HPLC法测定芪蓝囊病饮中的靛玉红

建立了芪蓝囊病饮中靛玉红的高效液相色谱(HPLC-PDA)检查方法。采用C18(250 mm×4.6 mm×5 μm),柱温35 ℃，以乙腈-0.2%磷酸水进行梯度洗脱，波长采集范围为200~640 nm，流速为1.0 mL/min，进样量10 L，提取检测波长为289 nm。靛玉红在0.5~2.0 μg(R² =0.9991)线性关系良好，平均加样回收率90.0%(RSD=1.36%,n=6)。所建方法色谱分离较好，前处理简单，可用于芪蓝囊病饮中的靛玉红的含量测定，为完善芪蓝囊病饮的质量标准提供依据。     

复方板蓝根提取工艺与靛玉红含量测定

通过正交试验优选出复方板蓝根最佳的提取工艺,并建立反相高效液相色谱法（Reverse Phase High Performance Liquid Chromatography,RP-HPLC）测定该复方的靛玉红含量。含量测定采用外标法。结果表明不同工艺的提取方法中,加10倍水,煎煮1次,煎煮时间为2h的提取工艺,含量最高,达6.86μg/mL;HPLC法测定靛玉红,其线性范围在2.0～20.0μg/mL内靛玉红的含量与峰面积相应值呈良好的线性关系（r=0.972）,平均加样回收率为96.54%（n=6）,说明HPLC方法简便、准确、重复性好,可作为该产品质量控制方法。     

虾青素工程菌中核酸的脱除工艺研究

试验旨在探究研究红法夫酵母菌中核酸的脱除工艺,选取了核酸清除剂、核酸酶和十六烷基三甲基溴化铵（cetyltrimethylammonium bromide,CTAB）和NaCl脱除红法夫酵母菌核酸,通过检测上清液核酸脱除率、虾青素含量以及上清液与菌体PCR结果,得出核酸脱除的最佳工艺。结果显示,核酸脱除最佳工艺为：发酵液菌浓为20%,菌悬液1 mL加233μL NaCl (6 mol/L)和161μL的CTAB/NaCl,65℃搅拌30 min,该工艺核酸脱除率80%。研究表明,CTAB/NaCl方法脱除红法夫酵母菌核酸的效果最佳。     

EGM吸附ZEN对鸡外周血淋巴细胞的保护效应

吸取500μL含0.1亿个/mL鸡外周血淋巴细胞的细胞悬液,分别加入2个24孔细胞培养板的32个孔内,每4个孔为1组,共设8组:第1组为空白对照组,每孔加入500μL RPMI-1640完全培养液;第2组每孔加入500μL含10μg/mL玉米赤霉烯酮(ZEN)的培养液;第3~5组每孔分别加入500μL含0.01%、0.20%和0.30%酯化葡甘露聚糖(EGM)的培养液;第6~8组每孔分别加入500μL含0.01%、0.20%和0.30%EGM,均含10μg/mL ZEN的培养液;第2~8组ZEN质量浓度为5μg/mL;第3和6组、第4和7组及第5和8组的EGM含量分别为0.05%、0.10%和0.15%。37℃,5%CO2培养72 h后,检测培养液中白细胞介素-2(IL-2)、α干扰素(IFN-α)和丙二醛(MDA)含量,超氧化物歧化酶(SOD)活性及淋巴细胞转化率。结果表明:空白对照组、培养液中加入0.05%~0.15%EGM及培养液中加入5μg/mL ZEN和0.05%~0.15%EGM组,IL-2和IFN-α含量、SOD活性及淋巴细胞转化率均显著高于培养液中加入5μg/mL ZEN,MDA含量显著低于培养液中加入5μg/mL ZEN。培养液中加入0.10%和0.15%EGM后,IL-2和IFN-α含量显著高于空白对照组。由此表明:EGM对淋巴细胞增殖无不良影响,并能通过吸附ZEN有效地减轻ZEN对淋巴细胞的损伤。     

