悬铃木SSR反应体系建立及引物筛选

以三球悬铃木组培苗为试验材料,对影响SSR-PCR扩增效果的退火温度、dNTP、引物浓度、Taq酶量及悬铃木DNA等因素的筛选,建立适宜的悬铃木SSR-PCR分子标记反应体系。结果表明,在20μL-1体积中,50℃退火温度、4 ng.μL-1模板DNA、0.2 mmol.L-1 dNTP、0.05 U.μL-1 Taq酶量和0.6μmol.L-1引物浓度是悬铃木的最适SSR反应体系。此外,利用该体系筛选出了54对适合悬铃木SSR扩增的引物。     

蜡梅SSR反应体系建立及引物筛选

以素心蜡梅为材料,分别通过对影响蜡梅SSR扩增效果的模板DNA,dNTP,引物浓度,Taq酶和退火温度等因素的筛选,建立了其适宜的蜡梅SSR分子标记反应体系,同时筛选了适宜蜡梅SSR扩增引物.结果表明,蜡梅SSR扩增的适宜退火温度为55 ℃,在20μL反应体系中,蜡梅模板DNA质量浓度、dNTP引物浓度分别为5mg·L...     

荷花ISSR引物筛选及反应体系优化

利用加拿大哥伦比亚大学(UBC)公布的100条ISSR引物,以2个荷花品种的DNA为模板进行PCR扩增。采用单因素试验方法对荷花ISSR-PCR反应体系的5个因素(Mg2+、引物、dNTP、模板DNA、Taq酶)进行浓度优化,确定了荷花ISSR反应的25μL最佳扩增体系为:10×Taq Buffer 2.5μL,Mg2+3.0 mmol/L,dNTP 0.2 mmol/L,引物1.0μmol/L,Taq酶1.00 U,模板DNA 40 ng。筛选出8条扩增条带较好的ISSR引物,并对其引物进行梯度PCR试验,筛选出各引物对应的最佳退火温度,扩增共计获得61条ISSR条带。     

椰子SSR-PCR反应体系的优化

为进一步开发利用椰子种质资源和开展分子标记辅助幼苗早期筛选及遗传育种工作,采用L_9(3⁴)正交试验设计,探索了椰子SSR-PCR的最佳反应体系。通过对模板DNA、Mg4)正交试验设计,探索了椰子SSR-PCR的最佳反应体系。通过对模板DNA、Mg⁽²⁺⁾、dNTPs、Taq酶、引物、退火温度的筛选优化,建立了椰子SSR-PCR最佳反应体系(10μL)为:模板DNA 60 ng、Mg(2+)、dNTPs、Taq酶、引物、退火温度的筛选优化,建立了椰子SSR-PCR最佳反应体系(10μL)为:模板DNA 60 ng、Mg⁽²⁺⁾2.5 mmol/L、dNTP 250μmol/L、Taq酶0.5μmol、引物0.5μmol/L、退火温度58℃,在该体系条件下,PCR扩增条带最为清晰,该反应体系的优化,为今后应用SSR标记技术为椰子群体结构分析、种质资源丰富度、基因定位和遗传育种等研究奠定工作基础。     

椰子SSR-PCR反应体系的优化

为进一步开发利用椰子种质资源和开展分子标记辅助幼苗早期筛选及遗传育种工作,采用L_9(3~4)正交试验设计,探索了椰子SSR-PCR的最佳反应体系。通过对模板DNA、Mg~(2+)、dNTPs、Taq酶、引物、退火温度的筛选优化,建立了椰子SSR-PCR最佳反应体系(10μL)为:模板DNA 60 ng、Mg~(2+)2.5 mmol/L、dNTP 250μmol/L、Taq酶0.5μmol、引物0.5μmol/L、退火温度58℃,在该体系条件下,PCR扩增条带最为清晰,该反应体系的优化,为今后应用SSR标记技术为椰子群体结构分析、种质资源丰富度、基因定位和遗传育种等研究奠定工作基础。     

泡桐SSR分子标记反应体系的建立

以健康毛泡桐二倍体为材料,通过对影响SSR扩增效果的泡桐DNA,dNTP和引物浓度,Taq酶量及退火温度等因素的筛选,建立了适宜的泡桐SSR分子标记反应体系.结果表明,泡桐的适宜SSR分子标记反应体系中,退火温度为53℃,泡桐DNA质量浓度为0.05 mg·L-1,dNTP和引物浓度分别为0.1 mmol·L-1和0.3μmol·L-1,而Taq酶量和10×Taq酶缓冲液则为0.025 U·μL-1和2.0 mmol·L-1.     

