蚓激酶重组逆转录病毒载体的构建及其在牛乳腺中的表达

将含有蚓激酶基因的表达盒插入到逆转录病毒载体pLNCL中获得了蚓激酶重组逆转录病毒载体,转染泌乳期奶牛乳腺小叶并获得暂时表达。利用脂质体转染PA317包装细胞,G418进行筛选得到了阳性细胞克隆,克隆扩大培养后病毒上清感染NIH3T3细胞进行滴度测定,最高滴度为1×104CFU/mL。进而用病毒上清转染妊娠期奶牛乳腺小叶组织,产后奶样经FAPA法检测表明蚓激酶基因已经整合到奶牛乳腺组织,并能实现相对稳定的表达。     

稳定表达T7RNA聚合酶PK-15细胞系的建立

为构建稳定表达T7 RNA聚合酶(RNAP)的猪肾细胞系(PK-15),本研究采用PCR方法,以E.coli BL21(DE3)细菌基因组为模板扩增T7 RNAP基因,将其克隆到逆转录病毒载体pLXSN中,构建重组质粒pLXSN-T7.采用脂质体将pLXSN-T7转染至PT67细胞中,经G418筛选培养获得重组逆转录病毒rMLV-T7,将其接种于PK-15细胞进行G418加压筛选和纯化;应用PCR、间接免疫荧光试验及T7启动子控制下的红色荧光蛋白的重组表达质粒(pET-RED)进行瞬时表达,检测T7 RNAP的表达及活性,结果表明筛选所得的细胞系PK/T7的不同代次均具有转录活性.本研究建立稳定表达T7 RNAP的细胞系PK/T7,为实现细胞内T7启动的转录和猪源RNA病毒等的反向遗传操作提供了有效的方法.     

抗菌肽重组逆转录病毒载体的构建、重组病毒的包装及其在牛奶中的稳定表达

将含有双抗菌肽基因的表达盒插入到逆转录病毒载体pLN-bcp-LK(R)中,获得了含有双抗菌肽基因的重组逆转录病毒载体pLN-bcp-LfcinB-CE-MA(R),利用脂质体转染PA317包装细胞,G418进行筛选得到了阳性细胞克隆,克隆扩大培养后,用病毒上清感染NIH3T3细胞进行滴度测定,最高滴度为1×104CFU/mL,用病毒上清转染妊娠中后期奶牛乳腺组织,产犊后采集的奶样经琼脂板溶圈法和Tricine-SDS-PAGE检测,结果表明乳汁中表达的抗菌肽对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均具有明显地抑菌活性,并能实现相对稳定的表达,表达可持续30~45 d。     

重组逆转录病毒载体的包装

将3.7kb的LacZ基因片段克隆到含标志基因Neo的逆转录病毒载体，pLXSN与pLNCX的多克隆位点，构建了含有LacZ基因的重组逆转录病毒载体pLLSN和pLNCL.在测定了G418对饥装细胞系PA317的最小致剂量后（最小致死剂量为0.3g/L），通过脂质体Lipofectin与磷酸钙2种介质，分别将2种重组逆转录病毒载体导入包装细胞系PA317进行包装，并以0.3g/L，的G418进行筛选，得到多个G418抗性克隆，经扩大培养，传代，分别得到包装pLLSN与pLNCL的2株阳性细胞，电镜下可见阳性细胞的培养上清中具有逆转录病毒形态特征的成熟病毒粒子，本0研究为运用逆转录病毒载体系统，解决转角因效率低的问题奠定了基础。     

蜘蛛拖丝蛋白基因逆转录病毒载体构建与检测

利用pIRES2-EGF和pMX载体以及前期获得的蜘蛛拖丝蛋白基因(2S)构建逆转录病毒载体pMX-2S-IRES-EGFP.采用磷酸钙法将pMX-2S-IRES-EGFP质粒转染到PlatE细胞并获得重组逆转录病毒.通过小鼠成纤维细胞系NIH3T3检测病毒侵染能力,并采用PCR法检测蜘蛛拖丝蛋白基因在NIH-3T3细胞的整合状况.结果显示,成功构建了逆转录病毒载体pMX-2S-IRES-EGFP;通过感染NIH-3T3细胞测定重组逆转录病毒滴度约为2×105 cfu/mL;PCR鉴定结果显示,目的基因2S-IRES-EGFP已整合入NIH-3T3细胞基因组中.     