硫酸化酵母葡聚糖对鸡淋巴细胞的影响

为研究硫酸化酵母葡聚糖(SCG)对鸡细胞免疫的影响,将7种浓度SCG单独或与Con A、LPS加入到鸡脾脏淋巴细胞的培养体系中,培养48 h时用MTT法测定淋巴细胞增殖的变化;将5种浓度的SCG分别与Con A加入到鸡脾淋巴细胞的培养体系中,培养24 h后收集细胞培养上清液,测定IL-2和IFN-γ的含量。结果显示,SCG浓度在在250~2 000μg/m L时,SCG+Con A、SCG各剂量组随着多糖浓度的增加其A570值先增加后降低(P0.05);SCG+LPS各剂量组的A570随着多糖浓度的增加而降低,2 000μg/m L剂量组显著低于其他三组(P0.05);均具有显著的量效关系。SCG浓度在62.25~1 000μg/m L时,多糖组脾脏淋巴细胞体外培养上清液中IL-2与IFN-γ浓度,随着多糖浓度的增加其促进淋巴细胞分泌细胞因子的能力先增加后降低,具有明显量效关系;且均在250μg/m L时效果最好。结果表明,SCG在合适剂量能单独或协同Con A、LPS刺激鸡T、B淋巴细胞增殖,促进淋巴细胞分泌IL-2和IFN-γ,从而增强鸡的细胞免疫。     

BHK-21细胞中猪乙型脑炎病毒动态增殖的研究

为了研究猪乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus, JEV)在仓鼠肾细胞(BHK-21细胞)中的增殖情况，试验首先建立了实时荧光定量PCR方法，并检测该方法的敏感性、特异性和重复性，然后利用建立的实时荧光定量PCR方法和病毒半数组织感染量(TCID₅₀)方法测定并比较猪JEV在BHK-21细胞中的增殖规律。结果表明：建立的猪JEV实时荧光定量PCR检测方法的扩增效率为99.3%,敏感性、特异性和重复性良好，检测敏感性可以达到1.0×10¹ copies/μL;TCID₅₀方法测定的细胞悬液和细胞培养上清液中的病毒含量分别为1.0×10^5.44 TCID₅₀/0.1 mL和1.0×10^4.86 TCID₅₀/0.1 mL,实时荧光定量方法测定的病毒粒子数量分别为1.0×10^7.50 copies/μL和1.0×10^5.60 copies/μL,两种方法在细胞悬液中...     

H9N2亚型猪源性流感病毒在小鼠肺微血管内皮细胞内最佳增殖条件的研究

试验旨在确定H9N2亚型猪源性流感病毒(SIV)在小鼠肺微血管内皮细胞(PMVEC)中增殖的最佳条件。将PMVEC解冻、复苏、培养,取长成单层的PMVEC,在不同浓度TPCK-胰蛋白酶维持液(0.1、0.2、0.3、0.4、0.6、0.8、1.0μg/mL)、不同H9N2亚型SIV(A/swine/HeBei/012/2008/(H9N2)接种剂量(1∶10、1∶100、1∶1 000、1∶10 000、1∶100 000、1∶1 000 000和1∶10 000 000)及不同病毒吸附时间(0.5、1.0、2.0和3.0h)条件下观察PMVEC形态变化,并测定细胞上清液中H9N2亚型SIV的HA滴度。在未加病毒的情况下,低于0.6μg/mL的TPCK-胰蛋白酶对PMVEC的生长未造成任何影响,但随着TPCK-胰蛋白酶浓度的增加,PMVEC开始出现肿胀、变圆,甚至脱落;采用含有0.6μg/mL TPCK-胰蛋白酶维持液将H9N2亚型SIV稀释为不同的浓度感染PMVEC,在0.3μg/mL TPCK-胰蛋白酶维持液、10-2病毒稀释倍数感染条件下48和72h HA滴度分别为4.6log2和6.4log2;病毒吸附时间为2h且中间震荡20s的条件下H9N2HA滴度最佳。结果表明,当TPCK-胰蛋白酶维持液浓度为0.3μg/mL、病毒接种浓度为10-2、吸附时间为2h且中间震荡20s时,H9N2亚型SIV在PMVEC中增殖最佳,达到6.8log2。     

