猪肺炎支原体和猪鼻支原体在屠宰猪呼吸道与血液中的分布

用PCR方法对从湖南省长沙市515头屠宰猪收集的1 204份样品(120份猪鼻拭子、254份猪支气管拭子、515份猪支气管肺泡灌洗液和235份猪肺、80份血液)进行了猪肺炎支原体和猪鼻支原体检测,并对部分PCR产物进行序列分析。结果发现,猪肺炎支原体在猪支气管灌洗液中检出率最高(23.3%,120/515),猪鼻拭子和血液中检出率最低(0);猪鼻支原体在猪鼻拭子中检出率最高(24.3%,125/515),在猪支气管拭子中检出率最低(2.5%,3/120)。序列分析表明:试验的PCR产物与国内已出版的相关序列有97%~100%的同源性。试验探明了猪肺炎支原体和猪鼻支原体在猪呼吸道与血液中的分布情况,为这两种支原体的分离鉴定提供了依据。     

巢式PCR检测猪鼻支原体方法的建立及应用

应用巢式聚合酶链式反应(Nested PCR)建立了一种检测猪鼻支原体(Mycoplasmah yorhinis)的方法,试验中以酚-氯仿法制备模板DNA,根据猪鼻支原体P37序列高度保守区设计2对引物,建立Nested PCR诊断方法.在特异性检测试验中,设计的引物不能扩增出猪絮状支原体、猪滑液支原体、猪肺炎支原体、鸡毒支原体、胸膜肺炎放线杆菌、猪瘟病毒、猪流感病毒、猪圆环病毒及猪繁殖与呼吸综合征病毒等病原体;敏感性试验表明,第1次PCR和第2次PCR的敏感度分别为3.01 mg/L和3.01×10-4mg/L.对41份临床样品肺组织的检测中,普通PCR和巢式PCR的检出率分别为29.3％(12/41)和82.9％(34/41).结果表明,巢式PCR方法明显优于常规PCR方法,具有较高的敏感性和实用性,为猪鼻支原体的检测提供了一种新型、可靠的诊断技术.     

规模化猪场肺炎支原体、鼻支原体与蓝耳病病毒感染情况调查

[目的]为分析猪肺炎支原体(MHP)、猪鼻支原体(MHR)与猪蓝耳病病毒(PRRSV)在临床感染中的相互关系。[方法]对从山东省规模化猪场收集的213份疑似病料进行PRRSV、MHP和MHR的检测,结合猪场的免疫背景对结果进行分析。[结果]发现在猪肺炎支原体免疫猪场,猪肺炎支原体感染比例显著降低,而在猪肺炎支原体非免疫猪场,猪鼻支原体与猪肺炎支原体、猪蓝耳病病毒的混合感染率极高。无论在肺炎支原体免疫场还是非免疫场,猪蓝耳病病毒与猪鼻支原体的混合感染率,都超过了猪蓝耳病病毒与猪肺炎支原体的混合感染率。[结论]PRRSV与MHP和MHR之间有着密切的关系,除猪肺炎支原体外,猪鼻支原体目前已成为危害养猪业的又一重要因素。     

猪肺炎支原体和猪鼻支原体双重荧光定量PCR检测方法的建立

建立同时检测猪肺炎支原体和猪鼻支原体的双重荧光定量PCR方法。根据猪肺炎支原体P97序列和猪鼻支原体P37序列的特异性引物,分别标记FAM和Texas Red荧光报告基团的2条TaqMan探针,建立和优化双重实时荧光定量PCR反应条件和体系,同时检测其敏感性、特异性和重复性。建立的双重荧光定量PCR对猪肺炎支原体和猪鼻支原体的最低检测值均为10copies·μL-1;与猪源致病菌、病毒和其他常见细菌均无交叉反应;各浓度标准品的Ct值变异系数小于5%,重复性好。检测72份临床样本,其中猪肺炎支原体的肺阳性率为80%,鼻拭子阳性率22%,支气管肺泡灌洗液阳性率58.33%;猪鼻支原体的肺阳性率为40%,鼻拭子阳性率66%,支气管肺泡灌洗液阳性率41.67%。建立的双重荧光定量PCR方法比普通PCR更加敏感,实用性强,可用于临床样品的检测。该方法能同时快速和定量地检测猪肺炎支原体和猪鼻支原体,在短时间内获得样品的多个信息,快速地解决了多次检测所需的时间以及经济消耗,为猪肺炎支原体和猪鼻支原体的监测和防控提供了新型、可靠的检测技术。     