梨SSR反应体系的优化

为了丰富梨分子遗传图谱的SSR标记,以鸭梨、京白梨及鸭梨×京白梨的实生后代为试材,对影响梨SSR技术PCR反应体系中的模板DNA用量、Mg2+浓度、dNTP浓度、引物浓度、Taq DNA聚合酶用量以及每对引物的退火温度进行了探索,确立了适宜梨的SSR反应体系,即在20 μL反应体系中, 模板DNA用量为30 ng,Mg2+、dNTP和引物的最适浓度分别为1.2 mmol/L、0.15 mmol/L、0.8 μmol/L.Taq DNA聚合酶的最适用量是1.0 U.最后利用该反应体系筛选出了19个适宜梨遗传分析的SSR引物,引物的最佳退火温度为49～55℃,通过8%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳进行检测,表明该反应体系扩增的多态性条带清晰稳定可靠.     

花生SSR-PCR体系的优化

以花生品种丰花3号为材料,研究了花生SSR技术中PCR反应体系的主要成分对SSR扩增效果的影响及不同引物的退火温度。结果表明dNTP对扩增影响较大,每对引物都有其扩增适合的退火温度。确立了适合花生SSR分子标记研究的优化体系。最终确定总反应体系为20μl,其中25mMMgCl21.5μl,2.5mMdNTP1.6μl,5U/μlTaq酶0.17μl,100ng/μl模板DNA0.4μl,2.5mM引物5μl。优化后的扩增程序退火温度为54℃。     

瓠瓜ISSR—PCR反应体系优化

利用正交设计L9(34),对瓠瓜ISSR-PCR反应体系的4因素(dNTP、引物、Mg2 、Taq酶)在3水平上进行优化试验,建立适合瓠瓜ISSR-PCR反应体系,结果表明,在25μL反应体系中,含1×PCR buffer、200μmol·L-1dNTP、0.5μmol·L-1引物、2.5mmol·L-1 MgCl2、30ng模板DNA、0.75U的Taq酶为最佳处理;通过PCR梯度测验,瓠瓜ISSR扩增适宜的退火温度比Tm值高2~6℃。     

均匀设计法优化人类SMN基因PCR扩增

采用均匀设计法,对影响PCR的主要因素,即退火温度、引物、Taq酶、二甲基亚砜(DMSO)、模板DNA进行了优化,得到人类SMN基因的最优PCR扩增体系。结果表明,PCR扩增条件和反应体系的最优组合为:退火温度61.6℃、Taq酶0.26μL、引物(10μmol/L)3.6μL、DMSO(100%)2μL、DNA 3.8μL。     

野生大麦ISSR-PCR反应体系的正交优化研究

利用SPSS建立正交试验体系,从Taq酶、Mg2+离子、dNTP、模板、引物的浓度5个水平对大麦ISSR反应体系进行优化,确定了适合大麦的快速高效ISSR反应体系。试验结果表明,在25μl反应体系中各反应成分为:0.5 U Taq酶,1μmol/L Mg2+,0.2μmol/LdNTP,0.3μmol/L引物,50 ng模板DNA。这一反应体系的建立对利用ISSR-PCR进行大麦种质资源的分类和新基因资源的挖掘打下了坚实的基础。     

萝卜EST—SSR反应体系的建立与优化

利用正交设计L16（4^5）对萝卜SSR—PCR反应体系的5因素（Taq酶、Mg^2＋、模板DNA、dNTP、引物）在4个水平上进行优化,获得了最佳反应体系,即20山反应体系中含有0．10mmol／LdNTP,3．0mmol／LMg^2＋,50ng模板,0．500μmol／L引物,1．0UTaq酶。使用优化的反应体系,扩增条带清晰,可满足不同引物组合和萝卜材料的要求。此研究为今后利用SSR技术对萝卜种质资源进行分类、构建遗传图谱和基因定位奠定了基础。     

苹果自交不亲和基因PCR扩增程序优化

通过研究PCR反应体系(DNA、Primer、Mg2+、dNTP、Taq聚合酶、buffer)及退火温度对苹果自交不亲和基因(S基因)扩增结果影响的分析,构建了适合于苹果自交不亲和基因的PCR扩增程序的优化体系。结果表明:在20μL的反应体系中,模板DNA的最适含量为40ng,dNTP最适浓度为0.25mmol/L,而Primer最适浓度为0.4μmol/L,Mg2+的最适浓度为2.5mmol/L,Taq聚合酶最适浓度为1U,buffer最适浓度为1×buffer,最适退火温度为50℃。     

甘薯ISSR-PCR反应体系的优化

为进一步利用ISSR-PCR标记技术研究甘薯种质资源的遗传多样性,针对影响ISSR-PCR反应体系的5个影响因子(模板、甲酰胺、dNTP、引物、TaqDNA聚合酶)进行了甘薯ISSR-PCR体系优化的正交试验设计研究.结果表明,处理10为比较好的组合,即在20 μL的反应体系中,含稀释浓度为10倍的DNA模板,0.30 mmol/L dNTP,1.00 μmol/L引物,1.00 UTaq酶,0.5%去离子甲酰胺比较适合甘薯DNA的特异扩增.     

