携肠球菌Ace抗原的铁蛋白纳米粒制备与免疫效果检测

为制备携肠球菌胶原蛋白黏附素Ace抗原表位的铁蛋白纳米颗粒,并评价其免疫效果,利用生物信息学软件预测Ace抗原表位,合成相应的基因片段,分别构建含有相应抗原表位基因与铁蛋白H亚基基因的融合表达载体,同时构建融合表达Ace蛋白和H亚基的质粒pET-32a-ace-H,分别转入大肠杆菌中进行融合表达。利用Western blot鉴定各重组融合蛋白的反应原性,并利用透射电镜观察目的蛋白表征。用重组铁蛋白纳米颗粒分别制备免疫原进行家兔接种试验,并定期检测家兔血清特异性抗体水平。结果显示,正确构建了6个Ace蛋白抗原表位基因与H亚基基因的融合表达载体pET-32a-ace1-H～pET-32a-ace6-H,其中pET-32a-ace1-H、pET-32a-ace3-H、pET-32a-ace5-H和pET-32a-ace6-H为可溶性表达载体。Western blot检测显示可溶性表达的4种融合蛋白均具有较好的反应原性。透射电镜图像显示,4种融合蛋白均形成了具有中空结构的铁蛋白纳米笼,其直径与天然铁蛋白类似;而融合蛋白Ace-H纳米笼没有中空结构,且直径比天然铁蛋白大。家兔免疫试验结果显示,6种融合蛋白均在家兔体内诱导产生了特异性抗体,而且,携带单个Ace表位的铁蛋白纳米颗粒Ace1-H、Ace3-H、 Ace5-H与携带多表位的Ace重组蛋白以及Ace-H纳米颗粒相比,其诱导的抗体效价和消长规律均一致,其中以铁蛋白纳米粒Ace5-H的免疫效果为最佳。本研究结果表明铁蛋白纳米颗粒能有效增强蛋白质抗原的免疫原性,有望作为候选表位疫苗佐剂得到应用。     

副猪嗜血杆菌hhdA克隆、抗原表位预测和表达

根据Gen Bank中的副猪嗜血杆菌hhd A的基因序列,设计并合成l对特异性引物,对从江西分离的HPS的hhd A基因进行扩增、克隆、测序、生物信息学分析和原核表达。测序结果表明,扩增的目的基因大小为1 797bp,共编码氨基酸599个氨基酸。与Gen Bank上公布的ZJ0906株(CP005384.1)中对应的核苷酸序列同源性为99.8%,氨基酸同源性99.6%。生物信息学分析表明,HPS hhd A蛋白是一种混合型结构蛋白,含有α-螺旋、β-折叠、β转角和无规则卷曲;综合柔性区域、亲水性位点、抗原指数和表面可能位点预测了hhd A蛋白可能的B细胞抗原表位的优势表位。将目的基因转入原核表达载体p ET-32a(+)构建重组原核表达质粒p ET-32a(+)-hhd A,将重组质粒转化到BL21(DE3)中,进行IPTG诱导表达,经过SDS-PAGE电泳结果显示表达的融合蛋白约80 k D。为进一步研究HPS hhd A生物学功能及抗体制备和开发hhd A基因工程产品奠定了基础。     

T7噬菌体p10融合蛋白表达及自组装VLP观察

原核表达T7噬菌体p10融合蛋白,PCR扩增p10基因并在基因下游连接口蹄疫病毒(FMDV)VP1抗原表位基因;将融合基因插入p ET-28a载体,构建重组质粒;用IPTG诱导重组菌表达目标蛋白,通过电镜观察病毒样颗粒(VLP)的形成。结果成功构建了p ET-p10-VP1表达菌株。SDS-PAGE、Western-blot检测显示目标蛋白高效表达并与VP1特异性抗体产生免疫反应。回收p10-VP1蛋白样品经透射电镜观察,有40 nm VLP生成。表明T7噬菌体p10蛋白具有良好的VLP自组装功能,并可用于抗原表位的表面展示。     

