根癌农杆菌介导转Bt基因苎麻的获得及其抗虫鉴定

采用本研究室建立的根癌农杆菌介导的高效遗传转化体系,转化苎麻优良品种芦竹青,获得了转Bt基因苎麻候选植株。通过PCR和Southern杂交等分子检测,证明Bt基因已经整合到部分候选植株基因组中。选取PCR和Southern杂交均为阳性的部分株系(T₀)种植在大田,对这些植株进行室内抗虫鉴定并考察其主要农艺性状和品质性状,次年对T₁代植株进行PCR和Southern杂交检测。结果表明, 与对照相比,T₀代转Bt基因苎麻植株的抗虫性均强于对照,部分株系的抗虫性显著强于对照植株;且基本保持了亲本的优良性状;T₁代植株中也含有Bt基因,表明Bt基因能稳定遗传,且T₁代植株在大田的抗虫性明显强于非转基因植株。     

用基因枪法获得转异天南星基因aha抗蚜虫小麦

凝集素是一类具有特异糖结合活性的蛋白,对蚜虫等害虫有很强的抗杀作用。利用异天南星凝集素基因aha(Arisaema heterophyllum agglutinin)以及水稻Rubisco小亚基启动子,构建了aha基因植物绿色组织特异性表达载体,并采用基因枪转化方法, 与携带bar基因的pAHC20载体共转化到小麦品种科农199中。经过愈伤诱导、再生和筛选以及PCR鉴定,获得aha转基因植株42株,平均转化效率为2.41%。对转aha基因植株后代PCR鉴定表明,T₁代转基因植株的分离比例基本符合孟德尔遗传规律。利用室内多目标综合判别法评定抗蚜虫特性,8个T₁代转基因株系中有高抗材料1份,低抗材料3份,占参试比例44.4%。本研究为获得抗蚜虫转基因小麦新材料奠定了基础。     

多位点整合的转基因棉花后代分子鉴定

 GFP47是一个利用双元载体pPZP111构建的绿色荧光蛋白基因的简单质粒载体pPZP-GFP经农杆菌介导转化陆地棉(Gossypium hirsutum L.)获得的T₀株系,PCR和Southern杂交分析证实其不仅整合了多个拷贝的正常的T-DNA,而且有紧邻T-DNA左边界的载体骨架序列的整合。对来源于GFP47的33个T₁个体的PCR分析表明,T₁后代中可以分离只有正常T-DNA整合的个体。对T₁群体中不同基因型个体的Southern杂交分析结果显示,该多拷贝整合的T₀转化体至少在棉花基因组中有四个插入位点,不同的Southern带型暗示不同插入位点的T-DNA结构和排布有很大的不同。至少有一个位点整合了只包括目的基因和选择标记基因在内的正常T-DNA结构。     

来源于耐旱荒漠植物蛋白CkND对棉花黄萎病的抑制作用及其抗旱性研究

 利用蛋白组学策略分离了荒漠植物-牛心朴子（Cynanchum komarovii）抗病、抗旱功能相关蛋白CkND。以棉花黄萎病菌为供试菌株,研究了蛋白CkND对棉花黄萎病的抑制作用。结果表明：蛋白CkND对棉花黄萎病菌菌丝生长及孢子萌发具有较好的抑制作用。离体试验中,100 mg·L^-1的蛋白CkND对棉花黄萎病菌菌丝生长抑制效果在24 h、48 h、72 h分别为79.53%、83.01%、87.50％,35 mg·L^-1的蛋白CkND对孢子萌发抑制率为100%;活体试验中,蛋白CkND对棉花黄萎病具有显著的防治效果。另外,本研究将CkND基因构建到pCAMBIA1304表达载体CaMV35S启动子下游,将pCAMBIA1304-CkND通过农杆菌介导转化法转入野生型拟南芥植株中。将33个株系的转pCAMBIA1304 -CkND的 T₂代拟南芥和21株转pCAMBIA1304的T₂代拟南芥,同时进行抗旱性试验。结果显示,转pCAMBIA1304 的T₂代拟南芥14个株系枯死,而转pCAMBIA1304-CkND的 T₂代拟南芥有24个株系的转基因植株存活,且叶片保持绿色,植株生长良好,根系、须根发达,须根数目明显增多。转pCAMBIA1304-CkND拟南芥株高增加了30%,显著提高了植物抗旱性。     

