卵泡抑制素与GFP融合基因疫苗pEGISI的构建及表达

为构建卵泡抑制素与绿色荧光蛋白（GFP）融合基因疫苗pEGISI，将pcISI中的乙肝表面抗原（HBsAg）S基因及插入S基因中的抑制素（INH）基因片段酶切回收；PCR扩增pcISI中INH基因片段，调整阅读框，一起融合到pEGFP-N1中EGFP基因的5’端，构建ISI-EGFP融合表达质粒pEGISI。酶切和测序鉴定表明，重组质粒pEGISI构建成功。将pEGISI转染293T细胞，16h后检测到绿色荧光，48h检测到强烈荧光，说明融合基因在293T细胞获得高表达；ELISA检测证实，表达产物ISI—EGFP融合蛋白具有INH的抗原抗体反应原性。质粒pEGISI的成功构建及表达为抑制素基因免疫的机理及安全性研究奠定了基础。     

双拷贝抑制素基因疫苗pcISI的构建和表达及免疫

为构建高免疫原性的卵泡抑制素（Inhibin,INH）DNA疫苗,将INH基因片段α1-32插入到pcIS中乙肝表面抗原（HBsAg）S基因第112-113氨基酸残基密码子之间,构建含2拷贝INH的融合表达质粒pcISI。酶切和测序鉴定表明,重组质粒pcISI构建成功。脂质体包裹法将pcISI转染HeLa细胞,ELISA检测表达产物的INH免疫反应原性。结果表明,融合目的基因在HeLa细胞获得表达,ISI融合蛋白具有比IS融合蛋白更强的INH抗原抗体反应性。将pcISI免疫6只大鼠后,5/6的大鼠产生了抗INH抗体,抗体P/N值在免疫后第2-6周高于pcIS免疫组。这些结果表明,所构建的质粒pcISI可以表达抑制素,表达产物具有较强的免疫原性。     

宿主细胞干扰素刺激基因15蛋白的真核表达及初步应用

为了探究由干扰素刺激基因15(ISG15)编码产生的ISG15蛋白的表达特性,及其对犬瘟热病毒(CDV)感染过程的影响,以及在CDV致宿主免疫抑制过程中的作用,试验设计并合成了针对ISG15基因的特异性引物,提取宿主细胞总RNA,反转录成cDNA后利用RT-PCR方法扩增ISG15全基因序列,扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测、回收纯化目的片段后将其插入到pEGFP-N1真核表达载体中,构建pEGFP-ISG15重组质粒。PCR和双酶切鉴定重组质粒后测序,将阳性重组质粒转染至HEK293T细胞中进行荧光显微镜观察和Western-blot分析。结果表明:经PCR扩增和双酶切鉴定得到与目的片段大小相符的片段,且测序结果证实重组质粒pEGFP-ISG15构建成功,转染HEK293T细胞24 h后可在荧光显微镜下观察到绿色荧光信号,Western-blot可检测到与目的蛋白大小一致的融合蛋白。说明试验构建的重组质粒pEGFP-ISG15可在体外成功表达ISG15蛋白。     

牛FSHβ基因真核表达质粒的构建及表达分析

为开发可以体外合成牛促卵泡素(FSH)的表达系统,试验通过基因合成的手段获得牛FSHβ基因的目的片段,并通过酶切及T4 DNA连接酶的作用将FSHβ目的片段构建成pcDNA3.1-EGFP-FSHβ重组质粒,并针对构建的pcDNA3.1-EGFP-FSHβ重组质粒,采用菌液PCR、双酶切的方法对该重组质粒进行鉴定,并进一步利用293T细胞检测该重组质粒的表达情况。结果表明:菌液PCR和双酶切的结果证实了牛FSHβ基因片段插入了重组质粒中;pcDNA3.1-EGFP-FSHβ重组质粒可以在293T细胞中表达出绿色荧光蛋白,而且经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测发现pcDNA3.1-EGFP-FSHβ重组质粒可以在293T细胞中转录并翻译出牛FSHβ基因的蛋白表达产物。说明pcDNA3.1-EGFP-FSHβ重组表达质粒构建成功,并且可以在293T细胞中表达。     

