四川小麦优良受体基因型筛选及农杆菌转化因素优化

为了丰富栽培小麦转化受体基因型,优化农杆菌转化小麦幼胚的技术体系,本研究评价了21份四川优良小麦品种(系)的幼胚再生能力,并以筛选到的最佳受体为材料,利用正交设计研究了预培养时间、菌液浓度、侵染时间、抑菌剂浓度、共培养方式和农杆菌菌株等易互作的6个因素对幼胚抗性愈伤再生率的影响,并探讨了筛选剂卡那霉素(Kanamycin)的适宜浓度。结果表明,21份材料中‘5157’、‘川农16’、‘R364’、‘川麦42’‘、内麦8号’的绿苗率超过了30%,可作为优良转基因受体加以利用。以‘5157’为受体材料建立农杆菌转化体系,正交试验表明菌液浓度和农杆菌菌株对幼胚抗性愈伤再生率的影响达到显著水平,而其他因素影响不显著。经优化后的遗传转化体系为:农杆菌菌株用C58C1,幼胚不经预培养,在菌液OD值为0.4的农杆菌中侵染40 min,共培养介质选用培养基,抑菌剂为200 mg/L羧卞青霉素(Carbenicillin),适宜的卡那霉素筛选浓度为50 mg/L。本研究为四川小麦遗传转化提供了5个候选基因型,为建立和优化小麦幼胚转化技术体系提供了理论依据,同时初步建立了农杆菌转化小麦幼胚的技术体系。     

小麦茎生长点转化研究初报

为了躲避转基因技术对组织培养的过分依赖,本研究以小麦为材料尝试了一种对生长点直接进行转化的方法,并初步证明了这一方法的可行性。具体做法是：将种子萌芽,然后剥去胚芽鞘暴露出生长点,再用玻璃纤维制作的小刷子将生长点刺伤,最后用带有外源基因的农杆菌进行侵染处理。用携带hph-GUS基因的LBA4404农杆菌,侵染处理1～11日龄幼苗(生长点),共培养7d后检测新生芽中GUS的瞬时表达情况;侵染1～2日龄幼苗(生长点),取长成植株的2～3朵小花进行GUS稳定表达检测。又用携带BADH和npt Ⅱ基因的AGL1农杆菌菌株侵染1日龄的幼苗(生长点),在含：100mg／L卡那霉素的蛭石中进行选择。结果表明,GUS的瞬时表达率随被处理幼苗的日龄增加而降低,以2日龄幼苗为最高(10．7％)。用花序检测GUS的稳定表达,被侵染受体为1日龄幼苗时的表达率高于2日龄的幼苗。蔗糖的存在并不提高GUS基因在花序中表达的频率。不过花序表现为GUS阳性的植株后代,经PCR检测后并没有证实GUS基因存在。用AGL1菌株进行转化,获得了13．6％的抗卡那霉素的绿色植株,但只有3株呈现PCR阳性,且只有1株结了实。     

西瓜‘SM1’高效遗传转化体系的构建

为构建高效的西瓜再生和遗传转化体系,本研究以西瓜‘SM1’材料子叶节为外植体,研究不同激素配比对子叶节再生的影响。在此基础上,通过农杆菌介导法导入外源基因,研究潮霉素浓度、农杆菌侵染时间、共培养时间等因素对遗传转化效率的影响,建立遗传转化体系。结果表明,‘SM1’不定芽分化最佳培养基为MS+6-BA 1.0 mg/L+IAA 0.1 mg/L,不定芽分化率为91.7%。最优遗传转化组合为农杆菌侵染时间15 min,共培养3 d,之后进行选择培养。外植体不定芽分化潮霉素最适浓度为10 mg/L,最适生根培养基为1/2MS+6-BA 0.1 mg/L+NAA 0.01 mg/L。通过潮霉素筛选和PCR鉴定,获得12株阳性转化株系,转化率为6.5%。本研究建立了高效西瓜‘SM1’再生及遗传转化体系,为进一步开展基因功能研究及西瓜遗传改良提供了技术支撑。     

多聚半乳糖醛酸酶反义基因转化加工番茄

利用农杆菌EHA105介导转化,将PG基因转入加工番茄B04植株。通过对影响外植体转化的因素（预培养时间、侵染时间、农杆菌浓度、共培养时间）进行了深入探讨,建立了加工番茄品种B04子叶外植体的高频遗传转化体系,并通过农杆菌介导法将PG反义基因导入加工番茄品种B04,获得PG抗性植株。其最佳预培养时间为2天;当农杆菌的菌液浓度为OD₆₀₀＝0.6、侵染时间为10 min时转化率最高;其最佳的共培养时间为2天。对获得的41株抗卡那霉素转基因植株进行PCR检测,其中9株为阳性植株,其转化率为22%。初步证实了部分加工番茄B04植株中已导入PG反义基因。     

