梅山猪耳组织成纤维细胞及其处理对核移植重组胚发育的影响

为研究供体细胞不同处理方法对核移植重构胚发育能力的影响,分别用血清饥饿不同时间和传代次数的供体细胞进行核移植,比较重组胚的卵裂率和囊胚率。结果发现,饥饿0、2、4、8d的核供体细胞,重组胚在卵裂率上没有表现显著的差异,而饥饿2d和4d试验组的囊胚率却显著高于其他组;以传代0、2、4、8代的细胞作为供体细胞进行核移植,未经传代的细胞直接作为核供体卵裂率为57.69%,明显低于经过传代的细胞;细胞的传代次数在重组胚卵裂率上并未表现出明显的不同,但传至第4代细胞构成重组胚的卵裂率和囊胚率最高(86.29%和23.36%)。试验选取饥饿处理2d、传4代的成纤维细胞作为核移植的供体,挑选发育良好的重组胚移植到6头代孕母猪体内,3头代孕母猪在第1到第3个情期相继返情,1头在胚胎移植45d流产;2头没有返情,B超检查受孕,其中1头代孕母猪到预产期顺利产下6头健康胎儿。     

不同类型供体细胞对牛体细胞重构胚发育能力的影响

通过显微操作去除体外成熟培养22￣23h卵母细胞的细胞核,并通过细胞质内注射法将供体细胞核移入去核卵母细胞内构建重组胚,重组胚经离子霉素(Ionomycin)激活5min后,再在6-DMAP内培养4h,将重组胚转CR1培养液中进行培养,24h和36h检查卵裂率,培养8d后统计囊胚发育率。比较了经血清饥饿和未饥饿牛成纤维细胞、颗粒细胞作为供体细胞构建的重组胚。研究发现:未饥饿组的牛成纤维细胞重组胚囊胚发育率(11.76%)显著高于血清饥饿组重组胚囊胚发育率(3.16%,p<0.05)。未饥饿组颗粒细胞囊胚发育率(14.94%)也显著高于血清饥饿组(7.14%,p<0.05)。经血清饥饿处理的颗粒细胞和成纤维细胞重组胚发育率差异不显著(p>0.05),未饥饿处理组两种细胞的重组胚发育率差异不显著。结果表明,用非饥饿处理牛成纤维细胞及颗粒细胞重组胚的发育率较高,牛颗粒细胞更有利于重新程序化。     

供体细胞来源及预处理对牛体细胞核移植效率的影响

以牛外耳皮肤成纤维细胞为核供体细胞,比较了不同同步化诱导方式(血清饥饿法与接触抑制法)、供体细胞冷冻与否、供体动物性别与年龄等因素对体细胞核移植效率的影响。结果表明,接触抑制法处理的供体细胞核移植胚囊胚率显著高于饥饿法(P<0.05);未冷冻的供体细胞核移植胚囊胚率显著高于冷冻供体细胞(P<0.05);成年母牛供体的囊胚率显著高于成年公牛(P<0.05);不同年龄供体细胞的核移植胚囊胚率差异不显著(P>0.05)。试验表明,以接触抑制法诱导未冷冻成年母牛外耳皮肤成纤维细胞为核供体,有利于核移植胚囊胚的发育。     

山羊胎儿成纤维细胞转染人t-PA指形区缺失基因及其核移植研究

采用阳离子脂质体法将人t-PA指形区缺失基因乳腺特异性表达载体(pEBT)导入山羊胎儿成纤维细胞,以山羊胎儿成纤维细胞和转染的山羊胎儿成纤维细胞作供体,构建核移植胚,对其体外发育情况进行了研究,比较了2种供体细胞(山羊胎儿成纤维细胞和转人t-PA指形区缺失基因的山羊胎儿成纤维细胞)及转人t-PA指形区缺失基因的山羊胎儿成纤维细胞饥饿处理与否对核移植胚胎体外发育的影响。结果表明,早期核移植胚有荧光蛋白(GFP)的表达;以山羊胎儿成纤维细胞作供体细胞时,核移植胚的桑葚胚率(50.3%)及囊胚率(16.0%)均高于以转人t-PA指形区缺失基因胎儿成纤维细胞为供体时的桑葚胚率(48.4%)和囊胚率(10.9%),但差异不显著(P>0.05);转人t-PA指形区缺失基因的山羊胎儿成纤维细胞经饥饿处理后,其核移植胚胎的卵裂率(73.6%)与不饥饿时的卵裂率(73.9%)差异不显著;饥饿处理后核移植胚胎的桑葚胚率(48.5%)和囊胚率(11.2%)均高于不饥饿处理的桑葚胚率(39.2%)和囊胚率(9.2%),但差异不显著(P>0.05)。本研究成功地构建了转人t-PA指形区缺失基因的体细胞核移植胚胎,体外囊胚率为11.2%。     