太子参参须多糖对RAW264.7细胞免疫调节作用的研究

为研究太子参参须多糖(RPFRP)对小鼠单核巨噬细胞(RAW264.7细胞)的免疫调节作用及作用机制，本研究利用MTT法检测不同浓度RPFRP作用下的RAW264.7细胞的增殖情况，筛选出RPFRP的适宜浓度为25μg/mL～400μg/m L。将25μg/mL～400μg/m L RPFRP作用于RAW264.7细胞并于不同时间后收获细胞培养物或上清液进行后续试验。采用中性红法检测不同浓度RPFRP作用下的RAW264.7细胞的吞噬活性，结果显示：RPFRP可极显著提高RAW264.7细胞吞噬活性(P<0.01)，且该吞噬活性在PRFRP浓度为25μg/mL～200μg/mL时呈剂量依赖式升高；Griess法检测RAW264.7细胞的NO产生量，结果显示：RAW264.7细胞上清液中NO含量显著升高(P<0.05)，且呈RPFRP剂量依赖式升高；ELISA法检测RAW264.7细胞的白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-1β (IL-1β)、白细胞介素-10(IL-10)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)含量，结果显示：与空白对照组相比，RPFRP处理的RAW264.7细...     

猪温病热盛证动物模型的建立

筛选猪温病发热模型的造模方法并确定临床症状评定标准。以呋塞米注射液、脂多糖(LPS)、大肠杆菌菌悬液为致模因素,采用3种不同方法进行造模,即猪耳缘静脉注射呋塞米注射液(0.05 mL/kg BW),再以LPS(0.5μg/kg BW、1.5μg/kg BW)耳缘静脉注射攻毒;猪耳缘静脉注射LPS(1.5μg/kg BW),再以大肠杆菌菌悬液(0.3 mL/kg BW、0.5 mL/kg BW)耳缘静脉注射攻毒;猪耳缘静脉注射大肠杆菌菌悬液(0.3 mL/kg BW、0.2 mL/kg BW)进行攻毒。观测猪直肠温度、呼吸、饮食、精神、呕吐等情况。结果显示,注射呋塞米注射液与不同剂量LPS未制造出猪温病的全部临床症状;同时注射LPS与不同剂量大肠杆菌菌悬液能复制出猪温病模型,但大肠杆菌菌悬液0.5 mL/kg BW剂量组动物存在死亡,且LPS与大肠杆菌菌悬液均有致热之效;注射不同剂量的大肠杆菌菌悬液,剂量为0.3 mL/kg的大肠杆菌菌悬液即能有效复制出猪温病模型。结果提示,猪按0.3 mL/kg BW的剂量,经耳缘静脉单次注射浓度为2×10⁹ cfu/mL的大肠杆...     

水栀子多糖提取物对感染猪圆环病毒2型的RAW264.7细胞氧化应激的调节作用研究

为了研究水栀子多糖提取物(Gardenia jasminoide var.radicans polysaccharide extract, GJPE)对猪圆环病毒2型(PCV-2)感染的RAW264.7细胞氧化应激的调节作用,试验采用ELISA法测定了GJPE对RAW264.7细胞的安全浓度;将RAW264.7细胞分为空白对照组、维生素C组、不同浓度(安全浓度范围)GJPE组,分别加入到96孔细胞培养板(1×10⁶ 个/mL)和24孔细胞培养板(2×10⁵ 个/mL)中,除空白对照组加基础培养基外,其他各组分别加入1×10³ TCID₅₀ PCV-2病毒液,并设置PCV-2组(只添加PCV-2病毒液)作为病毒对照组,100μL/孔(96孔细胞培养板)或500μL/孔(24孔细胞培养板),培养24 h;吸弃上清液,用PBS洗涤3遍,空白对照组和PCV-2组分别加入基础培养基,维生素C组加入200μmol/mL维生素C,不同浓度GJPE组分别加入相应浓度GJPE[100μL/孔(96孔细胞培养板)或50...     