转Rs-AFP2基因小麦的分子分析及其纹枯病抗性

Rs-AFP2属于r-硫堇类抗菌肽,主要通过形成离子通道直接破坏细胞来杀灭病原菌。本研究通过基因枪介导法结合对目标基因的分子检测,证明已将外源Rs-AFP2基因转入小麦推广品种扬麦12中。通过逐株抗纹枯病接种鉴定、PCR、PCR-Southern blot、Southern blot和 RT-PCR/荧光定量RT-PCR(Q-RT-PCR)分析,对转Rs-AFP2基因小麦T₁至T₄代植株跟踪检测。结果表明,Rs-AFP2在转基因小麦中能够稳定遗传,以单拷贝整合到小麦基因组中,遗传方式符合孟德尔遗传规律,并能在转录水平上表达。对转Rs-AFP2基因小麦的抗病性、主要农艺性状以及Rs-AFP2表达活性分析结果表明,与受体扬麦12相比,Rs-AFP2表达活性高的转基因小麦植株对纹枯病抗性有明显提高,其抗病性可以遗传,而主要农艺性状没有明显差异,证明可以利用Rs-AFP2基因和基因工程途径创制抗纹枯病小麦新种质。     

phaG和phaC基因在烟草叶绿体中的转化及其遗传分析

中长链羟基脂肪酸聚酯(medium-chain-length-PHAs, mcl-PHAs) 属于微生物聚酯。羟酰-CoA-ACP-转移酶和II型PHA合酶是mcl-PHAs生物合成途径中的两个关键酶。将编码羟酰-CoA-ACP-转移酶的基因phaG与水稻叶绿体psbA基因的启动子和终止子连接构建表达盒RpsbA-pro-phaG-RpsbA-ter,将II型PHA合酶的基因phaC与水稻叶绿体16S rRNA基因的强启动子Prrn及rbcL基因的终止子连接构建表达盒prrn-phaC-RrbcL-ter,连同壮观霉素抗性基因aadA表达盒prrn-aadA-TpsbA-ter一起克隆进烟草叶绿体基因组同源片段rbcL和accD之间,得到烟草叶绿体表达载体pTGC。用包裹有质粒pTGC的金粉子弹轰击烟草无菌苗叶片,经壮观霉素筛选后获得6株叶绿体型转基因植株。对T₀代和T₁代转基因植株进行PCR检测和Southern blot分析表明,外源基因已整合进烟草叶绿体基因组中,且T₁代转基因植株已同质化。RT-PCR分析结果证实外源基因已在转录水平上表达。转基因植株的自交及正反交结果表明,外源基因在转基因后代中能够稳定遗传,遗传方式遵循母性遗传规律,不存在转基因的花粉漂移现象。     

水稻蛋白二硫键异构酶基因沉默载体构建及其转基因后代的高温结实特性分析

采用RT-PCR法亚克隆了PDI基因保守区内450 bp的靶标序列作为干扰区段, 构建了含有内含子hpRNA (ihpRNA)的双元表达载体pTCK303-RiOsPDI, 经农杆菌介导转化日本晴, 获得转基因植株; 通过在T₀代对其潮霉素(Hyg)抗性基因的PCR鉴定, 确定携带有干扰片段的T-DNA区已整合到水稻基因组中, 且在转基因T₁代符合3∶1的分离模式。半定量PCR和荧光定量PCR的检测结果表明, PDI基因沉默转基因阳性植株不同器官中的PDI表达量均显著降低, 尤其是其籽粒中表达量较微, 几乎能引起靶基因80%左右沉默。对转基因T₂代植株的高温结实特性和籽粒理化品质的检测结果, PDI基因沉默会引起高温胁迫处理下结实率的大幅度降低, 耐热性显著下降, 但其在常温处理下的结实率与对照之间无显著差异。此外, PDI基因沉默后, 稻米的透明度下降、垩白度增加, 但对籽粒粗蛋白总量和直链淀粉含量的影响不甚明显。     

