广西巴马小型猪附睾成纤维细胞的分离培养和鉴定

为了建立广西巴马小型猪附睾成纤维细胞体外培养体系,利用微量液体组织块贴壁法原代培养分离附睾成纤维细胞,进行常规传代培养、冷冻和复苏,并通过接触抑制和解除抑制研究细胞的增殖能力,以及通过免疫荧光对其进行鉴定.结果表明,该法成功分离获得广西巴马小型猪附睾成纤维细胞,并可以大量传代和冷冻,目前已经传至55代以上,生长良好;冷冻复苏和接触抑制解除后仍可以正常培养和传代;细胞免疫荧光检测,波形蛋白表达阳性.可见,通过微量液体组织块贴壁法能成功分离得到广西巴马小型猪附睾成纤维细胞,在体外能稳定培养和传代.     

广西巴马小型猪体细胞核移植体系的建立

通过建立广西巴马小型猪体细胞核移植培养体系,为后续转基因克隆猪生产及其相关研究提供最佳条件.试验探讨了盲吸法对猪卵母细胞的去核效率;利用分离到的广西巴马小型猪附睾成纤维细胞作供体构建重构胚胎,探讨6-二甲氨基嘌呤(6-DMAP)和细胞松弛素B(CB)对其后续胚胎发育的影响;利用分离到的广西巴马小型猪腹部成纤维作供体,探讨其对核移植胚胎的发育效率.结果表明:猪卵母细胞盲吸法去核的效率为73.75％;广西巴马小型猪附睾成纤维细胞作供体构建重构胚胎,6-DMAP和CB对其后续胚胎发育没有显著差异(分裂率和囊胚率分别为:89.89％and 6.74％vs.82.95％and 5.68％,P＞0.05);腹部成纤维细胞作供体,重构胚胎的融合率、分裂率和囊胚率分别为55.40％、67.53％和6.49％.采用盲吸法可以对体外成熟猪卵母细胞成功去核,广西巴马小型猪腹部成纤维细胞和附睾成纤维细胞均可作供体成功构建体细胞核移植胚胎,并可以发育到囊胚.     

猪胎儿成纤维细胞的分离与基因转染

为利用核移植法获取转基因克隆猪提供供体细胞,体外分离培养猪胎儿成纤维细胞并进行了绿色荧光蛋白基因转染。首先采用组织块贴壁法分离培养猪胎儿成纤维细胞,绿色荧光蛋白表达载体以脂质法介导转染猪胎儿成纤维细胞,通过G418筛选获得稳定转染的细胞克隆,PCR鉴定外源基因在细胞基因组中的整合,利用荧光显微镜检测荧光蛋白的表达。结果表明,组织块贴壁后9 d可获取原代成纤维细胞,基因转染后利用G418筛选9 d即可获得转基因细胞,对转基因细胞进行传代,PCR检测显示荧光蛋白基因整合到细胞基因组中,荧光显微镜下观察到绿色荧光蛋白表达,为下一步通过核移植方法获得转基因猪提供了基础。     

藏猪耳部成纤维细胞的分离与培养

用组织块法分离培养藏猪耳部成纤维细胞,并进行体外传代和冷冻,冷冻复苏后的藏猪耳部成纤维细胞仍可以正常培养和传代,冻存前后活率都在90%以上;其生长曲线呈典型的“S”型,细胞接种后,在经历0-2 d的潜伏期后,第3 d细胞开始迅速生长,进入对数生长期,到第10 d细胞开始发生接触抑制,生长缓慢进入平台期。研究结果表明,已成功分离培养到藏猪的耳部成纤维细胞,这将为藏猪的体细胞克隆和保种等方面的研究奠定基础。     

体外培养枫径猪胚胎成纤维细胞系方法的建立

选取枫径猪胚胎,采用胶原酶消化培养法制备猪胚胎成纤维细胞,经数次传代培养及冷冻复苏试验表明胚胎成纤维细胞仍具有正常的传代能力。在体外培养至15代后成纤维细胞核型正常,符合体细胞克隆转基因的要求。用PCR方法建立了枫径猪胚胎成纤维细胞性别鉴定的反应体系,对其中6株细胞进行了性别鉴定。     