大熊猫犬瘟热病毒（CDV-PA-1421株）微载体悬浮培养工艺研究

根据正交试验对大熊猫犬瘟热病毒(CDV-PA-1421株)在生物反应器中的培养工艺进行优化，确定关键技术参数。结果表明，大熊猫犬瘟热病毒悬浮培养最佳组合条件为：Vero细胞长成单层后，接种到生物反应器，细胞接种浓度为0.2×10⁶/mL~0.4×10⁶/mL，微载体浓度为8.0 g/L，加入MSVP培养基至工作体积。按0.01～0.1 感染复数(MOI)接种病毒，在37 ℃ pH7.2条件下培养96~120 h，细胞病变(CPE)达70%～80%时收获病毒上清液，即可获得高滴度病毒液。3批培养结果显示病毒培养工艺稳定，收获液病毒含量均在10^7.0～10^7.5 TCID50/0.1mL之间。     

红景天提取物对肉鸡外周血白细胞免疫调节作用的研究

为了研究红景天提取物对肉鸡外周血白细胞免疫调节作用的影响,试验取3只健康雄性肉鸡分离外周血白细胞,以每孔1×106/m L接种于24孔细胞培养板,然后将红景天提取物(浓度分别调整至200,100,50,0μg/m L) 200μL加入24孔细胞培养板,37℃、5%CO2条件下培养24 h,离心后收集上清液,检测上清液中细胞因子和免疫球蛋白含量。结果表明:相比于不添加红景天提取物的对照,100μg/m L、200μg/m L红景天提取物显著提高了细胞上清液中IgG和IgM含量(P0. 05)。此外,100μg/m L红景天提取物相比于对照还显著提高了细胞上清液中IL-1β含量(P 0. 05),100μg/m L、200μg/m L红景天提取物显著提高了细胞上清液中IL-6和TNF-α含量(P0. 05)。说明红景天提取物能够促进肉鸡外周血白细胞免疫球蛋白和细胞因子的产生,改善肉鸡的免疫机能,但在100μg/m L内存在剂量依赖性。     

牛磺鹅去氧胆酸对小鼠机体cAMP和cGMP含量的影响

为了研究牛磺鹅去氧胆酸(TCDCA)对小鼠机体环磷酸腺苷(cAMP)和环磷酸鸟苷(cGMP)含量的影响,试验用环孢菌素A诱导特异性免疫低下模型,按相应组别对应的剂量对小鼠灌胃给药7 d,获取血清;体外培养正常小鼠腹腔巨噬细胞,用MTT方法筛选TCDCA作用于腹腔巨噬细胞的最佳药物浓度;用最佳药物浓度作用于巨噬细胞后超声破碎,获取上清液;ELISA方法测定血清和上清液中cAMP和cGMP的含量。结果表明:在TCDCA高剂量(0.2 g/kg)组小鼠血清中,cAMP含量极显著高于环孢菌素A组(P<0.01);各组小鼠血清cGMP含量差异不显著(P>0.05);TCDCA促进小鼠腹腔巨噬细胞增殖的体外浓度为1μg/mL、2.5μg/mL、5μg/mL、10μg/mL;1μg/mL、2.5μg/mL、5μg/mL的TCDCA均能显著或极显著提高细胞内cAMP含量(P<0.05或P<0.01),对cGMP含量均没有显著影响。说明TC-DCA能够显著提高正常和免疫抑制小鼠血清中和正常腹腔巨噬细胞内cAMP含量。     

应用CCK8法检测鸡淋巴细胞活性的检测最佳条件研究

为了研究应用CCK-8法检测鸡淋巴细胞增殖的体外培养最佳条件,试验设置了不同种板细胞数、血清浓度、培养时间、孵育时间和检测波长等条件对其进行比较研究。结果表明:1 750 r/min转速的改良鸡外周血淋巴细胞分离方法效果最佳;在体外增殖培养试验中,CCK-8加样4 h后在450 nm波长处检测OD值最理想,培养时间以44 h为最佳;在细胞数量一致的情况下,胎牛血清浓度为5%或者为10%差异不显著(P0.05)。当细胞悬液浓度为1×10~6个/m L时,加入100,50,25,12.5μL不同细胞数,4组间比较均差异显著(P0.05),并且随着细胞悬液浓度的增加OD值增加;最佳铺板细胞的细胞悬液浓度为2.0×10~6~3.0×10~6个/m L,取50~100μL为宜,即最佳细胞铺板数量控制在每孔1.5×10~5~2.0×10~5个/100μL。说明应用CCK-8法检测鸡外周血淋巴细胞活性的最佳条件除种板细胞数不同外,在检测波长、血清浓度、加样后孵化时间等方面与其他动物试验差别不大。     