新疆高品质陆地棉纤维品质性状遗传分析研究

 以9-1696×CCRI 35配置单交组合及其衍生世代,利用该组合的P₁、P₂、F₁、F₂、B₁和B₂ 6世代群体的纤维品质性状,采用世代平均值法、主-多基因混合遗传模型分离分析法对该组合纤维长度、整齐度、比强度和伸长率4个纤维品质性状做遗传分析。结果表明：（1）4个纤维品质性状均以加性遗传为主,同时检测出显著的上位性效应。经模型适合性检验,纤维长度和伸长率两个纤维品质性状符合加性－显性－上位性遗传模型。比强度和整齐度性状符合加性－上位性遗传模型。（2）比强度和伸长率符合两对加性－显性－上位性主基因＋多基因混合遗传模型,其主基因遗传率分别为：比强度（47.80%）、伸长率（20.07%）。纤维长度和整齐度遗传受主基因和多基因共同控制。     

转TERF1和LeERF2双价基因旱稻及其逆境光合特性研究

为了提高旱稻干旱、盐及低温综合胁迫的抗性，构建了含有抗旱抗盐功能的TERF1和抗盐抗冷功能的LeERF2转录因子的双价植株表达载体；以秦爱、旱65和旱297三种旱稻品种为材料, 通过农杆菌介导法将以上两转录因子转入受体材料中，获得了经PCR及Southern检测证实同时整合双价基因的T₀及T_{1相似文献}   

农杆菌敏感小麦基因型的筛选及其转化

利用C58c1农杆菌菌株（其携带的pPTN290质粒载体上含有nptⅡ 基因和GUS基因）为供体材料和小麦幼胚为受体材料,对我国35个春小麦基因型进行了农杆菌敏感性研究和转化研究。组织化学染色结果表明,PM97034、P187、巴140105、扬麦158、新春9号和克丰6号等基因型农杆菌感染后GUS基因瞬时表达率达到了15.0% ~ 30.0%,显著高于模式基因型Bobwhite。其余幼胚分别在含10-25mg/L G418培养基上诱导愈伤组织和分化植株,抗性再生植株经ELISA检测、PCR检测、叶片离体退绿检测、X-Gluc染色检测和Southerm blot检测,最终从新春9号和PM97034的农秆菌转化效率高于Bobwhite. Southerm blot检测结果同时表明,外源基因在多数转基因植株中表现为单拷贝整合。T₁代植株ELISA检测结果和PCR检测结果表明,外源基因在个别株系中的分离符合孟德尔遗传规律,而在多数株系中的分离偏离了孟德尔遗传规律。阳性植株与阴性植株分离比经X²。适合性检测,表明外源基因在多数株系中的遗传符合3：1分离规律。本文首次对不同小麦基因型进行了农秆菌敏感和转化效率研究,筛选到新春9号和PM97034两个对农杆菌比较敏感且转化效率比较高的基因型,可望广泛用于小麦转基因研究。     

GUS基因和NPTⅡ基因表达的相关性及其在转基因棉花检测研究中的应用

利用农杆菌介导转化法,将含有35S启动子驱动NPTII基因和GUS基因以及棉纤维特异表达启动子E6驱动目的基因FB的植物表达载体转入到常规棉花R15中.重点分析了GUS基因和NPTII基因在愈伤诱导阶段、T0代及T1代转基因棉花中的表达情况.综合两个基因的表达来进行转基因棉花的阳性鉴定,可以为转基因棉花后代的纯合选育提供双重保障.7个转基因株系选育到T3代共获得株行51个,卡那霉素检测多数株行阳性率在90%以上,其中21个株行阳性率达100%.     

新疆奎屯棉花脱叶催熟剂的混用效果研究

为筛选适宜于新疆奎屯垦区棉花的最佳脱叶催熟剂品种,开展了不同脱叶催熟剂对棉花脱叶效果及产量品质影响的田间小区试验。结果表明,至喷施后20d,所有脱叶催熟剂处理的叶片脱落率均达到70%以上,且T1、T2与T3、T4棉花叶片脱落率差异不大,但T1、T2处理均显著高于单施乙烯利处理。各处理棉铃吐絮率均在90%以上,且不同脱叶催熟剂处理间差异不大,说明所有脱叶催熟剂的催熟效果均较好。喷施脱叶催熟剂后棉花产量、单铃重、衣分、子指、绒长、整齐度指数、断裂比强度、马克隆值、短纤维指数、棉纤维成熟度比等指标较对照无明显差异,说明喷施脱叶催熟剂对棉花产量及品质影响不大。从喷施次数来看,2次喷施的脱叶和吐絮效果略优于1次喷施,但差异不大;棉花品质较1次喷施有轻微降低。因此,综合比较来看,T1处理的脱叶、吐絮效果均较好,且瑞脱龙价格适中,适宜在新疆奎屯垦区大面积推广。     