影响克隆牛生产效率之因素研究

为了提高牛体细胞克隆的效率,比较了不同融合电压对核移植胚发育的影响,其中1.7kv/cm电场强度,获得了较高的融合率、卵裂率和囊胚率,分别为67.14%,76.59%和29.16%。比较了血清饥饿处理体细胞对核移植效率的影响,血清饥饿处理体细胞后,融合率、卵裂率和囊胚率分别为68.91%,74.79%和28.26%,与非血清饥饿处理的相比没有明显差异(分别为60.96%,71.91%和20.31%,P>0.05)。而且胚胎移植后的怀孕率和产犊率也没有差异(分别为29.17%,8.33%和33.33%,16.66%,P>0.05)。另外,通过加强克隆牛的产后护理,可以提高克隆牛的成活率。总之,优化生产克隆牛的各环节因素,可以从整体上提高克隆牛的生产效率。     

热应激对牛卵母细胞克隆胚体外发育的影响

为了了解牛卵母细胞经短时间(30 min)热应激和采用不同供体细胞对核移植后重构胚发育的影响,对成熟前牛卵母细胞进行了不同温度(38.5(CK),39.5,40.5,41.5和42.5℃)热应激处理,以牛胎儿成纤维细胞为供体细胞,比较了重构胚的卵裂率和囊胚率;将成熟前牛卵母细胞于41.5℃热应激30 min,以未进行热应激处理的牛卵母细胞为对照,比较了3种不同供体细胞(牛胎儿成纤维细胞、牛卵巢上皮细胞、牛颗粒细胞)核移植后的重构胚囊胚细胞数。结果表明,成熟前牛卵母细胞经41.5℃热应激处理30 min,其卵裂率(72.5%)和囊胚率(18.3%)与对照组(57.6%和13.6%)相比均有显著提高(P<0.05);当温度升高至42.5℃后,虽然卵裂率有所提高,但囊胚率与对照组相比显著降低(P<0.05);其他温度处理的卵裂率和囊胚率与对照无显著差异(P>0.05)。牛卵母细胞经41.5℃热应激处理30 min,3种供体细胞形成的重构胚囊胚细胞数差异不显著(P>0.05),而且与其各自对照的囊胚细胞数差异也不显著(P>0.05)。说明41.5℃可以作为牛卵母细胞热应激处理的最佳温度,成熟前牛卵母细胞经41.5℃热应激处理30 min,能有效提高核移植效率。     

猪供核细胞不同处理对细胞凋亡及重构胚体外发育的影响

在核移植过程中,为了选择出一种最优的供核细胞处理方法,采用接触抑制、血清饥饿以及75 nmol/L曲古抑菌素A(Trichostatin A,TSA)3种方法分别对猪体细胞进行处理。通过AnnexinV-FITC法检测3种处理对细胞凋亡的影响,并将3种方法分别处理过的体细胞作为供核细胞,利用体细胞核移植技术(Somatic cell nuclear transfer,SCNT)研究供核细胞不同处理方法对猪重构胚体外发育能力的影响。结果表明:接触抑制和75 nmol/L TSA处理组对细胞的早期凋亡、晚期凋亡以及细胞坏死率同对照组比较差异不显著,而血清饥饿处理组无论是早期凋亡、晚期凋亡还是细胞坏死率均显著高于对照组。3种方法处理供核细胞,接触抑制处理组卵裂率同血清饥饿处理组比较,差异不显著,但是其显著高于75 nmol/L TSA处理组。3种方法处理的重构胚囊胚率差异不显著。接触抑制方法处理供核细胞相对于其他2个处理组更有利于重构胚的体外发育。     

