为零.攻毒试验证实,以0.1～1.0 mL剂量免疫鸡获得了100%的抵抗NDV及AIV强毒攻击的保护力;0.02 mL和 0.05 mL的免疫剂量也可使其对NDV与AIV的保护率达到90%～100%.     

鸡新城疫-传染性法氏囊病-禽流感(H9亚型)三联灭活疫苗的研究

为研制鸡新城疫(ND)-传染性法氏囊病(IBD)-禽流感(AI,H9亚型)三联灭活疫苗,用新城疫病毒(NDV)La Sota株及H9亚型禽流感病毒(AIV)WD株分别接种易感鸡胚培养,用传染性法氏囊病病毒(IBDV)BJQ902株接种DF-1细胞培养,收获病毒液,经超滤浓缩、甲醛灭活后,加入油佐剂乳化制成3批疫苗。对3批制品进行了检验,其性状检验、装量检查、无菌检验、甲醛、汞类防腐剂残留量测定均符合要求,鸡对疫苗无任何不良反应。效力检验结果显示:ND部分以20μL/只剂量免疫,血凝抑制(HI)效价达5.6~6.1 log_2,攻毒后均能提供100%保护;IBD部分以0.5 mL/只剂量免疫,中和抗体效价达16.0~16.4 log_2,攻毒后均能提供100%保护;AI(H9亚型)部分以0.3 mL/只剂量免疫,HI效价达8.7~9.0 log_2,攻毒后均能提供100%保护。试验结果证实,研制的疫苗安全、免疫效力高。     

新城疫-禽流感(H9亚型)-禽腺病毒病(Ⅰ群,4型)三联灭活疫苗对不同日龄雏鸡的免疫效力研究

为评估新城疫-禽流感(H9亚型)-禽腺病毒病(Ⅰ群,4型)三联灭活疫苗的免疫效力,采用该疫苗分别免疫7、14、21日龄的SPF雏鸡和商品雏鸡,免疫后21 d采血测定新城疫病毒(NDV)HI、H9亚型禽流感病毒(H9 AIV)HI及禽腺病毒(FAdV)中和抗体,并用禽腺病毒(Ⅰ群,4型)强毒攻击。结果显示:免疫后各不同日龄免疫组SPF雏鸡的NDV HI、H9 AIV HI及FAdV中和抗体效价分别为8.2 log_2～8.5 log_2、8.8 log_2～9.6 log_2和9.7 log_2～10.3 log_2,FAdV攻毒保护率均达到100%(10/10);21日龄SPF鸡免疫后3个月,试验鸡NDV HI、H9 AIV HI及FAdV中和抗体分别达7.2 log_2、7.8 log_2和11.3 log_2,FAdV攻毒保护率均为100%(10/10);不同日龄免疫组普通雏鸡NDV HI、H9 AIV HI及FAdV中和抗体效价分别为6.7 log_2～7.6 log_2、7.9 log_2～8.7 log_2和9.8 log_2～10.3 log_2,FAdV攻毒保护率均达到100%(10/10)。表明该疫苗可对不同日龄SPF雏鸡和商品雏鸡产生良好的免疫力,对雏鸡免疫持续期达3个月。     

鸡新城疫、传染性支气管炎、禽流感(H9亚型)三联灭活 疫苗(La Sota株+M41株+SS/94株)免疫程序研究

设计不同的免疫程序,用鸡新城疫、传染性支气管炎、禽流感(H9亚型)三联灭活疫苗(La Sota株+M41株+SS/94株)免疫黄羽肉鸡,通过对ND、IB、H9抗体滴度监测,探讨ND、IB、H9抗体消长规律及鸡新城疫、传染性支气管炎、禽流感(H9亚型)三联灭活疫苗(La Sota株+M41株+SS/94株)的免疫程序。试验结果表明,用鸡新城疫、传染性支气管炎、禽流感(H9亚型)三联灭活疫苗(La Sota株+M41株+SS/94株)免疫黄羽肉鸡后,其诱导产生的ND、IB、H9抗体的消长规律基本同步;仅于10日龄免疫一次三联灭活苗,其抗体水平较低,于20、40日龄二免、三免或10日龄先用鸡新城疫病毒(La Sota株)、禽流感病毒(H9亚型,SS/94株)二联灭活疫苗作基础免疫,20或40日龄再用三联灭活苗作加强免疫,则上述3种抗体均快速上升,且维持时间长。根据试验结果,建议按照正常免疫程序作基础免疫的健康肉鸡,饲养期较短的可于20日龄左右用鸡新城疫、传染性支气管炎、禽流感(H9亚型)三联灭活疫苗(La Sota株+M41株+SS/94株)作加强免疫,0.3 mL/只;饲养期较长的则于40日龄左右用鸡新城疫、传染性支气管炎、禽流感(H9亚型)三联灭活疫苗(La Sota株+M41株+SS/94株)作加强免疫,0.5 mL/只。     