东方田鼠皮肤成纤维永生化细胞的建立

为建立东方田鼠皮肤成纤维细胞(MfSF)系,本研究采用脂质体基因转染法将含有SV40T基因的pSV3neo重组质粒导入原代MfSF中,通过G418筛选,阳性克隆扩大培养,建立永生化MfSF系.实验结果表明,阳性细胞克隆在G418筛选第三周后出现,经扩大培养已稳定传代达42代,而且生长状态良好,PCR及RT-PCR检测结果表明,SV40 T基因已整合到MfSF中并稳定表达.本研究利用SV40 T基因导入制备了永生化MfSF细胞系,为动物间成纤维细胞比较研究及相关病原的研究提供了敏感细胞系.     

反义RNA重组逆转录病毒逆转录套式PCR检测方法的建立

为探求一种快速检测反义RNA重组逆转录病毒效价的新方法，用脂质体介导法将反义RNA重组逆转录病毒载体pLXSA、pLXSB分别转染包装细胞系PA317，经G418筛选，获得数个稳定的产毒细胞克隆，择优挑选7个细胞克隆扩增培养，收集细胞上清，用异硫氰酸胍-酚一步法提取病毒RNA，进行逆转录套式PCR，检测细胞上清中的反义RNA重组逆转录病毒效价，同时用传统方法（小鼠成纤维放大法）进行测定。2种方法检测结果的比较表明，逆转录套式PCR法的特异性和敏感性均高于小鼠成纤维放大法，是一种敏感性高、特异性强、操作简便、快速的检测逆转录病毒效价的新方法。     

猪瘟病毒亚基因复制子及其细胞系的构建

为探索猪瘟病毒(CSFV)的复制机理,本实验在前期CSFV流行株GD53全基因组测序的基础上,利用新霉素抗性基因(Neor)替换病毒结构蛋白基因以构建CSFV GD53株的亚基因组复制子(GD53-SGR)。首先构建含有T7-5'UTR-N~(pro)-Neor-EMCV/IRES-NS2-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B-3'UTR的重组质粒pc DNA-GD53-SGR,将其利用T7 RNA聚合酶经体外转录制备的RNA转录本转染猪睾丸细胞系(ST)后,利用G418筛选含有GD53-SGR的ST细胞,构建ST-GD53-SGR细胞系。酶切鉴定及测序结果表明,重组质粒pc DNA-GD53-SGR构建正确,利用T7 RNA聚合酶体外转录后获得了与预期大小一致的GD53-SGR RNA。经RT-PCR和间接免疫荧光鉴定结果表明,获得了含有GD53-SGR的ST细胞系。本研究构建的CSFV ST-GD53-SGR细胞系有助于进一步了解CSFV非结构蛋白的功能,同时为CSFV的复制机制研究及抗病毒药物的研发奠定基础。     

喜树碱对NIH/3T3细胞TLR3表达及活化的影响

为研究喜树碱(CPT)对小鼠成纤维细胞NIH/3T3中Toll样受体3(TLR3)的表达及活化的影响,本实验利用CCK-8试剂盒测定了CPT在不同浓度下、不同作用时间对NIH/3T3细胞的毒性作用,并确定CPT对NIH/3T3细胞的基本无毒浓度为1μg/mL。通过流式细胞术检测CPT作用NIH/3T3细胞表明,TLR3平均荧光强度与对照组相比显著增强,表明TLR3表达增加。此外,ELISA试剂盒检测结果显示CPT作用后IFN-β表达量增加,并高于阳性对照组,差异极显著(p<0.01)。本研究表明CPT对NIH/3T3细胞的TLR3具有显著的激动作用。     