麻疯树cpSSR标记技术的建立与体系优化

1材料与方法 1．1材料采自我国西南10个地区的麻疯树野生居群的枝条扦插（表1）,摘取幼叶用于提取总DNA。     

茶藨子总DNA提取及ITS-PCR体系的优化

利用Tiangen DP305试剂盒对茶藨子(Ribes L.)总DNA进行提取,应用单因子试验分析了DNA模板、dNTPs、引物和Taq酶对ITS-PCR扩增结果的影响,并建立了茶藨子ITS-PCR扩增反应的优化体系,最优反应体系为:25μL体系中,10×PCR buffer 1μL、Mg2+0.4 mmol/L、引物浓度0.5μmol/L、dNTP浓度为1 mmol/L、Taq酶的用量1.0 U、DNA模板用量为50 ng。优化后的反应体系可作为茶藨子属植物ITS-PCR的基本反应体系,为进一步开展茶藨子属的分类和系统发育研究奠定基础。     

菊芋ISSR-PCR反应体系的建立与优化

利用正交试验设计的方法,从Mg2+浓度、dNTPs浓度、引物浓度和Taq酶浓度4因素对菊芋ISSR-PCR反应体系进行优化分析,并在此基础上对模板DNA浓度及退火温度进行梯度检测。结果表明:菊芋20μl最佳反应体系包括10×PCR buffer,200μmol/L dNTP,0.5μmol/L引物,1.5 mmol/L Mg2+,1.0 U Taq DNA聚合酶和50 ng模板DNA。这一优化系统的建立,将为菊芋种质资源鉴定及遗传多样性的研究奠定基础。     

玉米品种真实性鉴定中SSR技术体系的优化

[目的]优化玉米品种真实性鉴定中的SSR技术体系。[方法]以11份玉米骨干自交系为材料,通过对影响SSR扩增质量的Mg2+、dNTPs、引物、TaqDNA聚合酶的浓度等因素进行优化和比较,建立了适于玉米品种真实性鉴定的SSR标记技术体系,并以5个玉米杂交种为例,验证该体系在玉米杂交种真实性鉴定中的可行性。[结果]Mg2+浓度为2.5 mmol/L时,扩增效果最佳。dNTPs浓度为0.3 mmol/L时,扩增效果最好。引物浓度为0.2μmol/L较为适宜。TaqDNA聚合酶浓度为1.0 U时,扩增效果较好。优化后的PCR反应体系为:1×PCR缓冲液,2.5 mmol/LMg2+,0.3 mmol/L dNTPs,0.2μmol/L正、反向引物,1.0 UTaqDNA聚合酶,40 ng样品DNA,总体积25μl。[结论]该研究优化的SSR技术体系可以有效地对玉米杂交种进行真实性鉴定。     

大蒜SSR体系的建立与优化

为建立适宜大蒜(Allium sativum L.)的SSR反应体系和扩增程序,应用L16(45)正交设计对影响SSR-PCR的主要参数进行优化。结果表明,适宜大蒜的SSR反应体系总体积为20μL,其中含TaqDNA聚合酶0.02 U/μL、引物为0.2μmol/L、Mg2+2.0 mmol/L、dNTP 0.2 mmol/L、DNA 30 mg/L;PCR适宜扩增程序为:94℃预变性3 min,94℃变性30 s,55℃45 s,72℃延伸90 s,35次循环,94℃变性30 s,53℃45 s,72℃延伸1 min,10次循环的最后一个循环延伸增加为10 min。并优化引物最适合退火温度为53.5~58.5℃。利用此反应体系对40份大蒜品种进行SSR扩增并电泳检测,扩增谱带清晰且多态性较好,证明此体系稳定可靠。在此基础上,利用优化的SSR反应体系对100对大葱SSR引物进行筛选,从中筛选出1对扩增谱带清晰稳定性好的SSR引物,并对40份大蒜品种进行遗传多样性分析。这一对SSR引物共检测出3个多态性条带可将供试材料聚为2大类,大部分品种(系)都按照其地理来源和遗传背景进行聚类。