柔嫩艾美耳球虫乳酸脱氢酶真核表达质粒的构建与鉴定

为构建柔嫩艾美耳球虫乳酸脱氢酶(Eimeria tenella Lactate dehydrogenase,EtLDH)的真核表达质粒,分别以柔嫩艾美耳球虫第二代裂殖子和鸡脾脏cDNA为模板,PCR扩增出EtLDH和鸡IFN-γ基因,PCR产物经酶切回收目的片段后与相应酶切的真核表达载体pCAGGS连接,构建了真核表达质粒pCAGGS-EtLDH和pCAGGS-EtLDH-IFN-γ。所构建的真核表达质粒经酶切和测序鉴定为正确后转染293T细胞进行表达,分别用Western blot和间接免疫荧光鉴定EtLDH基因的表达情况。Western blot结果可见大小约为37 kDa的目的蛋白条带,间接免疫荧光可以检测到特异性红色荧光。结果表明成功构建了EtLDH的真核重组表达质粒pCAGGS-EtLDH和pCAGGS-EtLDH-IFN-γ,并能在真核细胞中表达,为深入研究EtLDH的生物学功能和球虫DNA疫苗的研制奠定了基础。     

柔嫩艾美耳球虫棒状体颈部蛋白2基因真核表达载体的构建及在293T细胞中表达

为构建柔嫩艾美耳球虫棒状体颈部蛋白2(Eimeria tenella rhoptry neck protein 2,EtRON2)基因的重组质粒pCAGGS-EtRON2,并转染293T细胞进行表达,以柔嫩艾美耳球虫孢子化卵囊cDNA为模板,经PCR扩增其核心编码区的一部分,将其克隆至pGEM-Teasy载体,构建pGEM-Teasy-EtRON2质粒,双酶切出目的片段后与相应酶切的真核表达载体pCAGGS连接,构建真核表达质粒pCAGGS-EtRON2。该重组质粒经酶切和测序鉴定后转染293T细胞进行表达,分别用免疫印迹和间接免疫荧光鉴定EtRON2基因的表达情况。所构建的真核表达质粒pCAGGS-EtRON2经过双酶切鉴定,可见一条大小约为1172 bp的目的条带,测序结果与GenBank所登录序列完全一致;免疫印迹实验可见大小约为43 kDa的目的蛋白条带,间接免疫荧光实验可以检测到特异性红色荧光。研究结果表明已成功构建了EtRON2的真核表达质粒pCAGGS-EtRON2,并在真核细胞中获得表达,为深入研究EtRON2的生物学功能奠定了基础。     

柔嫩艾美耳球虫沉默信息调节因子2真核表达质粒的构建及在细胞中的表达

为构建柔嫩艾美耳球虫沉默信息调节因子2(Eimeria tenella silent information regulator 2,Et SIR2)的真核表达质粒,以柔嫩艾美耳球虫第二代裂殖子c DNA为模板,PCR扩增出Et SIR2基因,PCR产物经酶切回收纯化目的片段后与经相应酶切的真核表达载体p CAGGs连接。连接产物经PCR和酶切鉴定,再经测序鉴定正确后,分别转染DF-1细胞和BHK细胞进行表达,用Western blot和间接免疫荧光鉴定Et SIR2基因的表达情况。结果表明:成功扩增了Et SIR2基因,长度为909 bp;Western blot可见大小约为37 k Da的表达蛋白条带;间接免疫荧光可以检测到特异性绿色荧光,表明成功构建了Et SIR2的真核表达质粒p CAGGsEt SIR2,并能在哺乳动物细胞和禽类细胞中表达。该研究结果为深入研究Et SIR2的生物学特性和球虫DNA疫苗的研制打下了基础。     

柔嫩艾美耳球虫丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶真核表达质粒的构建及其在DF-1细胞中的表达