稳定表达乙型脑炎病毒NS1蛋白细胞系的建立

为建立稳定表达乙型脑炎病毒(JEV) NS1蛋白的真核细胞系,本研究将编码JEV NS1蛋白的人工合成基因克隆到真核表达载体pCAGG-TK-neo中,构建了重组质粒pCAGG-opti-NS1.重组质粒经脂质体转染RK-13细胞,以含G418的选择性培养基选择培养,经细胞克隆纯化,以间接免疫荧光试验(IEA)筛选表达目的基因的细胞.结果表明,转染的RK-13细胞经G418加压及IFA筛选后,获得表达JEV NS1蛋白的阳性RK-13细胞系.经RT-PCR、western blot和IFA鉴定,该细胞系在传代至第15代后仍然可以稳定表达NS1蛋白.本实验获得了能够稳定表达JEV NS1蛋白的细胞系,为进一步开展JEV相关的研究奠定了基础.     

禽流感病毒NP cDNA反义逆转录病毒载体的构建及重组病毒的鉴定

根据反义ＲＮＡ作用原理,以禽流感病毒（ＡＩＶ）Ｈ１４Ｎ５　ｃＤＮＡ全长及５’端２３５个ｂｐ为目的基因,反向插入反转录病毒载体 ｐＬＸＳＮ中,命名为 ｐＬＸＳＮ－ＮＰ及 ｐＬＸＳＮ－ＮＰ,用脂质体包裹重组质粒转染包装细胞 ＰＡ３１７,Ｇ４１８筛选抗性克性,扩增单个克隆后提取包装细胞上清的病毒ＲＮＡ（ｖＲＮＡ）,以巢式ＰＣＲ方法检测,以及用包装细胞上清（重组病毒）感染滴定细胞系ＮＩＨ３Ｔ３,表明已筛选出产毒的的克隆细胞质,得到重组逆转录病毒,为反义ＲＮＡ抑制禽流感病毒复制的实验研究奠定了物质基础。     

带有GFP的小鼠Sox2基因逆转录病毒载体的构建及其检测

为了建立体细胞重编程过程中检测Sox2基因表达变化的方法,本研究利用克隆获得的小鼠Sox2基因与逆转录病毒载体pMX—IRES—GFP连接,构建带有报告基因GFP的逆转录病毒载体,将其转染293GP细胞后获得假病毒上清。将获得假病毒上清侵染小鼠成纤维细胞（NIH3T3细胞）后观察GFP的表达和检测Sox2转录量的变化。其结果,成功构建带有GFP的Sox2基因逆转录病毒载体pMX—Sox2-IRES—GFP;将构建的载体转染后293细胞后获得能侵染NIH3T3细胞的假病毒上清,且与未侵染的NIH3T3细胞相比,侵染后的NIH3T3细胞的Sox2表达量提高近10倍。本研究为开展在体细胞重编程过程中Sox2表达与重编程效率的相关性提供依据．     

KLF3基因3'-UTR区双荧光素酶报告载体及其突变载体的构建与活性鉴定

试验旨在构建锌指蛋白3（KLF3）基因3'-UTR区双荧光素酶基因报告载体及其突变载体,初步分析可能调控KLF3基因表达的miRNAs。首先通过PCR方法扩增KLF3基因的3'-UTR序列,将其克隆到经Xho Ⅰ、Not Ⅰ双酶切的双荧光素酶报告载体中;运用Targetscan软件预测可能与KLF3基因3'-UTR相互作用的miRNA;使用脂质体2000转染试剂将miRNAs mimics与构建好的KLF3基因3'-UTR段双荧光素酶报告载体或突变载体共转染于常规培养的293T细胞中,检测荧光素酶活性。结果表明,KLF3基因3'-UTR可能是miR-21的作用靶位点;双荧光报告显示,miR-21 mimics组（0.6900±0.0144）比突变组（1.000±0.0688）和空白对照组（1.000±0.0159）KLF3基因3'-UTR双荧光素酶基因报告载体和突变载体的活性降低了31%（P<0.01）。本试验成功构建了含有KLF3基因3'-UTR段双荧光素酶基因报告载体与突变载体,初步证实miR-21对KLF3基因有调控作用。     