寿光黑鸡成纤维细胞的体外培养与冷冻保存

[目的]建立鸡成纤维细胞的体外培养体系。[方法]用组织块法和消化法分别分离培养鸡皮肤成纤维细胞;比较细胞生长速率及冻存复苏率。[结果]酶消化培养的成纤维细胞原代生长较快,约5 d便可形成单层;2种方法传代细胞的生长速度相似,仅需2~3 d就可形成单层;使用酶消化法和反复贴壁法,经3~4代后,可获得纯化的成纤维细胞;成纤维细胞经冷冻复苏后有75%~80%存活;分离纯化的胚胎和皮肤成纤维细胞的生长曲线均正常,可传至12代,传代后染色体数目不变。[结论]采用组织块法及酶消化法培养鸡成纤维细胞均可获得ES细胞建系所需的饲养层细胞。该研究为ES细胞系的成功建立奠定了基础。     

广西巴马香猪耳皮成纤维细胞的分离与培养

试验主要对广西巴马香猪耳皮成纤维细胞的分离和培养进行了研究.利用组织块法能够成功分离培养广西巴马香猪耳皮成纤维细胞,其大小范围在1～3 mm3,去除表皮有利于组织块贴壁和细胞的游出;而采用0.25%胰蛋白酶消化液4℃冷处理过夜,不仅有利于去表皮操作,减少取材处理时间,而且操作时间自由度大.在酶消化法中采用胰蛋白酶消化30 min,胶原酶继续消化30～40 min,能够成功分离培养广西巴马香猪耳皮成纤维细胞.广西巴马香猪皮肤成纤维细胞要经历滞留期、对数期、平台期,分别为0～2 d、2～8 d、8～12 d.     

Roscovitine同期化供核细胞对猴—猪异种核移植胚胎发育的影响

[目的]探讨Roscovitine同期化供核细胞对食蟹猴—猪异种体细胞核移植胚胎体外发育的影响,为提高灵长类的核移植效率奠定基础.[方法]活体采集4岁雄性食蟹猴的耳组织,经组织块培养获得纯化的食蟹猴耳成纤维细胞,细胞经固定、染色后用流式细胞仪分析细胞周期分布.以不同同期化方法处理的食蟹猴耳纤维细胞为供体细胞,以体外成熟、去核的猪卵母细胞为受体细胞,利用电融合法构建食蟹猴—猪异种核移植胚胎,观察异种核移植重构胚胎的体外发育情况.[结果]以15 μmol/L Roscovitine处理食蟹猴耳成纤维细胞24、48、72 h获得的G0/G1期细胞比率分别为76.51％、89.69％和90.49％,其中处理48和72h的G0/G1期细胞比率显著高于对照组（P＜0.05）.血清饥饿、接触抑制72 h同期化获得的G0/G1期细胞比率分别为91.12％和90.46％.Roscovitine同期化处理食蟹猴耳成纤维细胞48 h可有效提高食蟹猴—猪异种核移植重构胚胎的囊胚形成率（15.05％）,显著高于血清饥饿同期化处理和接触抑制同期化处理的效果（P＜0.05）.[结论]Roscovitine可有效同期化食蟹猴耳成纤维细胞在G0/G1期,最终提高食蟹猴—猪异种核移植重构胚胎的囊胚形成率.     

赤狐耳成纤维细胞的体外培养及核型分析

建立赤狐的耳成纤维细胞的分离和培养体系,为狐的核移植,转基因狐的研究奠定基础。采用组织块培养法分离狐耳成纤维细胞的原代细胞,再利用胰酶短暂消化法进行纯化传代培养,观察成纤维细胞的形态,并进行染色体分析。结果表明,组织块培养法可获得成纤维细胞,经过纯化培养,可获得均一、稳定的狐耳成纤维细胞。可以作为核移植的供体细胞,推动特种动物的转基因研究。     

延边奶山羊耳成纤维细胞体外培养的研究

为了给延边奶山羊转基因核移植及乳腺生物反应器研究提供足够且状态良好的细胞,采取延边奶山羊耳部组织块,利用组织块贴壁法进行原代培养和传代培养,对于纯化了的成纤维细胞观察其生长状态,并对4代以后的成纤维进行生长曲线、核型分析,并对细胞进行冷冻复苏试验,检测细胞活力.结果表明,4～13代体外培养成纤维细胞的细胞形态及核型基本正常,13代以后,细胞染色体变异比例增加,15代以后,细胞生长速度减慢;冷冻复苏后的细胞除生长速度减慢外,其它细胞生物学特征均正常,基本符合体细胞克隆、转基因等试验的基本要求,可以用于试验研究.     