湖南省部分地区屠宰猪猪肺炎支原体感染率调查

用PCR方法对来源于湖南省株洲市、益阳市、长沙市、岳阳市、邵阳市、衡阳市等6个地区部分规模猪场的322份屠宰猪肺样品进行猪肺炎支原体检测。结果发现,猪肺炎支原体在该地普遍存在,检出率分别为:株洲市19.2%(11/57),益阳市18.1%(8/44),长沙市20.0%(13/65),岳阳市17.5%(7/40),邵阳市23.2%(13/56),衡阳市25.0%(15/60)。序列分析表明,试验的PCR产物与国内已出版的相关序列分别有98%~100%的同源性。试验结果证实了猪肺炎支原体在湖南省规模化猪场不同程度存在,对湖南省防控猪支原体肺炎提供了数据参考。     

猪鼻支原体抗血清的制备与鉴定

猪鼻支原体(Mycoplasma hyrhinis,Mhr)是猪鼻腔的常在菌。将猪鼻支原体与弗氏佐剂共乳化,免疫新西兰大白兔,获得猪鼻支原体兔抗血清。Western blotting检测其特异性;建立间接ELISA方法检测其抗体效价;将获得的猪鼻支原体兔抗血清分别加入猪鼻支原体和猪肺炎支原体培养物中,进行生长抑制试验。结果显示,制备的猪鼻支原体兔抗血清与猪鼻支原体具有反应原性;抗体效价达1:160 000以上;猪鼻支原体兔抗血清可以显著抑制猪鼻支原体的生长,而对猪肺炎支原体的生长影响较小。本试验结果为鉴定和检测猪鼻支原体提供了方法,也为猪肺炎支原体的分离提供了参考。     

猪肺炎支原体检测芯片的研制及初步应用

本研究探索建立一种新的基因芯片方法检测和鉴定猪肺炎支原体。在猪肺炎支原体的16SrRNA、P36和P463个基因内设计3个靶基因片段,用PCR标记Cy3探针,建立了用于检测和鉴定猪肺炎支原体的检测芯片。试验结果显示,猪肺炎支原体与检测芯片的3个靶基因（Mhp-16S、Mhp-P46和Mhp-P36）杂交呈阳性,猪鼻支原体只与Mhp-16S靶基因杂交呈阳性,其它所测细菌和病毒不与检测芯片的靶基因杂交。检测芯片的检测灵敏度和PCR相同,能达到10pg基因组DNA／50μL标记体系或反应体系。用检测芯片鉴定了3株疑似猪肺炎支原体临床分离株,结果有2株为猪肺炎支原体,1株为其它猪支原体。用检测芯片、P36-PCR和分离鉴定分别对45头病猪临床样品选择混合培养物中的猪肺炎支原体进行了检测,结果它们的检出率分别为20％（9／45）、22．2％（10／45）和8．9％（4／45）。检测芯片还检出有26．7％（12／45）的病猪感染了其它猪支原体。试验结果表明,所建立的检测芯片是一种快速检测和鉴定猪肺炎支原体的敏感特异性方法。     

2018—2019年我国部分地区猪肺炎支原体多位点序列分型

为了解我国猪肺炎支原体种群结构和进化关系，2018—2019年采集山东、广西、河南、江西、云南、天津、湖南等地猪组织样品1 242份，进行猪肺炎支原体荧光定量PCR和巢式PCR检测，并对测序确认的87份阳性样品，采用adk、rpoB、tpiA 3个管家基因作为分型参考进行多位点序列分型（MLST），并对3个管家基因均扩增成功的阳性样品进行p146基因分型，分析我国猪肺炎支原体种群结构，并结合pubmlst数据库公布的151个序列类型（ST）进行eBURST分析。结果显示：有24份阳性样品的3个管家基因全部扩增且测序成功，共分为10个ST，均为国内外首次报道；10个ST分为3个克隆复合体（CC）和4个独特型，其中ST128占41.7%（10/24），样品来自江苏、河南和广西，为本次检测的主要流行型。结果表明，我国猪肺炎支原体分布较广，具有一定的基因型独特性。本研究为我国猪肺炎支原体的流行病学数据库研究提供了新资料，有助于掌握国内猪肺炎支原体基因型分布情况，进一步完善了猪肺炎支原体流行病学数据库。     