棉花转基因材料的获得及主要农艺性状变异分析

 利用不同棉花受体材料进行花粉管通道法遗传转化研究。通过卡那霉素鉴定、抗虫性鉴定和PCR分子生物学鉴定,证明已成功将Bt基因转化到泗棉3号、辽棉15、中棉所19、中棉所29母本、中棉所35、中棉所36等棉花材料中。通过对转基因材料后代与非转基因材料的铃重、衣分和纤维品质等差异分析,发现花粉管通道转基因后代材料存在广泛的变异。     

Transge ne inheritance, segregation and expression in bread wheat

Transgene integration, inheritance and expression were studied in six transgenic wheat (Triticum aestivum) lines produced by co-bombardment with two plasmids containing marker genes and genes encoding HMW subunits of wheat glutenin, respectively. Transgene insertion number ranged from 1 to approximately 15. Within a transgenic locus the majority of plasmid copies were found at dispersed genomic sites separated by intervening DNA. However, evidence was obtained for the arrangement of introduced plasmid copies as concatamers and for plasmid truncation and rearrangement. Transgenes were frequently located in genetically unlinked chromosome sites, resulting in independent segregation of loci among progeny. In two lines this gave rise to progeny containing only the gene of interest. Transgenes were inherited in the T₁ generation as a dominant trait although Mendelian segregation ratios were not always observed. No evidence of co-suppression of endogenous HMW subunits was observed. This revised version was published online in July 2006 with corrections to the Cover Date.     

High Night Temperatures During the Floral Bud Stage Increase the Abscission of Reproductive Structures in Cotton

Cotton‐producing regions throughout the world often experience high night temperatures (HNTs), affecting flowering and yield in cotton (Gossypium hirsutum). The objective of this study was to quantify the effects of high nighttime temperatures on the physiological and biochemical characteristics of cotton during the floral bud and flowering stages. Growth chamber experiments were conducted in 2011–2012 and treatments included a control (day/night temperature of 32/24 °C) and two HNT treatments (32/29 °C from 8:00 pm to 12:00 am) for 3 weeks from the beginning of each phenological stage, i.e., first floral bud (B1) and first flower (F1). The results indicated that increased night temperatures (NTs) during the floral bud and flowering stages increased the rate of flower production per plant. However, no increase was observed in the final number of reproductive structures because the rate of floral abortion also increased for both treatments compared to the control. Additionally, the increase in night temperature during the floral bud stage reduced the sucrose content in the flower, resulting in decreased pollen viability and premature abortion of reproductive structures while the onset of flowering period was also delayed and lower accumulation of reproductive dry matter was observed. HNTs during the flowering stage reduced the number of seeds per locule and the number of seeds per boll. In general, higher than optimum NTs affected sucrose metabolism of the cotton flower and consequently its pollen viability. As a result the flowering period was delayed and a reduction in reproductive dry matter accumulation was observed due to premature abortion of reproductive structures. Finally, cotton is more sensitive to HNT at floral bud stage and this finding may be important to adjust cotton planting date, management and breeding.     

旱作棉田渗水地膜覆盖的生态及产量效应研究

采用地膜创新产品——渗水地膜,以普通地膜及露地为对照,对渗水地膜覆盖棉田后土壤水分、温度、通透性等生态因子的变化及其对棉花生理性状及产量的影响进行了初步探讨。结果表明:(1)渗水地膜覆盖除具有普通地膜的增温、保水、提墒以及改善土壤理化性状等作用外,更具有普通地膜所不具有的从膜面垂直入渗降水的作用,使全生育期土壤含水量具较高水平,水分供应充足,同时,由于渗水地膜的微通气作用,使土壤容重降低,孔隙度提高,气相比例增加,土壤通透性增强,土壤温度较为稳定。(2)渗水地膜覆盖进一步改善了棉田土壤水分、温度及通透性等生态环境,为棉花生长发育和产量形成提供了良好的生活条件。从多项生理指标的变化看出,棉花植株抗逆性增强。渗水地膜进一步提高了棉花覆盖栽培的增产潜力。(3)在北部特早熟棉区降水较多的年景下,渗水地膜覆盖棉花产量比露地增产22.3%,比普通地膜增产12.1%,增产效果显著。渗水地膜比普通地膜增产主要在于铃重的增加,普通地膜比露地的增产主要得益于衣分的提高,渗水地膜比露地的增产是得益于铃重及衣分的共同作用。渗水地膜与普通地膜相比并未增加投资。(4)在同等条件下,渗水地膜总耗水量比露地降低10.1%,比普通地膜降低6.5%。水分利用率比露地提高36.7%,比普通地膜提高20.7%,此结果对北方半干旱地区旱作棉花提高降水利用率及新疆内陆棉区灌溉条件下的棉田节水均有重要参考价值。     