抑制素与羊GM-CSF基因融合表达质粒pCGMISI和pEGMISI的构建

为构建抑制素基因与羊GM-CSF基因融合的真核表达质粒,通过EcoRI、XhoI酶切抑制素真核表达质粒pCISI、pEGISI及羊GM-CSF表达质粒pGM-CSF/SS,然后将GM-CSF基因分别插入pCISI、pEGISI,转化DH5α,挑选阳性克隆,抽提质粒DNA,进行酶切和测序鉴定。结果表明,构建的抑制素融合表达质粒pCGMISI和pEGMISI正确,为研究GM-CSF基因对抑制素基因疫苗的免疫增强作用奠定了基础。     

奶牛LAP基因真核表达载体的构建及其在COS-7细胞中的瞬时表达

根据GenBank上发表的牛舌抗菌肽(Lingual antimicrobial peptide,LAP)基因cDNA序列设计1对特异引物,从患乳腺炎的奶牛乳腺组织中以RT-PCR方法扩增LAP基因片段,将其克隆到pMD19-T Simple载体中测序。重组质粒经EcoRⅠ+BamHⅠ双酶切回收目的基因片段,亚克隆入增强型绿色荧光蛋白表达载体pEGFP-C1中构建重组融合表达质粒pEGFP-LAP,将其脂质体转染COS-7细胞,经荧光显微镜观察到融合表达的绿色荧光蛋白,采用RT-PCR检测到LAP基因在COS-7细胞中转录。pEGFP-LAP重组表达质粒的成功构建为进一步研究奶牛LAP基因的表达特性及利用基因工程技术防治奶牛乳腺炎奠定了基础。     

奶牛溶菌酶基因(Lyz)乳腺特异性表达质粒构建与鉴定

研究旨在构建具有高效抗菌、活性持久的奶牛乳腺特异性表达质粒,探索研制新型抗菌制剂,为利用基因工程技术防治奶牛乳房炎提供重要材料。根据GenBank中奶牛溶菌酶基因(lysozyme,Lyz)mRNA序列(GenBank号:NM_180999.1)设计引物,从奶牛乳腺上皮细胞中RT-PCR扩增Lyz基因编码序列,将其克隆到携带增强型绿色荧光蛋白通用型表达载体pEGFP-N1中测序。重组质粒pEGFP-N1-Lyz经Ase I+Hind III双酶切除CMV启动子,将奶牛乳腺特异性表达β-乳球蛋白基因(BLG)启动子同源重组替换到Ase I和Hind III酶切位点,构建奶牛溶菌酶基因(Lyz)乳腺特异性表达质粒pBLG-EGFP-N1-Lyz,采用脂质体法转染奶牛乳腺上皮细胞(BMEC)、人肾脏上皮细胞(HEK293T),荧光显微镜检测转染细胞中绿色荧光蛋白的表达情况。结果表明,重组表达质粒pBLG-EGFP-N1-Lyz测序结果与目的片段长度相符,转染至BMEC细胞和HEK293T细胞,在奶牛乳腺上皮细胞观察到绿色荧光, HEK293T细胞未观察到绿色荧光,奶牛Lyz基因乳腺特异性表达质粒构建成功。     

山羊TLR2绿色荧光蛋白融合载体的构建

为了构建在哺乳动物细胞中表达的山羊TLR2绿色荧光蛋白融合载体,试验根据克隆到T载体上的山羊TLR2测序结果,设计1对不含终止子的引物,将山羊TLR2 PCR产物连接到pEGFP-N1载体上,用磷酸钙法转染293T细胞,并在荧光显微镜下观察。结果表明:重组质粒经酶切和测序鉴定正确,且在293T细胞中表达;融合蛋白发出绿色荧光,表明TLR2-EGFP主要分布在细胞膜上。说明试验成功地构建了pEGFP-TLR2-N1绿色荧光蛋白融合载体。     