猪鼻支原体TaqMan MGB探针荧光定量PCR方法的建立

为建立快速检测猪鼻支原体(M.hyorhinis)的荧光定量PCR方法,本研究根据GenBank中登录的p37基因序列设计并合成引物及MGB探针,构建含有p37基因的重组质粒,以其为标准品绘制标准曲线,并检测该方法的特异性、敏感性和重复性.结果显示该方法具有良好的特异性,与猪肺炎支原体、猪絮状支原体、猪滑液支原体、鸡毒支原体、副猪嗜血杆菌、猪胸膜肺炎放线杆菌、猪圆环病毒、猪瘟病毒及猪流感病毒无交叉反应,对M.hyorhinis的检测敏感性为10拷贝/μL,并且稳定性好,变异系数小于2％.利用建立的荧光定量PCR方法对55份临床样品进行检测,阳性检出率为87.3％(48/55),而分离培养方法和普通PCR的阳性检出率分别为41.8％(23/55)和29.1％ (16/55).该结果表明,建立的方法特异性强、敏感性高、稳定性好,可以用于M.hyorhinis临床样品的检测,对M.hyorhinis的快速和定量检测具有重要意义.     

广东东莞地区猪肺炎支原体感染的血清学调查

为了解广东东莞地区猪养殖场猪肺炎支原体感染情况,在5个镇（街）、20个猪养殖场共采集了390份血清,应用ELISA方法进行猪肺炎支原体抗体检测。结果为猪肺炎支原体抗体阳性率为86.92%,20个猪养殖场都存在不同程度的猪肺炎支原体感染,其中母猪的抗体阳性率为70.41%,仔猪为84.45%,中猪为97.50%,大猪为92.63%。结果表明,广东东莞地区养殖场猪受肺炎支原体感染情况比较普遍,需采取综合防控措施。     

猪肺炎支原体巢式PCR诊断方法的建立及应用

为建立一种快速诊断猪肺炎支原体病原的方法,根据GenBank上登录的Mhp基因组序列,在保守区基因内部设计合成2对引物,经过PCR反应条件的优化,建立了检测猪肺炎支原体的巢式PCR方法。结果表明,该方法对鸡毒支原体、猪鼻支原体、猪传染性胸膜肺炎放线杆菌、猪圆环病毒2型、猪伪狂犬病毒的扩增结果均为阴性;第1次扩增的敏感性是10pg,第2次扩增的敏感性是0.1pg,第2次比第1次扩增的敏感性高100倍。巢式PCR检测方法具有特异性强、敏感性高、重复性好等优点,可以在短时间内准确快速的检测出低含量的Mhp病原,为猪肺炎支原体的快速诊断与净化奠定基础。     

猪支原体肺炎LAMP-LFD快速检测方法的建立及初步应用

旨在采用环介导等温扩增（LAMP）和横向流动试纸条（LFD）相结合的方法，建立一种快速、特异，过程可视化的猪肺炎支原体（Mycoplasma hyopneumoniae，Mhp）检测方法。针对猪肺炎支原体（Mhp）P36基因设计5套特异性引物和1条异硫氰酸荧光素（FITC）标记的探针，进行LAMP扩增反应。将生物素标记的LAMP产物与FITC标记的探针进行特异性杂交，并使用横向流动试纸条完成扩增产物的检测。经优化，LAMP最佳反应条件为65℃，反应15 min，从基因组DNA提取到LFD结果判断只需40 min左右，比常规PCR技术缩短近2 h。LAMP-LFD可特异性地检出猪肺炎支原体（Mhp），对猪鼻支原体（Mhr）及猪圆环病毒（PCV）等常见猪病病原的检测结果为阴性。灵敏性试验表明，LAMP-LFD对Mhp的检测灵敏度为1×10⁰个拷贝DNA，是普通PCR的1 000倍。利用本方法可从采集的88份临床疑似病料样品中检测到64份阳性，国标PCR方法可检测到56份阳性，符合率可达90.9%。综上，本研究建立的LAMP-LFD方法可特异、准确地应用于Mhp的检测，而且灵敏度高、操作简单、仪器设备依赖性低、检测成本低、耗时短，适合基层实验室、应急检测或现场监测等使用，具有较高的推广价值，有望发展成为Mhp快速检测的有效手段。     

支原体PCR检测方法的建立及初步应用

经过对Genebank鸡滑液支原体、猪肺炎支原体、口腔支原体和猪鼻支原体16S rRNA序列比对,设计了一条通用引物,建立支原体PCR检测方法.该方法敏感、特异、经济、快速,在动物疫苗生产中检测细胞、半成品及成品支原体污染具有较大的应用价值.     