T7噬菌体p10融合蛋白表达及自组装VLP观察

原核表达T7噬菌体p10融合蛋白,PCR扩增p10基因并在基因下游连接口蹄疫病毒(FMDV)VP1抗原表位基因;将融合基因插入p ET-28a载体,构建重组质粒;用IPTG诱导重组菌表达目标蛋白,通过电镜观察病毒样颗粒(VLP)的形成。结果成功构建了p ET-p10-VP1表达菌株。SDS-PAGE、Western-blot检测显示目标蛋白高效表达并与VP1特异性抗体产生免疫反应。回收p10-VP1蛋白样品经透射电镜观察,有40 nm VLP生成。表明T7噬菌体p10蛋白具有良好的VLP自组装功能,并可用于抗原表位的表面展示。     

绵羊肺炎支原体多表位融合基因MO-meAg1的构建、表达及重组蛋白免疫原性分析

为获得具有良好免疫原性的绵羊肺炎支原体(MO)重组蛋白,利用ABCpred等软件预测分析MO EF-P、PDHA、P97相似蛋白和EF-Ts蛋白的优势线性抗原表位,构建多表位融合基因MO-meAg1,合成后将其亚克隆至表达载体pET-32a(+),构建原核表达载体pET-32a(+)-MO-meAg1。将pET-32a(+)-MOmeAg1转化至感受态细胞E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达后检测重组蛋白反应原性和免疫原性。SDSPAGE结果显示,MO-meAg1重组蛋白分子质量约34.5ku;Western blot分析结果显示,该重组蛋白可被MO阳性血清特异性识别,具有良好的反应原性。小鼠免疫试验结果表明,重组蛋白MO-meAg1具有较强的免疫原性,诱导机体产生的抗血清其间接血凝效价可达1∶128以上。获得的多表位融合蛋白MO-meAg1为绵羊支原体肺炎的免疫学诊断及新型疫苗研究奠定基础。     

犬埃立克体多表位融合抗原蛋白的免疫学特性研究

【目的】构建和制备具有较强抗原性的犬埃立克体(Ehrlichia canis)重组蛋白并研究其免疫学特性。【方法】利用ABCpred等在线软件预测分析犬埃立克体gp19、gp140和gp200等蛋白的优势线性抗原表位,构建多表位融合抗原基因E.canis-megp19及E.canis-megp-1,经PCR扩增后将其克隆至表达载体pET-32a(+)中,构建原核表达载体pET-32a(+)-E.canis-megp19和pET-32a(+)-E.canis-megp-1,经EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切鉴定正确后转化至感受态细胞大肠杆菌BL21 (DE3)中,优化表达条件(IPTG诱导浓度、温度及时间),表达重组蛋白后检测其免疫原性。【结果】成功构建并合成了多表位融合抗原基因E.canis-megp19和E.canis-megp-1,其PCR产物在1.5%琼脂糖凝胶电泳后分别出现大小为414和429bp的片段;重组载体pET-32a(+)-E.canis-megp19和pET-32a(+)-E.canis-megp-1双酶切后得到了预期长度的目标片段;SDS-PAGE结果显示,当加入1.0mmol/L IPTG、37℃诱导8h后,E.canis-megp19及E.canis-megp-1重组蛋白均可大量表达,其分子质量分别为38和39ku;Western blot分析显示,该重组蛋白可被犬埃立克体阳性血清特异性识别,证实其具有良好的反应原性;小鼠免疫试验表明,该重组蛋白可诱导机体产生特异性抗体。【结论】制备的多表位融合重组蛋白能够高效地在大肠杆菌中表达且能够诱导机体产生特异性抗体。     

兔出血症病毒VP60主要抗原表位的原核表达及其免疫原性

[目的]研究兔出血症病毒（RHDV）VP60主要抗原表位基因原核表达蛋白的免疫原性。[方法]采用RT-PCR方法扩增了RHDV衣壳蛋白VP60主要抗原表位基因。以pET-28b（＋）为表达载体,在E.coliRosetta菌株中表达重组蛋白。通过Western blot分析和接种家兔检测了重组蛋白的免疫原性。[结果]经Western blot检测,在相对分子量24.0k Da处出现特异性的反应带。以纯化的重组蛋白制备的抗血清可以与纯化的RHDV发生特异性的ELISA反应。[结论]RHDV VP60主要抗原表位的原核表达产物具有较好的免疫原性。     