鸡新城疫-传染性支气管炎-禽流感(HH9亚型)-传染性法氏囊病四联灭活疫苗的研究

为研制鸡新城疫(ND)-传染性支气管炎(IB)-禽流感(AI,H9亚型)-传染性法氏囊病(IBD)四联灭活疫苗,用易感鸡胚增殖NDV La Sota株、IBV M41株及AIV H9亚型WD株,用DF-1细胞增殖IBDV BJQ902株,收获病毒液,经浓缩、灭活后,制成3批油乳剂灭活疫苗。按照《中国兽药典》对疫苗进行检验。结果显示:3批疫苗的性状检验、装量检验、无菌检验、甲醛、汞类防腐剂残留量测定和安全性检验均合格。效力检验显示:NDV血凝抑制(HI)效价为6.0～6.2 log2;IBV HI效价二免是首免的8.00～13.92倍;AIV(H9)HI效价8.8～9.1 log2;IBDV中和抗体效价15.7～16.1 log2。攻毒后免疫鸡均100%保护(10/10),对照鸡全部发病(5/5)。研究结果表明制备的四联苗安全有效、免疫效力高,为该疫苗的产业化开发提供了依据。     

鸡毒支原体对NDV La Sota株免疫应答的影响

以鸡毒支原体NB72株或和R株对鸡先行人工感染,然后,与无支原体感染的对照鸡同样接种NDV La Sota株,观察NDV免疫应答动态。结果,支原体感染鸡群血清和气管中的NDV血凝抑制抗体效价,虽然比未接种支原体的鸡群低.但二者差异不显著(P>0.05).随后,通过攻击NDV强毒,不论先前经过或未经过支原体人工感染,ND免疫鸡全部被保护,且血清中NDV HI抗体效价均大幅度升高;未经ND免疫接种的对照鸡全部发病死亡,因此,鸡毒支原体NB72株或R株感染的鸡对NDV La Sota株的免疫应答无明显改变。最后就体内试验的结果进行了讨论。     

新城疫分离株免疫保护试验

对经过鉴定的新城疫病毒(NDV)分离株，按国家兽医生物制品质量标准制备油乳剂灭活疫苗，在隔离器中接种SPF鸡，设标准La Sota疫苗株作对照，进行免疫保护实验。免疫后，每7d采血监测NDV抗体。免疫后3周，利用ND强毒分离毒和F48E。分别进行交叉攻毒实验，同时设SPF鸡对照。每天观察，及时剖检发病鸡，检察鸡群病变，以确定疫苗的保护性，以便对常规生产中的免疫失败进行原因分析。     

鸽新城疫病毒毒力致弱株的拯救及免疫原性分析

为快速获得鸽新城疫(ND)疫苗株,本研究构建了鸽NDV/Pi/CH/LHLJ/110822株反向遗传操作平台,拯救得到2株亲本病毒株r0822-21A、r0822-17A,以及1株F蛋白裂解位点突变为La Sota相应位点的病毒株r0822-FCS。HA/HI试验结果显示r0822-FCS毒力已致弱,将其灭活乳化后免疫SPF鸡可刺激其产生高滴度HI抗体。安全性评价试验结果显示其安全性良好,但接种14 d时SPF鸡的HI抗体滴度仅达3 log2,对基因Ⅶ型鸡源强毒CK/CH/HLJ/01/06攻毒保护率小于50%;免疫效力试验显示,r0822-FCS分别以10~5EID_(50)/0.1 mL、10~6EID_(50)/0.1 mL剂量接种14日龄SPF鸡,未检测到明显的抗体阳转。基因组测序分析结果显示,3株拯救病毒均在L基因的不同位置与新城疫病毒(NDV) V4株高度同源的外源基因片段重组,推测在实验条件下的细胞内拯救病毒过程中,病毒L基因与辅助质粒中的L基因发生了随机同源重组。综上所述,本研究获得的r0822-FCS株作为弱毒疫苗效果不佳,但可作为鸽ND灭活疫苗候选株。此外,本研究首次报道了反向遗传操作实验条件下,NDV基因组与V4株辅助质粒之间发生了基因重组,且L基因是决定病毒复制的关键基因。此次基因重组现象应为实验条件下的偶发事件,其机制和风险尚需后继实验研究分析。     