为了构建柔嫩艾美耳球虫丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(Eimeria tenella serine/threonine protein kinase,Et STK)基因的真核表达重组质粒,并实现在DF-1细胞中的表达,以柔嫩艾美耳球虫子孢子c DNA为模板,PCR扩增Et STK基因,将扩展产物与真核表达质粒pc DNA3.1-flag连接,构建重组真核表达质粒pc DNA3.1-flag-Et STK,测序鉴定正确后,转染DF-1细胞进行表达,利用Western blot和间接免疫荧光(indirect immunofl uorescene assay,IFA)对其表达情况进行鉴定。结果表明重组质粒pc DNA3.1-flag-Et STK构建成功。Western blot显示在54 k Da处出现条带;IFA检测到特异性的绿色荧光,表明构建的重组质粒pc DNA3.1-fl ag-Et STK成功地在DF-1中实现了表达。本研究结果为深入了解柔嫩艾美耳球虫丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶的功能及球虫核酸疫苗提供了基础。     

柔嫩艾美耳球虫AMA1基因DNA疫苗的免疫保护效果

本研究旨在评价表达柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenella)顶膜抗原1(Apical membrane antigen 1,Et AMA1)基因的DNA疫苗对雏鸡柔嫩艾美耳球虫人工感染的免疫保护效果。将Et AMA1基因和鸡IFN-γ基因插入真核表达载体p CAGGS中,分别构建了真核表达重组质粒p CAGGS-Et AMA1和p CAGGS-Et AMA1-IFN-γ。将重组质粒p CAGGS-Et AMA1转染进293T细胞中,经间接免疫荧光和Western blot实验鉴定,观察其在体外表达情况。将p CAGGS-Et AMA1和p CAGGS-Et AMA1-IFN-γ于7日龄和14日龄腿部肌肉注射免疫雏鸡,21日龄人工感染1×104个柔嫩艾美耳球虫孢子化卵囊,第29日龄时处死试验鸡,以平均增重、卵囊产量和病变记分来评价重组质粒的免疫保护效果。结果显示,p CAGGS-Et AMA1转染的293T细胞出现明显的红色荧光;两种真核表达重组质粒免疫组鸡的平均增重与未攻虫组的平均增重差异不显著,不具有统计学意义,而未免疫攻虫组则与未攻虫组在增重方面差异具有显著统计学意义;免疫组鸡相较于未免疫攻虫组在病变记分方面显著下降;免疫组的卵囊减少率分别为67.43%和72.89%;p CAGGSEt AMA1-IFN-γ组在增重、盲肠病变记分和卵囊减少率方面都优于p CAGGS-Et AMA1组,但差异不具有统计学意义。表明构建的2种重组质粒对雏鸡柔嫩艾美耳球虫感染有一定的免疫保护效果。     

鸡α干扰素基因真核表达载体pCAGGS-IFN-α的构建及其在293T细胞中的表达

为了构建鸡α干扰素基因真核表达载体,试验采用RT-PCR方法从鸡胚成纤维细胞中扩增α干扰素基因序列,将扩增产物定向插入到pMD18-T克隆载体中,进行序列测定;测序正确的质粒经EcoRⅠ和SacⅠ双酶切,将目的基因片段定向克隆到真核表达载体pCAGGS中,构建重组质粒pCAGGS-IFN-α;将重组质粒转染293T细胞,使用间接免疫荧光、Western-blot等方法检测目的蛋白。结果表明:已成功扩增出582 bp大小的鸡α干扰素基因片段,测序结果与GenBank报道的序列基本一致。说明阳性重组质粒pCAGGS-IFN-α真核表达载体构建成功,能正确表达鸡α干扰素。     

鸡柔嫩艾美耳球虫3-1E真核重组表达质粒的构建及其免疫保护性分析

为构建鸡柔嫩艾美耳球虫(E.tenella)重组真核表达质粒并检测其免疫保护性,本实验将E.tenella表面抗原基因3-1E(E)与鸡IFN-γ、IL-2基因分别串联在真核表达载体pcDNA3.1(+)中,构建真核重组表达质粒pcDNA-E-IFNγ、pcDNA-E-IL2,同时构建对照质粒pcDNA-E、pcDNA-IFNγ、pcDNA-IL2.经酶切鉴定得到预期大小目的片段,测序结果与预期序列一致.将构建的重组质粒免疫鸡只,经western blot检测表明该重组质粒在鸡体内可以正常表达;对感染鸡只的免疫保护效果显示,pcDNA-E-IFNγ、pcDNA-E-IL2组抗球虫指数(ACI)分别为181.04、187.30,具有高效的抗球虫效果,为将其进一步研制成为具有实用价值的抗球虫疫苗奠定了基础.     