根癌农杆菌介导的橡胶树花药愈伤组织遗传转化体系的建立

为建立根癌农杆菌介导的橡胶树遗传转化体系,以花药愈伤组织为受体,研究了农杆菌菌株、共培养温度、共培养时间、乙酰丁香酮(AS)等因素对遗传转化效率的影响。结果表明,农杆菌菌株、共培养温度和共培养时间对转化效率具有显著影响,AS不影响转化效率。2.2万个花药愈伤组织经EHA105菌株侵染后,转入未添加AS的培养基,22℃共培养6d,通过50mgL-1卡那霉素抗性筛选、叶片GUS染色、uidA和NptII基因PCR特异扩增、PCR产物测序及NptII基因Southern检测,鉴定出11株转基因植株,并通过嫁接和次生体胚发生,获得来自8个转基因株系的681株转基因植株,移栽成活253株。     

农杆菌介导的地被菊遗传转化体系的优化

本研究以地被菊‘北林黄’无菌苗叶片外植体为受体材料,以卡那霉素抗性基因为选择标记基因,对农杆菌介导的地被菊‘北林黄’的遗传转化体系进行优化。研究结果表明:选取植株中部叶片为转化受体,外植体在经过1d的预培养,用活化的OD600为0.6的农杆菌侵染10min,共培养2d,再经过3d延迟培养后转移到筛选培养基上培养,有利于提高遗传转化效率,外植体的愈伤组织获得数和抗性芽数均最高。在筛选后期,不定芽生根阶段使用的Kanamycin(Kan)选择压力为25mg/L。获得的部分Kan抗性植株经PCR检测,扩增出特异条带,初步证明目的基因已整合到‘北林黄’基因组DNA中。本研究将为进一步利用分子手段对地被菊进行遗传改良,并获得综合抗逆性提高的优异种质奠定基础。     

海岛棉两种转Bt基因方法的研究

 以新疆海岛棉军海1号为受体,利用农杆菌菌液喷雾法（Floral spray）和质粒注射法（Plasmid injection）导入外源Bt基因。经过对转化植株T₁和T₂代大田筛选和PCR、Southern检测,并经孟德尔遗传规律符合度分析,结果表示：农杆菌菌液喷雾法T₀代成铃率比质粒注射法高8.3百分点;两种方法均可获得转基因植株,农杆菌菌液喷雾法较质粒注射法转化率高3.4百分点;农杆菌菌液喷雾处理后代较符合孟德尔遗传规律且单拷贝插入几率高。因此,农杆菌菌液喷雾法优于质粒注射法。     

沙冬青脱水素基因转化紫花苜蓿的研究

为获得抗旱性较强的转基因苜蓿植株,以紫花苜蓿品种中苜2号作为基因转化受体,通过对外植体选择、菌液浓度、选择压确定、侵染时间和共培养时间等因素进行优化,成功建立了农杆菌介导的遗传转化体系。在此基础上,将沙冬青脱水素基因通过农杆菌的介导,转化到中苜2号中。试验结果显示,子叶和下胚轴作为外植体愈伤组织诱导频率最高,可达100%;获得抗性愈伤组织与转基因植株的卡那霉素最佳筛选浓度为25 mg/L;外植体与农杆菌的共培养时间以5 d为最佳。试验共获得126株T0抗性株,PCR检测30株表现为阳性,表明脱水素基因已转入受体植株中。     

小麦芽生长点的基因枪转化技术研究

为建立简易的不依赖组织培养和抗性筛选的小麦转基因技术,以小麦品种石4185为对象,以gus和badh/bar为外源基因,围绕适于基因枪转化的种子芽生长点受体的制备、基因枪轰击参数的优化等开展了试验,建立了"用解剖刀去除种子根、用镊子把芽鞘掰去、用镊尖扫去包盖生长点的未展开叶、将带生长点的部分与胚乳分离"为特点的受体制备方法;确定1 100 Psi+9 cm为最佳轰击参数组合.对轰击后的小麦芽生长点(70个×3批)进行gus基因瞬时表达检测,以受体数统计时,转化率为22.9%～35.7%;以生长点数统计时,转化率为5.7%～8.6%.用含badh/bar的pABH9质粒转化1 000个受体,发育成了802个T_0植株,对T_0植株所结种子长成的穗行喷200 mg/kg的PPT进行抗性筛选,获得了105个抗性株,究其来源为42个T_0株,由此计算抗性率为5.2%.用PCR检测T_1植株,6个呈阳性.初步建立了基因枪法转化小麦种子芽生长点的技术.     