悬浮培养MDCK细胞制备的H9亚型禽流感灭活疫苗免疫剂量试验

为研究由悬浮培养的MDCK细胞制备的H9亚型AIV抗原所制备的灭活疫苗的免疫剂量,在生物反应器中悬浮培养MDCK细胞,接种H9亚型禽流感病毒WD98和HN04种毒,收获抗原液,以2种抗原液分别制备2个毒株的单价油佐剂灭活疫苗。每种疫苗均按照0.3、0.2、0.1、0.05mL/只(107.5 EID50/只~105.52 EID50/只)的剂量接种21日龄SPF鸡,免疫接种后3周采血测定AIV的HI抗体,采血后分别用与制苗株同源的H9亚型AIV种毒静脉注射攻毒,测定疫苗保护率。2种疫苗不同剂量免疫接种后21d的AIV HI抗体水平达到3.8log2~5.6log2,对照组鸡AIV HI抗体均为0log2。攻毒试验证实,以105.52 EID50/只~107.5 EID50/只剂量进行免疫接种,免疫鸡只获得了80%以上的保护。按照兽药典H9亚型禽流感疫苗攻毒保护率90%为合格的标准,悬浮培养MDCK细胞制备的H9亚型禽流感疫苗的最小免疫接种剂量为106.82 EID50/只。     

2株H7N9亚型重组禽流感病毒的生物学特性和免疫原性研究

为评估经反向遗传构建的H7N9亚型重组禽流感病毒(AIV)H7-Re1株和H7-Re2株的生物学特性及免疫原性,本研究将这2株病毒分别以104倍稀释接种10日龄SPF鸡胚后,36℃培养,观察鸡胚存活情况并检测病毒HA效价,结果显示96 h时,2株病毒接种的鸡胚全部存活,培养至72 h时其HA效价均为9 log2,均显著高于亲本分离株。测定2株病毒的静脉内接种致病指数(IVPI),结果显示均为0。将2株病毒分别以10~6EID_(50)剂量鼻腔内接种5周龄SPF鸡,进行致病性试验,结果显示,接种后14 d内,2株病毒接种鸡均无临床症状,也不排毒。以2株病毒为种毒分别制备油乳剂灭活疫苗,以0.3 mL/只接种3周龄SPF鸡后3周时检测免疫鸡血清中HI抗体,结果显示,两种疫苗免疫鸡平均HI效价均可达到8.0 log2。于免疫后21 d,H7-Re1株免疫组鸡分别攻击10~6EID_(50)的H7N9亚型低致病力AIV(PG/SHH/S1069/13株)和10~5EID_(50)的高致病力AIV(CK/GX/SD098/17株),进行攻毒试验,结果显示两种病毒攻毒后免疫鸡均全部存活,且无发病和排毒出现。H7-Re2株免疫组鸡于免疫后21 d分别以10~5EID_(50)的剂量进行高致病力H7N9亚型AIV(CK/GX/SD098/17株)和H7N2亚型AIV(DK/FJ/SE0195/18株)的攻毒保护试验,结果显示两种病毒攻毒后免疫鸡均不发病、不死亡、不排毒。以上结果表明,以H1N1亚型A/Puerto Rico/8/34株病毒为内部基因供体、经反向遗传学方法构建的H7-Re1株和H7-Re2株均具有生长滴度高、生物安全性高和免疫原性好的特点。本研究为H7N9亚型禽流感疫苗的研制和应用奠定了基础。