传染性喉气管炎病毒王岗株gB基因gC基因和gD基因的真核表达

将传染性喉气管炎病毒(ILTV)王岗(WG)株的gB、gC、gD基因分别克隆到真核表达载体pCAGGS的EcoRⅠ位点，经过酶切、测序分析，筛选鉴定出含有gB、gC、gD基因的重组质粒，分别命名为pCAGG—gB、pCAGG—gC、pCAGG—gD。用质粒纯化试剂盒对重组质粒进行了纯化，将纯化后的质粒转染293T细胞，用间接免疫荧光技术检测了目的蛋白的表达情况。检测结果表明，目的蛋白得到了真实的表达。     

鹅细小病毒VP3基因真核表达载体的构建及其在Vero细胞中表达

根据已发表的鹅细小病毒(GPV)B株核苷酸序列,设计并合成了1对引物,PCR扩增GPV吉林分离株主要结构蛋白VP3基因,获得大小为1605bp的核苷酸片段。将该片段纯化后克隆入pMD18-T载体,转化感受态大肠杆菌JM109,双酶切鉴定,筛选阳性重组质粒并测序。经过酶切和连接反应,将VP3基因克隆入真核表达载体pVAX1,转化感受态大肠杆菌DH5α,筛选阳性克隆,提取质粒,进行了PCR和酶切鉴定。通过脂质体法将pVAX1-VP3转染Vero细胞,RT-PCR和间接免疫荧光法检测。结果显示,VP3基因克隆成功,与GPVB株核苷酸序列同源性为96.2%;PCR和酶切鉴定结果证实,成功构建了含VP3基因的GPV真核表达载体pVAX1-VP3。提取转染该质粒的Vero细胞RNA,RT-PCR扩增,在1000～2000bp可见一明显DNA条带;间接荧光抗体染色转染细胞,在细胞表面可见特异荧光。     

鸡柔嫩艾美耳球虫EtMIC-2基因真核表达载体的构建及其在Hela细胞中的表达

根据GenBank发表EtMIC-2序列设计1对特异性引物,通过PCR技术扩增EtMIC-2基因,将该基因与真核表达载体pVAX1连接,构建了重组真核表达载体pVAX1-EtMIC-2,并用脂质体介导法将其转染Hela细胞。然后通过间接免疫荧光（IFA）、SDS-PAGE和Western-blot分析检测EtMIC-2蛋白在转染细胞中的表达情况。经测序和序列分析,成功扩增获得了EtMIC-2基因,并成功构建了重组真核表达载体pVAX1-EtMIC-2,Western-blot和IFA表明EtMIC-2蛋白在Hela细胞中得到表达。该结果为柔嫩艾美耳球虫核酸疫苗的研究奠定基础。     

H9亚型禽流感病毒血凝素特异性单因子血清制备

为制备特异性的H9亚型禽流感病毒(AIV)单因子血清,本研究分别将6株不同亚群的H9亚型AIV的血凝素(HA)基因以鸡偏嗜的密码子进行优化,经全基因合成插入高效真核表达载体pCAGGS中,构建的真核重组质粒转染293T细胞进行瞬时表达,间接免疫荧光试验结果表明,重组质粒中的HA目的基因获得表达.将重组质粒以200μg/只的剂量免疫1月龄SPF鸡,6周后采血分离血清.交叉微量血凝抑制试验结果表明,血凝抑制效价可达8 long2～12 log2,灵敏度高,与其他AIV亚型抗原无交叉反应,型特异性强.     