生长抑素基因疫苗质粒pEGS/2SS的构建及表达

将pcS／2SS中的乙肝表面抗原（HBsAg）S基因及插入S基因中的生长抑素（somatostatin，ss）基因亚克隆到pUC19中，构建成pUSS／S质粒；PCR扩增pcS／SS中SS基因，调整阅读框，融合到pUSS／S质柱S基因后，构建成pUS／2SSG质粒；最后将S／2SSG融合基因克隆到pEGFPN1中EGFP基因的5’端，构建S／2SS-EGFP融合表达质粒pEGS／2SS。酶切、测序鉴定后脂质体包裹法将pEGS／2SS转染HeLa细胞，荧光显微镜下检测荧光，ELISA检测表达产物的SS免疫反应原性。酶切和测序鉴定表明，重组质粒pEGS／2SS构建成功。pEGS／2SS转染24h后的HeLa细胞检测到绿色荧光，72h检测到强烈荧光，表明融合基因在HeLa细胞获得高表达；ELISA证实融合蛋白具有SS的抗原抗体反应原性。质粒pEGS／2SS的成功构建及表达为生长抑素基因免疫的机理及安全性研究奠定了基础。     

小鼠Dazl基因融合蛋白表达载体的构建及转染

根据NCBI数据库上公布的小鼠Dazl基因的mRNA序列设计引物,以小鼠睾丸组织RNA为模板,RT-PCR扩增小鼠Dazl基因编码区片段,并将其克隆到增强型绿色荧光蛋白表达载体pEGFP-C1中,构建重组融合蛋白表达载体pEGFP C1-Dazl,单双酶切和测序验证正确.将pEGFP-Cl-Dazl质粒转染293和NIH 3T3细胞,荧光显微镜下观察到融合表达的绿色荧光蛋白,且呈胞质表达;对照组转染pEGFP-C1,绿色荧光遍布整个细胞.Dazl蛋白的免疫荧光试验也证明重组载体转染后,Dazl基因和GFP共同定位于胞质部分.pEGFP C1-Dazl融合蛋白表达载体的成功构建为进一步研究生殖特异性基因Dazl在小鼠和大型动物的表达特性奠定了一定的基础.     

VP22与EGFP、3种弓形虫抗原融合表达重组质粒的构建与鉴定

为了探索新型弓形虫疫苗的传递系统,本试验分别构建了细胞渗透肽VP22与增强型绿色荧光蛋白（EGFP）融合表达的重组质粒（pcDNA-VP22-EGFP）,以及细胞渗透肽VP22与3种弓形虫抗原融合表达的重组质粒（pcDNA-VP22-SAG1、pcDNA-VP22-GRA4、pcDNA-VP22-AMA1）。经PCR鉴定、酶切鉴定和序列测定后,将重组质粒pcDNA-VP22-EGFP转染COS7细胞,通过荧光显微镜和RT-PCR检测,验证VP22-EGFP基因在COS7细胞中的表达情况。PCR鉴定、酶切鉴定和序列测定结果显示所有重组质粒均构建正确。转染72 h后的细胞,在荧光显微镜下成功观察到绿色荧光。RT-PCR扩增得到了大小为1 449 bp的目的条带,与预期结果一致。结果表明,重组质粒构建成功。     

Construction and Identification of Cell Penetrating Peptides VP22 Gene Fused with Enhanced Green Fluorescent Protein and Three Antigens of Toxoplasma gondii

To study a novel vaccine of Toxoplasma gondii,the recombinant plasmids that cell penetrating peptides VP22 gene fused with one enhanced green fluorescent protein（EGFP)(pcDNA-VP22-EGFP)and three antigens of T.gondii（pcDNA-VP22-SAG1,pcDNA-VP22-GRA4 and pcDNA-VP22-AMA1）were constructed,respectively.The recombinant plasmids were identified by PCR,restriction endonuclease digestion and DNA sequencing.The pcDNA-VP22-EGFP plasmid was transfected into COS7 cells,and the expression of VP22-EGFP in COS7 cells was confirmed by fluorescence microscope and RT-PCR.The results showed that all recombinant plasmid were constructed correctly.Green fluorescence was observed successfully under the fluorescence microscope in transfected cells after 72 h.The gene fragment of 1 449 bp was obtained by RT-PCR.The results indicated that the recombinant plasmids were constructed successfully.     