Gln对肉鸡黏膜屏障的调控作用研究

研究了不同浓度的谷氨酰胺(Gln)对肉仔鸡淋巴细胞增殖活性的影响,以确定Gln抑制淋巴细胞增殖的调控作用,将阐明Gln调控应激条件下肉仔鸡肠道黏膜屏障的调控作用,为Gln营养改善肠道健康状态提供理论依据。从肉仔鸡空肠分离出淋巴细胞,制得细胞悬液,在Gln终浓度分别为0、10、50、100、200μg/m L的200μL培养体系中培养24 h,然后加入LPS刺激,用MTT法测定淋巴细胞的OD值,计算刺激指数。结果表明,Gln可显著改善淋巴细胞增殖,当Gln浓度为50μg/m L时,与其他组相比肉仔鸡肠道淋巴细胞中MDA显著提高(P0.05);当Gln浓度为50μg/m L时,与其他组相比肉仔鸡肠道淋巴细胞中CAT显著提高(P0.01);当Gln浓度改变时对GSH-Px无明显作用。当Gln浓度范围超过50μg/m L后,其对肉仔鸡肠道淋巴细胞的增殖活性抑制效果最为明显,有利于维持免疫系统的平衡状态,并且对CAT和MDA活性有明显改善作用,有利于动物机体的抗氧化。     

银黄可溶性粉体外抗血清4型Ⅰ群禽腺病毒的试验研究

为探讨银黄可溶性粉体外抗血清4型Ⅰ群禽腺病毒(FAdV-4)的活性,应用MTT法与CPE法测定银黄可溶性粉对LMH细胞贴壁和单层生长的最大安全浓度,研究其对病毒增殖抑制、感染阻断和直接灭活的作用效果。结果显示,银黄可溶性粉对LMH细胞最大安全浓度为156.25μg/mL,在安全浓度范围内,加药组LMH细胞贴壁和细胞单层形成与细胞对照组无显著差异(P0.05)。156.25μg/mL银黄可溶性粉体外抗FAdV-4效果最好,病毒增殖抑制、病毒感染阻断和直接灭活试验的细胞存活率分别为96.1%、122.0%、99.7%,病毒抑制率分别为91.5%、143.8%、99.3%,均显著高于病毒对照组(P0.05)。此外,78.13μg/mL和156.25μg/mL的银黄可溶性粉体在病毒感染阻断试验中具有促进细胞生长作用。本研究为银黄可溶性粉用于因FAdV-4引起的鸡心包积液综合征的临床治疗提供理论依据。     

有机硒与无机硒对奶牛体外瘤胃发酵特性的影响

本试验主要研究有机硒和无机硒对奶牛体外瘤胃发酵特性的影响。试验按照3×4二因子完全随机试验设计,其中无机硒源为亚硒酸钠(SS),有机硒源为硒代蛋氨酸(SM)和酵母硒(SY),硒浓度分别为0μg/mL、0.1μg/mL、0.2μg/mL和0.3μg/mL 4个剂量,共12个处理组,0剂量为对照组。各处理组均进行3h、6h、9h、12h和24h的体外批次培养,每个处理组设3个重复。试验结果表明,与无机硒源SS相比,有机硒源SM和SY可显著增加发酵24h体外培养液中的BCP浓度(P=0.000 6),尤以SY最好;体外培养液中添加0.3μg/mL硒,可显著提高氨氮(NH_3-N)、菌体蛋白(BCP)、硒、乙酸、丙酸、丁酸和总挥发性脂肪酸(TVFA)的浓度(P 0.05),并显著降低乙酸丙酸比(P 0.05),且添加0.1μg/mL和0.2μg/mL的硒也具有一定的促进作用;不同的硒源对体外培养液中的pH、NH_3-N、硒、乙酸、丙酸、丁酸、TVFA浓度以及乙酸丙酸比均无显著影响(P 0.05),但SY组的pH有下降趋势,NH_3-N、BCP、乙酸、丙酸、丁酸、TVFA浓度有升高趋势。说明适宜浓度的硒可促进奶牛的体外瘤胃发酵,且当硒源为SY、添加剂量为0.3μg/mL时,促进效果较好。     