小鼠胚胎干细胞培养体系的建立

通过探讨影响小鼠胎儿成纤维细胞饲养层制备及胚胎干细胞体外培养的若干因素，建立了小鼠胚胎干细胞体外培养体系，并建成小鼠ＥＳ细胞系     

食蟹猴耳部成纤维细胞体外培养体系的初步建立

建立食蟹猴耳部成纤维细胞的体外培养体系,为食蟹猴体细胞核移植、转基因技术及治疗性克隆做准备.通过组织块培养法进行原代培养,成功分离了食蟹猴耳部成纤维细胞;原代培养后用0.25%胰蛋白酶+0.02%EDTA消化液消化细胞,用含10%FBS的DMEM对细胞进行培养,细胞在体外传至第25代;用含10%FBS和10%DMSO的DMEM为冷冻液对细胞进行冷冻保存,解冻传代后,细胞形态和生长速度没有明显变化;用细胞技术法绘制细胞的生长曲线显示,符合体外细胞生长规律;用吉姆萨染色法对不同代数细胞的染色体倍性进行分析,二倍体细胞所占比例为80%以上.     

体外培养山羊成纤维细胞系方法的建立

用山羊组织块和0.25%的胰蛋白酶消化培养法获得正常传代细胞,对于出现的上皮样细胞和成纤维样细胞混合生长的问题,则根据两者贴壁紧实程度不同,用0.05%的胰酶-EDTA进行不同时间的消化,将其分离纯化。纯化的成纤维体细胞经数次传代培养后,进行冷冻解冻检验表明仍具有正常的传代能力。各代体细胞的核型分析表明,在体外培养至20~30代成纤维细胞的细胞形态(为梭形细胞,高度汇合后呈火焰状)、细胞周期以及核型均为正常,符合体细胞克隆转基因的基本要求。     

甜菜碱对三黄鸡胚胎原代成纤维细胞生长和增殖的影响

【研究目的】研究了不同剂量甜菜碱对三黄鸡胚胎原代成纤维细胞微核和增殖的影响,在细胞水平上揭示甜菜碱对三黄鸡生长影响的机理,为甜菜碱在动物生产中的应用提供依据。【方法】体外分离培养三黄鸡胚胎成纤维细胞,在培养液中添加不同剂量甜菜碱,观察细胞生长及分裂。【结果】①在基础培养液(DMEM 15%NBS)中添加10mM,20mM甜菜碱对三黄鸡胚胎原代成纤维细胞微核率无显著影响;添加30mM,40mM,50mM甜菜碱显著提高三黄鸡胚胎原代成纤维细胞的微核率。②在基础培养液(DMEM 15%NBS)中添加10mM、20mM甜菜碱能促进三黄鸡胚胎原代成纤维细胞的生长和增殖,以在培养液中添加20mM甜菜碱时三黄鸡原代成纤维细胞增殖速度最快。添加50mM甜菜碱时抑制了三黄鸡胚胎原代成纤维细胞的生长和增殖。【结论】低剂量甜菜碱可促进三黄鸡胚胎原代成纤维细胞的生长和增殖,高剂量甜菜碱对细胞分裂构成危害。     

牛和小鼠胎儿成纤维细胞混合制成的饲养层对牛胚胎干细胞的体外培养

【目的】建立适合的牛胚胎干细胞培养环境,保持其未分化状态,保证细胞的全能性。【方法】分别培养小鼠胎儿成纤维细胞（mouse embryonic fibroblast,MEF）和牛胎儿成纤维细胞（bovine embryonic fibroblast,BEF）,用丝裂霉素C处理两种成纤维细胞分别计数后按1﹕0、1﹕1、2﹕1、1﹕2和0﹕1的比例制成混合饲养层,观察牛胚胎干细胞的生长状态,并对生长在混合饲养层上的牛胚胎干细胞进行碱性磷酸酶,OCT4和SSEA-1免疫组化检测,OCT4、SOX2、NANOG mRNA 表达RT-PCR检测、体外分化形成拟胚体等试验。【结果】①生长在混合饲养层上的牛胚胎干细胞比单独生长在小鼠或牛胎儿成纤维细胞饲养层的结构致密、与滋养层界限明显;②小鼠胎儿成纤维细胞和牛胎儿成纤维细胞在1﹕1比例混合下牛胚胎干细胞克隆结构致密、显著堆积且边缘轮廓清晰优于其它比例组合;③获得的牛胚胎干细胞AKP染色及OCT4、SSEA-1抗原表达均成阳性,分别在体外分化培养形成了拟胚体。【结论】小鼠和牛胎儿成纤维细胞在以1﹕1的比例混合下制成的饲养层可更好地支持牛胚胎干细胞的体外培养,获得的克隆形态最好。     