盘羊供体细胞对异种核移植效率的影响

 【目的】利用核移植技术生产异种重构胚,研究供体细胞对异种核移植效率的影响。【方法】以新疆盘羊和绵羊耳皮肤组织建立成纤维细胞系,进行细胞遗传学分析;以来自不同个体、不同代次、不同汇合度和不同保存方式的盘羊成纤维细胞为核供体,当地绵羊卵母细胞为受体,进行异种重构胚的构建。【结果】来自3只盘羊耳皮肤成纤维细胞的异种重构胚的卵裂率与囊胚率均无显著差异;采用10代以内的细胞作为核供体,细胞代次不会影响重构胚的发育率;生长到70％～80％汇合的供体细胞重构胚的囊胚率显著高于刚完全汇合组和汇合2～4 d组;将供体细胞4℃保存2 d,虽降低了卵裂率,但囊胚率没有受到显著影响;盘羊的染色体数目为2 n=56,核型式为4（M）+50（T）,XY（T,M）;绵羊的染色体数目为2 n=54,核型式为6（M）+46（T）,XY（T,M）。【结论】利用本试验中的3只盘羊耳成纤维细胞,培养到10代以内、70％～80％汇合后用于构建异种重构胚,能得到较高的早期胚胎发育率。     

5-aza—dC联合TSA对不同供体细胞来源牛核移植胚胎体外发育的影响

为研究5-aza—dC和TSA提高核移植胚胎体外发育能力的作用是否有供体细胞特异性,实验选择皮肤成纤维细胞、胎儿成纤维细胞和卵丘颗粒细胞作为核供体细胞进行核移植,联合使用20nM（72h）5-aza—dc和50nM（12h）TSA处理供体细胞和重构胚,比较5-ttZa—dC＋TSA对不同供体细胞来源核移植胚胎体外发育的影响。实验结果表明,经5-azaLdC＋TSA处理后,极显著提高了3种供体细胞来源核移植胚胎的体外囊胚发育率（P〈0．01）。虽然胎儿成纤维细胞和卵丘颗粒细胞得到的发育率稍高于皮肤成纤维细胞组,但各对照组之间以及各处理组之间的体外发育率没有明显差异,5-aza—dC和TSA对核移植胚胎体外发育的影响没有供体细胞特异性。     

山羊转t-PA突变体基因的体细胞核移植研究

比较了用转t-PA突变体基因的胎儿成纤维细胞和卵丘细胞作供体时核移胚的发育情况。结果表明:卵丘细胞作供体时,核移胚的卵裂率(82.9%)和桑葚胚率(55.9%)均高于胎儿成纤维细胞卵裂率(75.7%)和桑葚胚率(48.7%),但差异不显著(P>0.05);卵丘细胞作供体时的囊胚率(19.7%)则高于胎儿成纤维细胞(11.0%),差异显著。(P<0.05)。比较了饥饿处理与否对胎儿成纤维细胞作供体时转基因核移胚的发育情况。结果表明:供体细胞饥饿后,其核移胚的卵裂率(75.6%)与供体不饥饿的卵裂率(75.8%)差异不显著;供体细胞饥饿后,其核移胚的桑葚胚率(46.5%)和囊胚率(11.0%)高于供体不饥饿的桑葚胚率(39.3%)和囊胚率(9.0%),但差异不显著。比较了SOFaa和CR1aa分别添加10?S和bFF后,转基因核移胚的发育情况。结果表明:用CR1aa液培养时,添加10?F,其囊胚率(9.1%)高于添加10?S(4.2%)(P>0.05);用SOF液培养时,添加10?F,其囊胚率(11.2%)高于添加10?S(5.5%)(P>0.05)。说明用SOF液优于CR1aa液。     

牛乳腺干细胞核移植

近些年来,体细胞核移植虽然取得了很大的进步,但核移植效率仍然很低,而供核细胞的选择对于核移植效率起着关键的作用.本研究针对牛乳腺干细胞(mammary stem cells,MSCs)和牛乳腺上皮细胞(mammary epithelial cells,MECs)作为核移植的供核细胞,比较了重构胚发育率和核移植胚胎干细胞分离率的差异,发现来源于MSCs的重构胚的卵裂率为69%(331/479),囊胚发育率为27%(130/479);来源于MECs的卵裂率为71%,囊胚发育率为17%(84/495).囊胚发育率差异显著(p＜0.05).试验从176个核移植重构囊胚分离培养胚胎干细胞(embryonic stem cells,ES cells),发现来源于MSCs的重构胚的NTES贴壁率为44%(39/88),来源于MECs的NTES贴壁率为28%(25/88),NTEs的贴壁率差异显著(p＜0.05).以上数据表明,来源于MSCs的重构胚具有较高的发育潜能.     