鸭坦布苏病毒囊膜蛋白抗原表位的串联表达与抗原性分析

在对鸭坦布苏病毒囊膜蛋白抗原表位分析的基础上,将已经筛选出的8条抗原性良好的多肽采用柔性肽拼接,转入T载体中。将酶切回收的串联基因(命名为TEM)克隆于表达载体p ET32a中,获得重组表达质粒p ET32a-TEM,将该质粒转化于感受态细胞BL21(DE3)中,经IPTG诱导后进行超声裂解,对融合蛋白进行可溶性分析、Western blotting分析和免疫原性分析。重组质粒p ET32a-TEM的酶切和测序结果表明,TEM串联基因已成功插入到p ET32a原核表达载体中;表达的p ET32a-TEM融合蛋白分子质量约为38 000,以包涵体形式存在。Western blotting和小鼠免疫试验结果显示,p ET32a-TEM融合蛋白与鸭坦布苏病毒阳性血清能发生特异性反应,具有良好的抗原性。串联多肽的成功表达,将为鸭坦布苏病血清学检测方法建立、新型工程疫苗的研发奠定基础。     

猪伪狂犬病毒gD蛋白抗原表位的克隆及表达

依据Gen Bank中猪伪狂犬病毒(PRV)BJ/YT株gD基因设计引物,扩增gD蛋白抗原表位,其设计扩增长度为702 bp,将扩增片段克隆到p MD19-T载体获得p MD19-T-gD。利用Bam HⅠ和HindⅢ限制性内切酶双酶切p MD19-T-gD质粒,进行琼脂糖凝胶电泳并回收酶切片段,将回收片段与原核表达载体p ET-28a连接,成功构建了p ET-28a-gD表达载体。将表达载体转化感受态细胞Rosetta,IPTG诱导表达后,进行SDS–PAGE电泳,结果显示,在25 ku处出现特异性蛋白质条带。Western blot分析结果表明,表达产物能够被PRV的阳性血清识别。综上,成功克隆并表达了gD蛋白抗原表位,且其表达产物具有较好的生物学活性。     

猪源铁蛋白重链亚基纳米粒的制备

根据Gen Bank公布的铁蛋白重链基因序列,设计出1对特异性引物;提取猪心脏总RNA,采用RT-PCR方法扩增出铁蛋白重链亚基基因片段,经测序正确后,再将双酶切的纯化产物与PET32a原核表达载体相连接,构建重组质粒、把测序正确的重组质粒转化入大肠杆菌BL21(DE3),用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)进行诱导表达。将表达的重组蛋白用Ni~+离子亲和层析柱纯化后,用SDS-PAGE和Western blot鉴定纯化的表达产物。将鉴定正确的铁蛋白产物置于透射电镜下观察其表征,以进一步鉴定铁蛋白纳米颗粒是否自组装成功。结果表明,本研究成功表达并纯化出了猪源铁蛋白重链亚基,而透射电镜下观察到了大量直径为10~13 nm的颗粒,说明重组猪源铁蛋白重链纳米粒自组装成功。     

副溶血性弧菌外膜蛋白K的多表位串联表达研究

[目的]设计和表达Omp K蛋白的多表位串联肽,综合评价其免疫效应。[方法]构建重组表达质粒p ET-32a-repis并进行原核表达,使用Ni-NTA纯化介质对表达产物进行纯化得到重组多表位串联肽(r EPIS),以r EPIS为免疫原免疫昆明小鼠,对r EPIS进行免疫原性和免疫保护性研究,Western-blot分析r EPIS的免疫反应性。[结果]r EPIS具有良好的免疫原性,能够刺激机体产生较高水平抗体,并且能够保护90%的昆明小鼠抵抗10LD50副溶血性弧菌的感染,具有良好的免疫保护效应,Western-blot结果显示重组r EPIS能够与免疫后鼠血清进行特异性结合,具有良好的免疫反应性。[结论]该研究制备的重组r EPIS具有良好的免疫特性,为副溶血弧菌多表位疫苗的研究奠定了物质基础。     