三七皂苷S-6的溶血性及体外免疫活性研究

研究三七皂苷S-6的溶血性及体外免疫活性。常规方法提取PNS,大孔树脂柱层析分离纯化得S-6。溶血试验测定红细胞溶血率。脾淋巴细胞毒性试验确定S-6的安全剂量范围,体外脾淋巴细胞增殖反应和IL-2的诱生及含量测定检测S-6的体外免疫活性。S-6溶血性较小,2 mg/mL浓度以下无溶血性;S-6(0.1μg/mL、1μg/mL)显著促进了ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞增殖反应,且与PNS和APS组相比,差异不显著;S-6(1μg/mL)极显著地促进了LPS诱导的小鼠脾淋巴细胞增殖反应,且与PNS相比,S-6(1μg/mL)差异显著,其余各个剂量与PNS和APS组相比,差异不显著;S-6(12.5μg/mL、25μg/mL、50μg/mL)显著或极显著地提高了IL-2的含量,且与PNS和APS组相比,差异不显著。S-6安全性好,体外具有较好的细胞免疫活性和诱生细胞因子的能力。     

山羊地方性鼻内肿瘤病毒MAb的制备及间接ELISA方法的建立

为建立检测山羊地方性鼻内肿瘤病毒(ENTV-2)的间接ELISA方法，本研究以纯化的ENTV-2免疫BALB/c小鼠，采用间接ELISA方法筛选阳性细胞克隆，经3次克隆纯化后获得1株能够稳定分泌ENTV-2特异性单克隆抗体(MAb)的细胞株，命名为6E4，并采用鼠MAb亚类鉴定试剂盒鉴定6E4 MAb的亚类，结果显示，MAb 6E4的亚类为κ链、Ig G1亚型。进一步以6E4为检测抗体，经各反应条件的优化建立了检测鼻液样品中ENTV-2的间接ELISA方法，该方法的临界值为0.323。利用该方法 检测羊口疮病毒(ORFV)、绵羊肺炎支原体(Movi)、丝状支原体山羊亚种(Mmc)以及纯化的ENTV-2和ENTV-2患病羊鼻液样品，结果显示，除纯化的ENTV-2及ENTV-2患病羊鼻液样品的检测结果呈阳性外，ORFV、Movi、Mmc的检测结果均为阴性，该方法特异性较强。将纯化的ENTV-2 (以蛋白浓度换算) 2倍倍比稀释(20μg/mL～0.08μg/mL)后，利用建立的间接ELISA方法检测，结果显示，纯化的ENTV-2稀释至0.3125μg/mL时检测结果仍可判定为阳性，该方法敏...     

华蟾毒精对小鼠树突状细胞分泌功能的影响

为了调查华蟾毒精(CBG)对树突状细胞分泌功能的影响,采用小鼠粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-NSF)和IL-4体外联合诱导培养小鼠骨髓细胞,获得树突状细胞(DCs)。经免疫磁珠分选法纯化获取CDllc+树突状细胞。试验组CDllc+树突状细胞中加入不同浓度CBG,空白对照组加等量RPMI-1640,阳性对照组加LPS。作用48 h后,采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测培养上清液中细胞因子IL-12p70、IL-10及IL-1β含量。结果表明:在适量浓度10⁵0μg/mL范围内,CBG均以剂量依赖的方式上调DCs分泌IL-12p70和IL-1β水平,下调IL-10的分泌水平。说明CBG能够通过调控DCs分泌Th1、Th2型细胞因子的分泌,来诱导Th1型细胞免疫应答。