5-Aza-CdR 联合TSA对牛核移植胚胎体外发育及表观遗传状态的影响

【目的】探讨5-氮杂-2′-脱氧胞苷(5-Aza-2-′Deoxycytidine,5-Aza-CdR)联合曲古抑菌素A(Trichosta-tin A,TSA)对牛核移植胚胎体外发育及其表观遗传状态的影响。【方法】以体外受精胚胎作为对照组,将部分体细胞、核移植胚胎以及体细胞联合核移植胚胎用5-Aza-CdR+TSA(5-Aza-CdR:20 nmol/L,72 h;TSA:50 nmol/L,12 h)进行处理,统计核移植胚胎体外发育率,并对2-细胞、8-细胞和囊胚阶段胚胎进行DNA甲基化和组蛋白乙酰化检测,研究5-Aza-CdR+TSA处理对核移植胚胎体外发育及其表观遗传状态的影响。【结果】与对照组相比,5-Aza-CdR+TSA单独处理供体细胞和核移植胚胎均可以显著提高克隆胚胎的囊胚发育率和囊胚细胞数(P<0.05);供体细胞和核移植胚胎均用5-Aza-CdR+TSA处理后,核移植胚胎体外发育能力进一步提高,囊胚发育率显著高于单独处理供体细胞或核移植胚胎组(P<0.05)。免疫荧光检测发现,体细胞和核移植胚胎均用5-Aza-CdR+TSA处理,不但显著降低了2-细胞和8-细胞阶段DNA甲基化水平,而且也显著增加了组蛋白乙酰化水平(P<0.05),使核移植胚胎附植前各发育阶段的表观遗传状态更接近于体外受精胚胎。【结论】5-Aza-CdR联合TSA处理供体细胞和核移植胚胎可以更明显地提高克隆胚胎的体外发育能力,改变核移植胚胎的DNA甲基化和组蛋白乙酰化水平,使它们的表观遗传状态及体外发育率更接近于体外受精胚胎。     

EGF和不同血清对牛卵母细胞成熟及核移植胚体外发育的影响

分离牛卵母细胞,分别用添加表皮生长因子(EGF)和发情牛血清(发情当天血清(OCS(0 d))和发情第7天血清(OCS(7 d)))的培养液进行成熟培养后去核,构建牛体细胞核移植胚并进行体外培养,研究EGF和OCS对卵母细胞成熟及核移植胚体外发育的影响。结果表明EGF添加组和OCS(0 d)添加组卵细胞的成熟率及核移植胚的卵裂率和囊胚率分别为74.5%,84.6%,25.9%和83.9%,78.8%,31.3%。在牛卵母细胞成熟液中添加EGF、OCS(0 d)更有利于牛核移植胚胎的发育。     

精氨酸对延边黄牛体细胞克隆重组胚发育的影响

为了提高延边黄牛体细胞克隆重组胚的发育率,试验研究了在体外培养液中添加不同浓度的精氨酸对重组胚发育的影响。选择形态良好排出第一极体的卵母细胞进行去核与注核操作,然后开始融合、激活,最后在添加不同浓度(0、0.061、0.132、0.264mmol/L)精氨酸的培养液中培养。结果发现,对照组与处理组之间重组胚的卵裂率和8-16C的发育率差异不显著,而囊胚的发育上,0.061mmol/L处理组显著高于对照组。表明体外培养液中添加精氨酸后能够促进体细胞克隆重组胚的发育。     

谷氨酸对延边黄牛体细胞克隆重组胚发育的影响

为了提高延边黄牛体细胞克隆重组胚的发育率,试验研究了在培养液中添加一定浓度的谷氨酸对延边黄牛克隆重组胚发育的影响。选择成熟了20～22 h并且排出第一极体的卵母细胞进行去核与注核,然后进行体外培养,观察卵母细胞的卵裂以及囊胚发育情况。结果显示,低浓度的谷氨酸能够提高重组胚的卵裂率,高浓度则抑制卵母细胞的卵裂;而囊胚的发育方面,低浓度的谷氨酸会降低其发育率。所以,添加适量浓度的谷氨酸能够提高延边黄牛体细胞克隆重组胚的发育率。     

黑熊-牛异种重构胚最佳供体的研究

选用不同代数的黑熊成纤维细胞(3～6、7～9、10～12代)构建异种重构胚,筛选出最佳供体细胞代数,根据卵裂率、多细胞胚发育率、囊胚率评价黑熊成纤维细胞质量.结果表明,7～9代组与3～6代组、10～12代组卵裂率、多细胞胚发育率差异显著,3～6代组和10～12代组差异不显著,3组囊胚率差异均不显著.说明7～9代黑熊成纤维细胞为最佳供体细胞代数,且异种重构胚发育率最高.     