Study on Eukaryotic Expression of ORF059 Gene of Orf Virus

The study was aimed to clonie and express ORF059 gene of Orf virus (ORFV).The genome of ORFV HCE attenuated vaccine strain was extracted and used as the template.Based on the referenced gene sequences of ORF059 gene on GenBank,the specific primers were designed,the fragment of ORF059 gene was amplified by PCR.After being purified,ORF059 gene was inserted into pEGFP-N1 vector to construct recombinant plasmid pEGFP-ORF059-N1.After being sequenced,the recombinant plasmid pEGFP-ORF059-N1 was transfected into NIH3T3 cells with liposomes.The expression of fusion protein was identified by the fluorescence microscope observation and Western blotting.The results showed that the ORF059 gene was 1 005 bp.The recombinant plasmid pEGFP-ORF059-N1 was constructed correctly.Green fluorescence could be observed in NIH3T3 cells transfected by pEGFP-ORF059-N1 under the fluorescence microscope.The expressed fusion protein was about 64 ku.The results laid a foundation for the further research on the mechanism of ORF059.     

羊口疮病毒ORF059基因的真核表达研究

试验旨在扩增羊口疮病毒（Orf virus,ORFV）ORF059基因并进行真核表达。提取羊ORFV HCE弱毒株基因组为模板,参照GenBank上ORF059的基因序列,利用DNAMAN设计引物,应用PCR扩增ORF059目的片段,凝胶回收后将其连入pEGFP-N1质粒,构建重组质粒pEGFP-ORF059-N1,测序正确后瞬时转染NIH3T3细胞,应用荧光显微镜观察,Western blotting鉴定融合蛋白的表达。结果表明,ORF059基因片段大小为1 005 bp;重组质粒pEGFP-ORF059-N1构建正确;转染pEGFP-ORF059-N1的NIH3T3细胞有明显的绿色荧光;表达的融合蛋白大小约为64 ku。本试验结果为进一步研究ORF059的作用机理奠定了基础。     

柔嫩艾美耳球虫钙依赖蛋白激酶3在293T细胞中的表达研究

为构建柔嫩艾美耳球虫钙依赖蛋白激酶3（Eimeda tenella calcium-dependent protein kinases3,EtCDPK3）基因的重组质粒pCAGGS-EtCDPK3,并转染293T细胞进行表达,以柔嫩艾美耳球虫孢子化卵囊cDNA为模板,经PCR扩增其含完整开放阅读框的序列,将其克隆至pGEM．Teasy载体,构建pGEM—Teasy-EtCDPK3重组质粒,双酶切回收目的片段后与相应酶切的真核表达载体pCAGGS连接,构建真核重组表达质粒pCAGGS-EtCDPK3。该重组质粒经酶切和测序鉴定正确后转染293T细胞进行表达,分别用免疫印迹和间接免疫荧光鉴定EtCDPK3基因的表达情况。结果显示所构建的真核重组表达质粒pCAGGS—EtCDPK3经过双酶切鉴定,可见1条大小约为1302by的目的条带,测序结果与实验室已获得的EtCDPK3序列完全一致;Western blot结果可见大小约为49kDa的目的蛋白条带,间接免疫荧光实验可以检测到红色荧光。这些研究结果表明已成功构建了EtCDPK3的真核重组表达质粒pCAGGS-EtCDPK3,并在真核细胞中获得表达,为深入研究EtCDPK3的功能和制备DNA疫苗奠定了基础。     