猪伪狂犬病毒gB和gC蛋白B细胞表位编码序列的融合表达及活性测定

依据猪伪狂犬病毒g B和g C蛋白的B细胞表位编码序列,分别设计g B和g C蛋白B细胞表位编码序列的融合扩增引物,利用融合PCR技术,将g B和g C蛋白B细胞表位编码序列有机地融合为g B-C表位编码序列。将融合基因片段插入到原核表达载体p ET28a,并转化大肠杆菌BL21(DE3),1.0 mmol/L异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达重组蛋白。SDS-PAGE结果显示,融合蛋白g B-C能够高效表达,重组蛋白的分子质量约为38 ku;经Western blot鉴定分析,小鼠抗His标签单克隆抗体和PRV阳性血清均能识别表达的重组蛋白。表明成功表达了融合蛋白g B-C,且表达的重组蛋白具有较好的免疫学活性。     

犬细小病毒VP2主要抗原表位区的原核表达载体构建及诱导表达

利用PCR扩增CPV-2bVP2蛋白的主要抗原表位区基因,并将该基因片段克隆到原核表达载体pGEX-6P-1上,通过诱导表达条件的摸索,实现了VP2蛋白主要抗原表位区在大肠杆菌中的高效表达,sDs—PAGE检测表达的融合蛋白主要以可溶形式存在,并利用亲和层析得到融合蛋白。     

虎源猫泛白细胞减少症病毒VP2基因主要抗原表位区的原核表达和蛋白纯化

利用PCR技术从FPV-HLJ株病毒细胞培养物中扩增VP2基因主要抗原表位区片段VP2’。扩增片段克隆至pMD18-T载体,经核苷酸序列测定确认后,亚克隆于pGEX-6p-1原核表达载体,构建pGEX-6p-VP2’重组原核表达质粒。将该质粒转化至表达菌BL21(DE3)中用IPTG进行诱导表达。表达蛋白采用切胶法纯化,并用SDS-PAGE和Westernblot检测纯化蛋白纯度和抗原特异性。结果表明,VP2基因全长1200bp,编码400个氨基酸。重组菌可表达相对分子量约为66kD的融合蛋白,包括目的蛋白40kD和GST标签26kD。该蛋白以包涵体形式存在,且GST融合蛋白具有良好抗原特异性。     

利用E.coli表达系统制备猪细小病毒NS1抗原表位区蛋白的研究

为通过E.coli表达系统制备猪细小病毒NS1抗原表位区蛋白,本试验利用DNAstar软件确定含有抗原表位的NS1蛋白片段,然后运用PCR方法从含有NS1基因的载体中扩增NS1抗原表位区基因片段,并将该基因片段插入到原核表达载体pGEX-4T-1中,构建成与GST标签融合的NS1抗原表位基因的表达载体pGEX-GST-NS1,将表达载体转化BL21大肠杆菌筛选出工程菌。经IPTG诱导表达NS1融合蛋白,经GST-琼脂糖凝胶磁珠分离纯化,制备出与GST融合的NS1抗原表位蛋白。经SDS-PAGE以及Western blot鉴定,制备的NS1融合蛋白分子量和预期一致,并且可以和抗GST标签抗体进行特异反应,表明NS1抗原蛋白已成功制备,为下一步NS1抗体的研制提供了必要的条件。     

HAV表位抗原与HBV核心抗原融合基因的原核表达

为探讨甲肝DNA疫苗的可行性,利用DNA重组技术将甲肝病毒（HAV）复合多表位抗原基因VPx插入到乙肝病毒核心抗原（HBcAg）基因中,得到CVPx融合基因。将CVPx克隆到原核表达载体pET-28a（＋）中,并在大肠杆菌中进行表达,表达的蛋白进行Western Blot及ELISA检测,结果表明：融合蛋白具有甲肝病毒表位抗原的反应原性。     