马-牛无透明带卵异种克隆的研究

 【目的】开展异种克隆,为濒危动物的保护、细胞核重编程与核质互作研究提供新途径。【方法】以马耳成纤维细胞为供体,牛卵母细胞为受体,采用无透明带手工克隆方法构建异种胚胎,比较不同的激活液、培养液、体细胞同期方式、核移植方法对马-牛异种克隆胚胎体外发育的影响。【结果】（1）A23187 + 6-DMAP联合激活获得的克隆胚胎发育较好,囊胚率2.60%;（2）克隆胚胎于mCR1aa中的卵裂率和桑葚率显著高于CR1aa和SOF（83.65%vs 77.49%,74.87%;22.36%vs19.37%,18.98%,P＜0.05）,且发育到囊胚（2.72%）,CR1aa与SOF间无显著差异;（3）供体细胞经血清饥饿或接触抑制处理后,获得的异种克隆胚的融合率、卵裂率、桑葚率和囊胚率无显著差异;（4）无透明带手工克隆法的融合率显著高于显微注射法（90.33% vs 72.94%）,卵裂率、桑葚率和囊胚率无显著差异;（5）马-牛异种克隆胚与牛同种克隆胚比较,融合率和卵裂率无差别,桑葚率和囊胚率有显著差异（21.78%vs63.52%;2.71%vs37.48%）。【结论】牛卵母细胞能支持马体细胞去分化,进行核重编程。但由于二者的物种距离较远,异种克隆胚胎的发育能力远低于同种克隆胚胎。     

不同bFF对延边黄牛卵母细胞成熟及发育的影响

在成熟液中添加不同处理及来源的牛卵泡液(bFF),以研究其对延边黄牛卵母细胞体外成熟及重组胚发育的影响。结果表明:未抽滤组与抽滤组间成熟率差异不显著(P>0.05),但未抽滤组显著提高囊胚率(P<0.05);卵泡直径2~8 mm组、>8 mm组和混合组(2~8 mm组与>8 mm组的混合)之间成熟率、卵裂率和囊胚发育率差异不显著(P>0.05);两试验组(黄体组、卵泡组)成熟率、卵裂率和囊胚率差异不显著(P>0.05),两试验组与血清组相比囊胚率显著提高(P<0.05)。试验结果提示,未抽滤黄体期卵巢表面卵泡内bFF能有效提高卵母细胞体外囊胚发育率。     

卵母细胞和供核体细胞质量对牛体细胞核移植效率的影响

将未成熟牛卵母细胞进行体外成熟培养,挤压法去除卵母细胞核,以牛耳成纤维细胞作为供核细胞进行体细胞核移植研究,观察形成囊胚组与未形成囊胚组平均每卵巢获卵数、卵母细胞体外成熟率、供核体细胞细胞传代次数、饥饿天数的差异。结果表明:形成囊胚组平均每卵巢获卵数(4.90枚)和体外成熟率(63.9%)均显著高于未形成囊胚组(分别为4.05枚、48.4%)。形成囊胚组供核体细胞代数(4.7代)和血清饥饿天数(4.7d)与未形成囊胚组(分别为6.1代、4.4d)无显著差异。卵巢质量和卵母细胞质量是决定能否形成克隆囊胚的重要影响因素,在供体细胞传代3～8代、饥饿1～9d的范围内,供体细胞传代次数和血清饥饿处理时间对克隆效率无显著影响。     

体细胞核移植技术生产转基因猪胚胎的研究

以转染绿色荧光蛋白基因的猪胎儿成纤维阳性细胞作为体细胞核移植的核供体,体外成熟卵母细胞为核移植受体构建绿色荧光蛋白转基因克隆猪胚胎,研究供核细胞的处理、注核部位及重构胚融合/激活时间对转GFP克隆胚早期发育的影响.结果显示,胎儿成纤维细胞血清饥饿与非饥饿培养10 d处理组,采用卵周间隙核移植重构胚的卵裂率（82.35%和79.07%）差异不显著(P >0.05);体外培养42~44 h 卵母细胞进行胞质内和卵周间隙注核的重构胚胎,其卵裂率（81.11%和76.80%）差异不显著（P >0.05）;将卵周间隙注射法构建重构胚在0~1 h,2~4 h 和6~8 h 进行融合/激活操作,前2组重构胚卵裂率（75.61%和83.07%）无显著差异(P >0.05),但显著高于第3组（60.00%）的卵裂率(P <0.05).