‘晶瑶’草莓高效再生及遗传转化体系的建立

以草莓‘晶瑶’为试材,研究不同激素种类和浓度配比对叶片诱导愈伤、愈伤分化出芽的影响,建立‘晶瑶’草莓叶片的高效离体再生体系。结果表明,‘晶瑶’叶片在MS+2,4-D 0.05 mg/L+TDZ 2.0 mg/L的诱导培养基上不定芽再生率达到79.18%。在‘晶瑶’草莓遗传转化试验中,叶盘对卡那霉素的敏感性最适筛选浓度为30 mg/L,羧苄青霉素的最适抑菌浓度为400~500 mg/L,150μmol/L乙酰丁香酮的加入可提高GUS的瞬时表达率;10 min是最适合农杆菌侵染‘晶瑶’叶片的时间;共培养48 h对叶片转化较适宜,得到抗卡那霉素并呈GUS阳性的抗性芽频率为2.38%,获得了转化阳性植株。     

罗汉果遗传转化受体再生体系的建立及发根农杆菌转化初探

以罗汉果品种“青皮果”试管苗的茎段和叶片为外植体,研究适合于遗传转化的受体再生系统,并进行了发根农杆菌转化的初步研究。试验结果表明茎段的再生能力强于叶片,且对农杆菌敏感,是进行遗传转化合适的受体材料。在MS基本培养基附加BA 1mg/L、KT 1mg./L、NAA 0.2mg./L、蔗糖30 mg/L培养基中,20d龄的茎段不定芽诱导率为100%,平均每个外植体诱导的不定芽数达到9.7个,移苗成活率90%以上;外植体培养前的割伤处理有利于提高出芽数;发根农杆菌转化茎段诱导出毛状根。罗汉果毛状根的诱导和培养将为罗汉果药用成分的研究和开发提供新的途径。     

基因型和外植体对小麦离体培养的影响

为建立适合小麦遗传转化的高效离体培养体系,本实验用14个优良小麦新品种(品系)为材料,对不同基因型的小麦进行幼胚离体培养研究,通过培养基激素的变化,寻找最适合遗传转化的基因型及培养基成分;结果表明:不同基因型间差异显著,其中09P200和SH905在小麦离体培养中反应较好,幼胚愈伤组织绿原基分化率和出苗率显著高于其他基因型,可作为幼胚培养和转基因受体材料的优良基因型,在分化培养基中添加100mg/L水解酪蛋白、100mg/L脯氨酸和2.0mg/LKT对愈伤组织诱导分化及成苗效果较好,所有供试基因绿原基分化率、成苗率平均分别为31.93%和14.42%;另外采用4个不同基因型的小麦幼胚和成熟胚为外植体,通过继代次数的改变,筛选各外植体最适合遗传转化的培养条件;结果表明幼胚继代两次、成熟胚继代三次可以获得相对理想的绿原基分化率,且此时的愈伤组织是遗传转化较理想的受体材料。     

农杆菌介导法获得小麦转基因植株的研究

从gus基因的瞬时表达入手, 利用不同种类的农杆菌菌株感染小麦不同基因型和同一基因型的不同外植体, 研究了农杆菌菌系、小麦基因型和外植体对转化效率的影响. 从中优选出了对小麦愈伤组织感染力比较强的农杆菌菌系AGL0和MOG101, 以及高敏感受体基因型Alondra和扬麦158等. 实验结果还表明, 预培养10～15天的幼胚愈伤组织具有     

龙牙百合的植株再生与遗传转化

以龙牙百合鳞片叶切块为外植体，通过多种培养基的比较试验，得出MS 2，4-D 2mg／L 6-BA 0．2mg／L是诱导愈伤的最佳培养基，MS 6-BA 1mg／L NAA 0．05mg／L是不定芽诱导及伸长的适宜培养基。MS N_AA2mg／L是生根的最佳培养基。本试验已建立了适用于龙牙百合遗传转化的快速高频再生系统。用携带有几丁质酶基因和β—1、3葡聚糖酶基因的工程菌，通过农杆菌介导法和基因枪转化法转化龙牙百合，经PCR和点杂交检测证明外源基因已经整合到植物染色体中。同时对农杆菌介导法和基因枪法进行比较，发现农杆菌介导法的转化率为16．7％，基因枪法的转化率为50％，因此可能基因枪转化法更适于龙牙百合的遗传转化。     