Generation of Sperms Containing EGFP‐LacZ Following Transfection of Chicken Testis with a Eukaryotic Dual Reporter Vector

Male germ cells modified by foreign genes can be used to generate transgenic chicken. In this study, in vivo transfection of chicken testis with an EGFP‐LacZ dual reporter expression vector was performed. Large‐scale plasmid DNA preparation of the EGFP‐LacZ eukaryotic expression vector was carried out and efficient transfection of chicken testicle cells using the prepared plasmid DNA was confirmed in vitro. The reporter plasmid was directly injected into adult rooster testes. Semen samples were collected on 10‐days post‐transfection and every other day thereafter; and a total of six collections were made. Semen slides were subjected to fluorescence microscopy and β‐galactosidase activity assay to identify sperms carrying the reporter genes. The presence of EGFP and LacZ was further confirmed by PCR amplification with sperm genomic DNA as template. The testicles of those birds were subjected to cryostat sectioning, fluorescence microscopy and β‐galactosidase activity assay. The results showed that sperms with green fluorescence were not observed on semen slides; however, sperms positive for β‐galactosidase were detected. Specific amplicons of EGFP and lacZ were detected in four of the six sequentially collected semen samples. Fluorescence microscopy of the corresponding semen slides revealed yellow‐green fluorescence, but not clear green fluorescence. The β‐galactosidase activity assay and GFP histochemistry using monoclonal antibodies demonstrated positive staining for subsets of testicle cells. Together, these results showed that direct injection of the dual reporter vector into adult rooster testis allowed in vivo transfection of chicken sperm precursor cells, which further developed into sperm containing EGFP‐LacZ.     

Exogenous DNA internalisation by sperm cells is improved by combining lipofection and restriction enzyme mediated integration

1. Three types of exogenous DNA inserts, i.e. complete linearised pVIVO2-GFP/LacZ vector (9620 bp), the LacZ gene (5317 bp) and the GFP gene (2152 bp) were used to transfect chicken spermatozoa through simple incubation of sperm cells with insert. 2. PCR assay, Dot Blot hybridisation and Southern hybridisation showed the successful internalisation of exogenous DNA by chicken sperm cells. 3. Lipofection and Restriction Enzyme Mediated Integration (REMI) were used to improve the rate of internalisation of exogenous DNA by sperm cells. 4. Results from dot blot as well as Southern hybridisation were semi-quantified and improved exogenous DNA uptake by sperm cells through lipofection and REMI. Stronger signals were observed from hybridisation of LacZ as well as GFP specific probe with the DNA from lipofected exogenous DNA transfected sperm DNA in comparison with those transfected with nude exogenous DNA.     

microRNA-124-3p对Th17细胞体外分化的影响分析

为探讨microRNA-124-3p(miR-124-3P)对Th17细胞体外分化的影响,本研究通过密度梯度离心获取小鼠脾脏单淋巴细胞悬液,运用免疫磁珠法分选幼稚T细胞,然后用腺病毒表达载体转染幼稚T细胞,介导miR-124-3P过表达和抑制表达,并设空白对照组,加入Th17细胞分化相关细胞因子,诱导幼稚T细胞向Th17细胞方向极化,运用流式细胞术检测极化后的Th17细胞占比,并用ELISA方法检测细胞培养上清中白细胞介素-17A(IL-17A)浓度。结果表明免疫磁珠法纯化幼稚T细胞纯度>90%;miR-124-3P过表达腺病毒载体转染幼稚T细胞,可显著提高miR-124-3P的表达量(P<0.05);流式细胞术和ELISA检测结果均表明,相比较空白对照组,过表达miR-124-3p可显著抑制Th17细胞体外分化,而抑制miR-124-3P表达可显著促进Th17细胞体外分化。研究表明,miR-124-3p对Th17细胞体外分化具有重要调控作用。