含绿色荧光蛋白基因的猪细小病毒病-伪狂犬病重组病毒的构建

将扩增得到的PPV SC-1株VP2基因产物插入转移载体质粒pPI-2．EGFP中，构建了含PPV VP2基因及其EGFP报告基因的PRV基因缺失表达载体质粒pPI-2．EGFP．VP2。采用磷酸钙转染系统，将pPI-2．EGFP．VP2 DNA和PRV DNA共转染Vero细胞后通过直接荧光观察、Dot-blot核酸杂交筛选得到几株重组病毒，将其中一株（命名为SA215-B）DNA用BamHI酶切和Southern转印杂交进一步验证重组病毒构建成功，并通过SDS-PAGE电泳和Western免疫印迹检测表明PPV VP2基因在重组病毒内获得表达，产生大小约93ku的融合蛋白，同时融合蛋白中的PPV VP2结构蛋白仍然保持了原有的反应原性，表明成功构建了含绿色荧光蛋白基因的猪细小病毒病-伪狂犬病重组病毒。     

FOXL2基因重组腺病毒载体的构建及鉴定

为了构建叉头框L2(Forkhead box L2,FOXL2)基因与绿色荧光蛋白(GFP)基因复制缺陷型腺病毒载体,试验将克隆的FOXL2基因与IRES-GFP片段通过酶切、纯化等方法共同连接到pShuttle-CMV载体中,再与pAdEasy-1腺病毒质粒在BJ5183大肠杆菌中进行同源重组,得到复制缺陷型AD-FOXL2腺病毒载体,再用PacⅠ酶线性化后转染HEK293细胞,观察绿色荧光表达,并测量病毒效价。结果表明:将AD-FOXL2腺病毒载体用PacⅠ酶线性化后,得到1个大于23 kb的大片段和1个4.5 kb的特异性小片段,证明同源重组成功;将所得的腺病毒载体转染HEK293细胞,可以观察到GFP的表达,证明包装成功,并测得病毒效价为1×10-8.61/0.1 mLTCID50。     

柔嫩艾美耳球虫钙依赖蛋白激酶3在293T细胞中的表达研究

为构建柔嫩艾美耳球虫钙依赖蛋白激酶3（Eimeda tenella calcium-dependent protein kinases3,EtCDPK3）基因的重组质粒pCAGGS-EtCDPK3,并转染293T细胞进行表达,以柔嫩艾美耳球虫孢子化卵囊cDNA为模板,经PCR扩增其含完整开放阅读框的序列,将其克隆至pGEM．Teasy载体,构建pGEM—Teasy-EtCDPK3重组质粒,双酶切回收目的片段后与相应酶切的真核表达载体pCAGGS连接,构建真核重组表达质粒pCAGGS-EtCDPK3。该重组质粒经酶切和测序鉴定正确后转染293T细胞进行表达,分别用免疫印迹和间接免疫荧光鉴定EtCDPK3基因的表达情况。结果显示所构建的真核重组表达质粒pCAGGS—EtCDPK3经过双酶切鉴定,可见1条大小约为1302by的目的条带,测序结果与实验室已获得的EtCDPK3序列完全一致;Western blot结果可见大小约为49kDa的目的蛋白条带,间接免疫荧光实验可以检测到红色荧光。这些研究结果表明已成功构建了EtCDPK3的真核重组表达质粒pCAGGS-EtCDPK3,并在真核细胞中获得表达,为深入研究EtCDPK3的功能和制备DNA疫苗奠定了基础。     