甜菜直接再生体系的建立及优化

探究东北地区栽培甜菜直接再生体系的建立，以期为基因工程手段培育甜菜品种奠定基础。本研究以甜菜子叶节和叶柄为外植体，研究不同消毒方法、不同激素水平对诱导甜菜不定芽和不定根再生的影响。结果表明，最佳消毒方法为：剥除种球外壳获取种胚，并使用75%酒精30 s+0.1% HgCl2消毒10 min；诱导不定芽的最佳激素配比为：MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.05 mg/L，在此培养条件下子叶节和叶柄的不定芽诱导率均达最大值，分别为14.44%、11.67%；（3）诱导不定根的最佳激素配比为：1/2MS+NAA 0.05 mg/L，诱导率达到93.33%。本研究初步建立了东北甜菜直接再生体系，为下一步建立遗传转化体系及甜菜遗传改良奠定基础。     

菊花‘金不凋’再生及遗传转化体系的构建

‘金不凋’属于典型的日中性菊花,可作为日中性菊花开花分子机理的理想研究材料,目前尚未建立‘金不凋’的再生及遗传转化体系。本研究以‘金不凋’叶片为外植体,分别对影响再生及转化体系的主要因素进行试验。结果表明‘:金不凋’叶盘愈伤组织的不定芽分化最佳培养基为MS+6-BA 1.5 mg/L+NAA 0.5 mg/L,不定芽分化率为90.0%,平均再生不定芽数达5.5556个;相关性分析表明褐化率与愈伤诱导率以及平均再生愈伤组织数之间存在显著的负相关关系;试管苗最佳生根培养基为MS,生根率为100%。在‘金不凋’再生体系建立的基础上,初步建立了其遗传转化体系:‘金不凋’叶盘经过24 h预培养,在菌液浓度OD600=0.6的农杆菌中侵染10 min,共培养2 d,延迟培养5 d,叶片不定芽分化潮霉素临界浓度为2 mg/L,生根筛选潮霉素临界浓度为5 mg/L时,转化效率最高。通过潮霉素抗性筛选和PCR鉴定,获得3株PCR阳性菊花苗,转基因阳性苗频率为2.5%,本研究为‘金不凋’的基因工程育种提供了技术基础。     

夏枯草(Prunella vulgaris)组织培养和快速繁殖

以夏枯草的叶片、茎节、顶芽为外植体在含不同浓度的6-BA和NAA的MS培养基中培养,比较其增值率和分化率.发现以茎节为外植体,诱导不定芽的最佳培养基为MS 3.0 mg/L 6-BA 0.1 mg/L NAA,分化率为100%,增殖倍数为6.8.以顶芽为外植体,不定芽的最佳培养基为MS 3.0 mg/L 6-BA 0.05 mgm NAA或MS 3.0 mg/L 6-BA 0.1 mg/L NAA,分化率分别为88.2%和84.6%,增殖倍数分别为5.8和6.2.最佳生根培养基为1/4MS NAA 0.5 mg/L,生根率为100%.将生根的组培苗经过驯化移栽后,成活率为93%.表明,叶片难以分化;茎节的分化率效果最好;顶芽的分化能力介于二者之间.     

宁糯芋1号茎尖离体培养条件优化

为丰富福建省优质芋种源，加快优良品种推广应用，以‘宁糯芋1号’块茎顶芽和侧芽为外植体，运用茎尖分生组织培养获得了不定芽。在正交试验基础上，根据响应面分析法中心组合试验，以不定芽增殖系数为响应值，对TDZ、温度2因素进行优化，结果发现：与6-BA相比，TDZ更适于芋茎尖诱导丛芽，在MS培养基中附加0.1~0.2 mg/L的TDZ能显著促进芋茎尖的萌动，成苗率达76.7%~80.0%，经芋花叶病毒(DMV)检测试剂盒的ELISA检测表明脱毒率为90%；响应面优化结果表明，‘宁糯芋1号’不定芽继代增殖的最佳培养条件为 MS+TDZ0.31 mg/L，培养温度30.32℃，增殖系数预测值为9.08，验证得到的实际值为8.86。利用响应面方法可有效优化‘宁糯芋1号’不定芽继代增殖培养条件。