日本乙型脑炎病毒SA14-14-2株NS1-Flag蛋白在293T细胞中的表达

通过RT-PCR方法扩增出日本乙型脑炎病毒SA14-14-2株的NS1基因,利用Hind Ⅲ和Hpa Ⅰ双酶切克隆到带有Flag标签的pcDNA3.1载体上,重组质粒命名为pcDNA3.1-NS1-Flag。脂质体法转染293T细胞后,经间接免疫荧光(IFA)和化学荧光Western blotting检测,证明带有Flag标签的NS1基因在293T细胞中得到高效表达。     

卵泡抑制素与GFP融合基因疫苗pEGISI的构建及表达

为构建卵泡抑制素与绿色荧光蛋白(GFP)融合基因疫苗pEGISI,将pcISI中的乙肝表面抗原(HBsAg)S基因及插入S基因中的抑制素(INH)基因片段酶切回收;PCR扩增pcISI中INH基因片段,调整阅读框,一起融合到pEGFP-N1中EGFP基因的5'端,构建ISI-EGFP融合表达质粒pEGISI。酶切和测序鉴定表明,重组质粒pEGISI构建成功。将pEGISI转染293T细胞,16h后检测到绿色荧光,48h检测到强烈荧光,说明融合基因在293T细胞获得高表达;ELISA检测证实,表达产物ISI-EGFP融合蛋白具有INH的抗原抗体反应原性。质粒pEGISI的成功构建及表达为抑制素基因免疫的机理及安全性研究奠定了基础。     

共表达牛病毒性腹泻病毒E0基因和牛传染性鼻气管炎病毒gD基因的重组质粒DNA构建及其对小鼠的免疫效应

本研究计划构建能同时表达牛病毒性腹泻病毒（BVDV）和牛传染性鼻气管炎病毒（IBRV）优势抗原基因的重组质粒并研究其免疫效果,旨在为BVD-IBR二联核酸疫苗的研制提供参考。采用PCR扩增目的基因E0及gD并将其依次连接至真核表达载体pVAX1-IRES中,构建pVAX1-E0-IRES-gD重组真核表达载体;将pVAX1-E0-IRES-gD转染至293T细胞中,间接免疫荧光法检测目的基因在细胞中的表达情况;将pVAX1-E0-IRES-gD以不同剂量采用肌内注射的方式接种小鼠,通过抗体水平和细胞因子检测以及脾淋巴细胞增殖试验对该重组质粒的免疫效果进行评价。结果表明,成功构建pVAX1-E0-IRES-gD重组质粒,目的基因在293T细胞内成功表达。在抗体和细胞因子水平以及脾淋巴细胞增殖能力这3个指标,重组质粒组均极显著高于空载体和阴性对照组,高剂量免疫组优于中、低剂量组;另外,高剂量重组质粒免疫组与二联灭活疫苗组相比无显著性差异。结果显示,成功构建了共表达BVDV E0和IBRV gD基因的重组质粒,体外表达检测证明目的蛋白具有良好的反应原性,动物免疫试验证明其能刺激机体产生良好免疫应答。     

马动脉炎病毒大囊膜糖蛋白真核表达载体的构建与瞬时表达

将马动脉炎病毒大囊膜糖蛋白基因GL插入真核表达载体pVAX1中构建真核表达载体pVAX1-GL，酶切和测序结果表明构建是正确的，用脂质体转染试剂将其转染BHK-21细胞并通过问接免疫荧光试验检测其在体外的表达情况，结果在转染的细胞表面观察到绿色荧光，证明基因得到了表达，而对照则无绿色荧光，本研究为马动脉炎基因疫苗的研究奠定了基础。     

胆汁酸膜受体TGR5真核表达载体的构建及在细胞中的表达

试验旨在构建胆汁酸膜受体TGR5真核表达载体,转染293T细胞并在其中表达。用RT-PCR技术从胎盘组织中得到TGR5基因,克隆至真核表达载体pCMV-EGFP中。双酶切和测序鉴定正确后,将pCMV-EGFP-TGR5瞬时转染293T细胞,并采用实时荧光定量PCR和Western blotting技术检测TGR5的表达。结果显示,本试验构建了TGR5真核表达载体pCMV-EGFP-TGR5;转染293T细胞后,荧光显微镜观察到绿色荧光表达;实时荧光定量PCR检测TGR5表达量显著增加;Western blotting结果显示有目的蛋白表达。结果表明,真核表达载体pCMV-EGFP-TGR5构建成功,转染293T细胞后在基因、蛋白水平上均表达TGR5受体。     