农杆菌子房注射法对棉花的活体转化

采用根癌农杆菌直接注射子房,对8个棉花栽培品种进行活体方式的遗传转化.为了确立注射细菌的适宜时期,先采用含考马斯亮蓝染料的菌液对授粉前3d(-3 DPA,days post-anthesis)至授粉后2d(2DPA)的棉花子房进行注射,观察到细菌(染料)可以在-2 DPA至授粉后24h之间进入子房.为了避免注射对花柱的...     

棉花GhTCP2基因启动子分离及其在幼嫩组织的表达分析

 采用Genome walking的方法分离了GhTCP2基因的启动子区,应用在线分析软件PLACE对该启动子序列进行分析,发现含有多个与细胞周期、细胞分裂素、生长素相关的顺式作用元件。构建了GhTCP2基因启动子驱动报告基因GUS的植物表达载体并转化了模式植物拟南芥。转基因拟南芥的组织化学染色显示,GUS基因主要在根尖、幼叶、顶芽、侧芽和花蕾中表达。这说明棉花GhTCP2基因启动子可以驱动目的基因在植物的幼嫩组织表达,该启动子有望在植物抗虫基因工程中应用。     

烟草绒毡层特异启动子pTA29在棉花中的表达特性

烟草绒毡层特异启动子pTA29 (TA29 promoter)已用于多种植物雄性不育和花粉发育的研究。作为外源特异表达启动子pTA29在棉花中的表达特性尚不清楚,为了研究该启动子在棉花中的表达特异性,本文构建了pTA29:gus融合基因,并将其转入棉花。研究发现在GUS染液中添加10%的乙醇可以抑制棉花花药内源GUS活性。用改良的GUS染液进行组织化学染色表明,pTA29:gus转化植株的GUS活性主要存在于花药中,并在花蕾长为6 mm和15 mm的花药中有2个活性高峰,而在根、茎、胚珠、花瓣、苞叶中未被检测到。与烟草不同,在pTA29:gus棉花转化植株的叶片表皮毛和花粉中也能检测到GUS活性。定量RT-PCR分析表明转化子中gus基因的转录水平与GUS活性一致。上述结果表明,烟草绒毡层特异启动子pTA29可以控制下游基因在棉花花药中优势表达;在利用该启动子进行棉花基因功能以及雄性不育研究时,应注意该启动子在棉花中的表达范围和组织特异性。     

基于不同肥源的棉花减氮施肥效果比较研究

棉花生产中施氮量高、氮肥利用效率低的问题较为突出。以不施氮肥（CK）和当地习惯施肥（CF,施N 270kg/hm ²,普通复合肥）为对照,在田间条件下研究了生物有机复合肥（T1）、控释掺混肥（T2）、有机无机复混肥（T3）3种肥源减氮（N）20%对麦后移栽棉花生长、产量及氮素利用效率的影响。结果表明：T2处理整个生育期棉花最新完全展开叶净光合速率（P_n）均高于其他处理,且到花铃期显著高于CF。蕾期T1处理叶、茎、蕾干物质重显著高于其他处理,花铃期T2处理茎干物质重显著高于CK、T1和T3处理。花铃期棉株氮吸收量T2处理最高,分别比CF、T1、T3高27.0%、19.7%、36.5%,其中生殖器官（蕾、铃）氮吸收量亦是T2最高,分别比CF、T1、T3高46.1%、13.6%、35.3%。T2处理较CF显著增产3.4%,其氮肥表观利用率、氮肥偏生产力和氮肥农学利用率分别为28.6%、13.6kg/kg和5.6kg/kg,显著高于CF的19.0%、10.5kg/kg和4.1kg/kg,同时T2处理的产投比最大（3.7）,净收入最大（13 925.5元/hm ²）。