绵羊痘病毒多表位基因的构建及原核表达

通过计算机软件筛选出绵羊痘病毒基因组中心编码区的ORF90核蛋白、ORF112融合蛋白、ORF117糖蛋白、ORF55膜蛋白和基因组末端的ORF134宿主范围相关基因的6段T、B细胞优势抗原表位,以柔性氨基酸(GPGPG)作为接头,串联合成1条全新的多表位嵌合基因mE,将其克隆到原核表达载体pET-32中,采用酶切分析与序列测定方法筛选鉴定阳性重组质粒,构建pET32-mE质粒;用IPTG在不同条件下诱导表达,确定最佳表达条件,表达产物经SDS-PAGE分析。结果表明,重组蛋白是分子质量为41ku的融合蛋白。在IPTG浓度为0.5mmol/L,温度为37℃、诱导4h时目的蛋白的表达量最大,约占菌体的32%。Western-blotting试验表明,目的蛋白可被羊痘血清识别。     

猪圆环病毒2型ORF1和ORF3 T淋巴细胞抗原表位的克隆与原核表达

根据Stevenson筛选出来的3个具有活性的T淋巴细胞抗原表位(T lymphocyte epitope,TCE)合成tce基因(180 bp),成功插入到pMD18-T Simple载体中,筛选获得重组质粒,命名为pMD-TCE.将tce酶切产物亚克隆到原核表达载体pET-32a(+)中,获得重组质粒,命名为pET-TCE.用IPTG进行诱导表达,收集菌液进行SDS-PAGE检测,结果显示合成基因在pET-32a(+)中获得了高效融合表达,其表达蛋白相对分子质量约为25 000,Western-blot分析结果表明,获得的融合蛋白可与猪圆环病毒2型(PCV2)阳性血清发生特异性反应,具有良好的免疫原性.     

新城疫病毒F蛋白结构域基因原核表达与抗原表位分析

以含新城疫病毒(NDV)融合蛋白(F)基因的重组质粒为模板,设计特异引物进行重叠-延伸PCR扩增获得F基因的抗原结构域基因片段Fa、Fb和Fa-l-Fb,经SalⅠ和NotⅠ酶切后,定向插入原核表达载体pGEX-6P-1,获得重组质粒pGEX-Fa、pGEX-Fb和pGEX-Fa-l-Fb;用定点突变方法获得重组质粒pGEX-Fa-mut.将重组质粒转化大肠杆菌BL21,转化菌经IPTG诱导、提取表达产物进行蛋白电泳和免疫印迹分析.结果表明:Fa-mut、Fb和Fa-l-Fb结构域基因均获得了融合表达,表达产物与NDV阳性血清具有免疫反应性;与pGEX-Fa-mut不同,pGEX-Fa重组质粒在大肠杆菌中未能表达,且转化菌在IPTG诱导过程中未见生长,提示未经突变的Fa片段可能为毒性蛋白.三维结构预测结果显示,目的蛋白片段中均保留F蛋白中原有相应的抗原表位.     

H7亚型禽流感病毒HA基因的原核表达及表达产物的反应原性分析

为构建新型H7亚型禽流感HA基因的原核表达载体,并在大肠杆菌中进行表达。从NCBI数据库下载H7亚型禽流感HA全基因序列,合成HA基因;定向克隆到原核表达载体p ET-32a(+)的多克隆位点中,构建重组原核表达质粒p ET-32a(+)-HA;转化入大肠杆菌BL21(DE3)中经IPTG诱导表达,表达产物经SDS-PAGE和Western-blot法鉴定。结果显示,重组质粒经双酶切及基因测序鉴定构建正确;重组的HA融合蛋白约为84 ku,大小与预期融合蛋白大小一致;重组HA融合蛋白可以与His标签单克隆抗体特异性结合,与H7阳性血清有较强的反应原性。成功构建了HA基因原核表达载体,并在大肠杆菌BL21(DE3)中获得重组HA融合蛋白表达。