Cloning and Eukaryotic Expression Plasmid Construction of Porcine Interleukin-18 Gene

To obtain recombinant eukaryotic expression plasmid of porcine interleukin-18(IL-18), the whole gene of porcine IL-18 gene was amplified from porcine spleen, lung and lymph nodes by RT-PCR and cloned into eukaryotic expression vector pZJ-1. The recombinant expression plasmid pZJ-IL-18 were identified by enzyme digestion and sequencing analysis, and was transfected into 293T cells.The expression of IL-18 was detected by Real-time PCR and Western blotting in both gene and protein levels. The results showed that the eukaryotic expression plasmid of porcine IL-18 was constructed and could express transiently in 293T cells. Western blotting result confirmed that porcine IL-18 polyclonal antibody could react specifically with approximately 17 ku expression products,and indicated that IL-18 could express correctly and be responsive.This study constructed the eukaryotic expression plasmid of porcine IL-18 gene which could express transiently in 293T cells, and laid the foundation for studying function of IL-18.     

猪白细胞介素18基因的克隆及真核表达重组质粒的构建

为获得表达猪白细胞介素18（interleukin-18,IL-18）的真核表达重组质粒,试验通过RT-PCR从猪脾脏、肺脏和淋巴结组织中扩增猪IL-18全基因并定向克隆到真核表达载体pZJ-1,测序分析和酶切鉴定正确后,转染至293T细胞中,并通过实时荧光定量PCR和Western blotting分别在基因和蛋白水平检测IL-18的表达。结果表明,试验成功构建了真核表达重组质粒pZJ-IL-18,且可以在293T细胞中表达IL-18基因。Western blotting试验证实,猪IL-18多克隆抗体能与约17 ku的表达产物发生特异性反应,表明IL-18能正确表达且具有反应原性。本试验构建了表达猪IL-18基因的真核表达质粒,并在293T细胞中瞬时表达,为进一步研究IL-18的功能奠定基础。     

牛瑟氏泰勒虫P23表面蛋白基因的克隆与原核表达

构建牛瑟氏泰勒虫P23基因片段原核重组表达质粒,表达重组蛋白。采用PCR方法扩增牛瑟氏泰勒虫P23表面蛋白基因,将扩增产物与pMD18-T-Simple载体连接,测序,验证扩增产物。将P23基因片段克隆到载体pGEX-4T-3上,经酶切分析、PCR鉴定后,IPTG诱导表达,最后用SDS-PAGE和Western blotting分析鉴定表达产物。结果表明克隆的P23基因片段为684 bp,重组质粒pGEX-4T-3/P23构建成功;SDS-PAGE显示目的蛋白相对分子质量约为58 ku;Western blotting分析结果显示,与牛瑟氏泰勒虫阳性血清发生反应,而与牛瑟氏泰勒虫阴性血清无反应,表明牛瑟氏泰勒虫P23表面蛋白具有良好的抗原性和特异性,提示可以利用融合蛋白来建立检测抗体的间接ELISA诊断方法。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒RdRp基因的克隆与原核表达

将猪繁殖与呼吸综合征病毒RNA依赖性的RNA聚合酶(RdRp)基因进行克隆、表达,并获得纯化重组蛋白,为进一步研究猪繁殖与呼吸综合征病毒RdRp的功能奠定基础.以RdRp基因cDNA为模板,用PCR扩增出RdRp基因片段,应用定向克隆策略将扩增后片段与高效表达载体pET32a(+)重组,阳性克隆重组质粒经酶切及测序鉴定,IPTG诱导高效表达.PCR法扩增出720 bp的片段,酶切及测序鉴定获得正确的重组质粒,在大肠埃希菌LB21中表达得到分子质量约为46 ku的融合蛋白.成功克隆及表达了猪繁殖与呼吸综合征病毒RdRp基因.