北京油鸡骨骼肌卫星细胞的分离、培养、鉴定及成肌诱导分化的研究

【目的】探讨体外培养条件下北京油鸡骨骼肌卫星细胞分离、培养及鉴定的方法,建立适于北京油鸡骨骼肌卫星细胞体外扩增的培养体系,为今后进一步研究北京油鸡骨骼肌卫星细胞提供技术平台。【方法】以15日龄的鸡胚胸肌为材料,采用联合酶消化法分离骨骼肌卫星细胞,差速贴壁法纯化细胞,使用Pax7、Desmin、Myod等骨骼肌卫星细胞的特异性标志对所得细胞进行免疫荧光鉴定,随后进行成肌诱导分化,并比较了3种培养体系对骨骼肌卫星细胞增殖的影响。【结果】细胞免疫荧光鉴定结果呈阳性,证实所培养的细胞为北京油鸡骨骼肌卫星细胞;成肌诱导后,细胞相互融合形成多核的肌管,成肌特异性标志MHC表达呈阳性;对不同扩增培养体系比较,结果表明,培养体系DMEM/F12+15%FBS+2.5ng·mL-1bFG最有利于北京油鸡骨骼肌卫星细胞的增殖。【结论】该试验成功地分离并鉴定了北京油鸡骨骼肌卫星细胞,建立了适于北京油鸡骨骼肌卫星细胞体外扩增的培养体系,同时成功地进行了成肌诱导分化,为今后研究北京油鸡骨骼肌生长和发育的机理提供了技术平台。     

AIDS-Kaposi's sarcoma-derived cells express cytokines with autocrine and paracrine growth effects

When grown in vitro, cells from Kaposi's sarcoma lesions of AIDS patients (AIDS-KS cells) constitutively release several growth promoting activities. When inoculated into nude mice, the AIDS-KS cells induce a KS-like lesion of mouse origin. Here it is shown that the AIDS-KS cells express messenger RNA for a complex mixture of cytokines that correlate with several of the biological activities of these cells. Basic fibroblast growth factor, which is a potent angiogenic factor, and interleukin-1 messenger RNAs are expressed at very high levels and seem to account for a large proportion of the activities, since their corresponding proteins are released in biologically active form into the culture media where they induce autocrine and paracrine growth effects.     

5-hydroxytryptamine: a cytospecific growth stimulator of cultured fibroblasts

5-Hydroxytryptamine (serotonin) in micromolar amounts increased the growth of fibroblasts in culture while not affecting five other cell lines. Serotonin appeared to shorten the lag phase of cell growth. The effect was less when serotonin was added to the fibroblast culture after the initial 24-hour period. The two functional groups of the serotonin molecule were required for growth enhancement. Serotonin in millimolar concentrations was toxic to fibroblasts.     

转KAP6.1-GFP-蜘蛛拖丝蛋白基因核心序列4S 绵羊成纤维细胞株的筛选

 【目的】通过体细胞核移植为获得皮肤特异表达蜘蛛拖丝蛋白的绵羊奠定基础。【方法】将pcDNA3.1和带有角蛋白结合蛋白启动子质粒pGM-T-KAP6.1分别用Bgl Ⅱ和Hin d Ⅲ双酶切后连接,再与蜘蛛拖丝蛋白基因核心序列4S连接,最后通过酶切与pIRES2-EGFP质粒连接后构建真核表达载体pIRES2-EGFP-4S;将此载体线性化后,采用脂质体法转染绵羊皮肤成纤维细胞,通过G418筛选获得转基因阳性细胞。【结果】筛选得到转pIRES2-EGFP-4S的阳性细胞。对阳性细胞经体外培养后的检测显示：（1）细胞形态（长梭形）、细胞生长曲线（呈S形）、群体倍增时间（随培养时间增加逐渐缩短）和细胞接种率（细胞贴壁率及存活率在24 h内逐渐升高,并达到最高值125%）等均具有正常绵羊成纤维细胞的生物学特征;（2）阳性细胞经冷冻复苏后具有与新鲜阳性细胞相似的生物学特征;（3）PCR检测结果显示,pIRES2-EGFP-4S在阳性细胞的基因组中整合。【结论】获得具有在绵羊皮肤特异表达,且便于检测的转蜘蛛拖丝蛋白4S的绵羊成纤维细胞株。