水牛髓样分化因子88融合蛋白真核表达载体的构建及其在HEK293细胞中的表达

将水牛髓样分化因子88(myeloid differentiation factor 88,MyD88)cDNA全长定向克隆至pEGFP-C1真核表达载体,通过酶切和测序鉴定正确后,经脂质体介导将重组质粒转染至HEK293细胞,应用荧光显微镜、流氏细胞术和Western blotting检测MyD88蛋白的表达。结果表明,酶切及测序结果证实重组质粒含有MyD88全长CDS序列,融合蛋白读码正确;荧光显微镜、流式细胞术和Western blotting检测证实,水牛EGFP-MyD88融合蛋白真核表达载体能够在HEK293细胞表达。本研究成功构建了pEGFP-C1-MyD88真核表达载体,并使其在HEK293细胞中获得表达,为进一步研究该基因的生物学功能奠定基础。     

猪圆环病毒2型ORF2与T细胞表位基因重组腺病毒表达载体的构建及鉴定

利用腺病毒表达系统表达猪圆环病毒2型（porcine circovirus type 2,PCV2）的ORF2基因与T细胞表位（T cell epitope,TCE）基因,表达的融合蛋白具有反应原性,为研制PCV2新型疫苗奠定基础。以pMD18-T-ORF2、pMD18-T-TCE为模板,采用PCR方法扩增目的基因ORF2和TCE,以多肽接头（Gly₄Ser）₃为连接子,运用重叠延伸PCR技术将2段基因通过连接子（Gly₄Ser）₃进行融合连接。将融合基因定向克隆至腺病毒转移载体pShuttle-CMV构建重组质粒pShuttle-CMV-ORF2-TCE,将该重组质粒用PmeⅠ酶线性化后电转化大肠杆菌BJ5183感受态细胞（内含pAdEasy-1骨架质粒）进行同源重组获得重组腺病毒质粒pAd-ORF2-TCE。PacⅠ酶线性化pAd-ORF2-TCE质粒后转染AD293细胞包装病毒,重组腺病毒经3轮噬斑纯化后获得重组腺病毒rAd-ORF2-TCE,病毒滴度为10^12.3 TCID₅₀/mL。Western blotting及间接免疫荧光试验（indirect immunofluorecent assay,IFA）结果表明融合蛋白得到正确表达。     

山羊生物钟基因CLOCK真核表达载体的构建和生物信息学分析

试验旨在构建山羊昼夜运动输出周期蛋白(circadian locomotor output cycles kaput,CLOCK)基因真核表达载体,系统分析山羊CLOCK蛋白的生物学特性。从山羊卵巢组织中提取总RNA,反转录成cDNA后经PCR扩增山羊CLOCK基因CDS区序列,并以同源重组的方式将其连接至pcDNA3.1-Puro-N-3HA载体;经PCR、酶切和测序鉴定后,将阳性质粒命名为pcDNA3.1-3HA-gCLOCK;将pcDNA3.1-Puro-N-3HA和pcDNA3.1-3HA-gCLOCK质粒分别转染至HEK293T细胞中,通过实时荧光定量PCR和Western blotting检测山羊CLOCK基因的表达效果,并对山羊CLOCK基因进行系统的生物信息学分析。结果显示,山羊CLOCK基因CDS区片段长2 538 bp,将其与线性化的pcDNA3.1-Puro-N-3HA载体重组连接并通过酶切和测序鉴定后,成功构建了pcDNA3.1-3HA-gCLOCK真核表达载体;实时荧光定量PCR和Western blotting检测结果显示,pcDNA3.1-3HA-gCLOCK转染组CLOCK基因在mRNA和蛋白水平的表达量均极显著高于pcDNA3.1-Puro-N-3HA对照组(P<0.01)。生物信息学分析结果表明,山羊CLOCK基因CDS区序列与绵羊、牛和马的相似性分别为99.4%、98.7%和95.6%。山羊CLOCK蛋白是一种不稳定蛋白,具有一定的亲水性,无跨膜区和信号肽。二级结构由α-螺旋、延伸链、β-转角和无规则卷曲组成;三级结构与小鼠和人的CLOCK蛋白相比具有极高的相似性。本研究成功构建了山羊生物钟基因CLOCK真核表达载体,并进行了生物信息学分析,为进一步研究山羊CLOCK基因的生物学功能及山羊生物钟的转录调控机制提供了材料。