猪鼻支原体分子生物学检测方法研究进展

猪鼻支原体感染猪后能引起猪肺炎、多发性浆膜炎、关节炎、结膜炎、中耳炎等多种疾病,易与其他猪病混感或继发多种疾病,致猪死亡率增加,给养猪业造成巨大的经济损失。文章综述了5种猪鼻支原体分子生物学检测方法,主要包括常规PCR法、套式PCR法、多重PCR、荧光PCR方法、环介导等温扩增技术等,对猪鼻支原体的诊断和防控有一定的参考价值。     

新疆北疆部分地区猪支原体肺炎分子流行病学调查

为了解新疆北疆地区猪支原体肺炎的分子流行病学特征,对新疆北疆5个地区的部分规模化猪场进行了调查,采用PCR方法对疑似病料进行了ldh基因检测,将阳性产物测序与在GenBank已登录的标准菌株序列进行同源性分析。结果显示:214份病变肺脏中,阳性病料为122份,阳性率为57.01%(122/214),ldh基因序列与参考菌株同源性为97.3%¹00%。检测结果表明新疆北疆部分地区感染猪肺炎支原体情况比较严重。     

广西山羊传染性胸膜肺炎病原的二重PCR快速诊断方法的建立

根据绵羊肺炎支原体标准株Y98和丝状支原体山羊亚种标准株PG3的16S rRNA两端的保守区序列设计了2对引物,建立了广西山羊传染性胸膜肺炎病原的二重PCR快速检测方法.试验结果显示,所建立的二重PCR能特异地扩增绵羊肺炎支原体和丝状支原体山羊亚种的基因片段,其敏感性可达lPg,,用建立的二重PCR检测了20份临床病例肺组织,检出率为70%(14/20),其中6份扩增出丝状支原体山羊亚种的基因片段,10份扩增出绵羊肺炎支原体的基因片段,有2份同时扩增出两种支原体的基因片段.培养法检出率为40%(8/20),而这8份病料均为PCR阳性.     

猪肺炎支原体和猪鼻支原体TaqMan双重荧光PCR检测方法的建立及应用

为建立一种可快捷鉴别检测猪肺炎支原体(Mhp)和猪鼻支原体(Mhr)的方法,针对Mhp的183基因和Mhr的p37基因保守片段,分别设计合成引物及TaqMan探针,优化反应条件,建立一种可同时检测Mhp和Mhr的TaqMan双重荧光PCR方法,并评价其特异性、敏感性和重复性。结果表明,该方法特异性强,检测其他常见猪呼吸系统病原不发生交叉反应;对标准品pMD18-T-Mhp-183、pMD18-T-Mhr-P37的最低检测限分别达45.2 copies/μL和29.7 copies/μL,比普通PCR检测灵敏度提高10³～10⁴倍;该方法检测结果的批内与批间变异系数均小于2%。用该方法检测145份广西自治区内临床样品,从中检出82份Mhp和9份Mhr阳性样品。该方法可用于临床样品快速检测及实验室Mhp和Mhr的鉴定,可为Mhp和Mhr在猪群中的早期监测提供技术支持。     

猪支原体肺炎防治研究进展

猪支原体肺炎(Mycoplasmal pneumoniae of swine,MPS)又称猪气喘病,是支原体科猪肺炎支原体(Mycoplasmal hyopneumoniae,Mhp)引起的一种接触性、慢性、呼吸道传染性疾病,其主要表现为猪只咳嗽、生产性能降低。此外,猪鼻支原体(Mycoplasma hyorhinis,Mhr)、絮状支原体(Mycoplasma fl occulare,Mfl oc)及猪滑液支原体(Mycoplasma hyosynoviae,Mhyo)也是猪群中常见的支原体科病原。Mhr易引起猪继发性肺炎,Mfl oc可引起猪轻微损伤,Mhyo与猪关节炎息息相关。     

猪肺炎支原体S株的分离与鉴定

从典型猪肺炎支原体病变肺组织传代分离到一株支原体,经培养特性、血清学鉴定、生化鉴定、PCR检测及测序分析证明其为猪肺炎支原体,纯化后命名为S株。将S株P46基因和P97基因R1区的氨基酸序列与其他菌种的相应序列进行同源性分析,该菌株P46基因氨基酸序列与其他菌种同源高达99%以上,P97基因R1区的氨基酸重复数为11个,不同于其他菌株;免疫原性试验结果表明该菌株具有良好的免疫原性。     

猪肺炎支原体PCR快速检测方法的建立和应用

根据猪肺炎支原体P36基因序列,设计1对引物,建立了猪肺炎支原体PCR诊断方法,该方法对猪肺炎支原体的扩增结果为阳性,对照菌株扩增结果均为阴性,对猪肺炎支原体检测的灵敏性为1 pg总DNA量。并用建立的PCR诊断方法检测52份猪肺炎支原体疑似病料,检出阳性病例18份,以上结果表明该PCR方法特异性强敏感性高、简便、快速,可用于猪肺炎支原体疾病的诊断。