向日葵锈菌弹性金属蛋白酶基因克隆及生物信息学分析

为了研究向日葵锈病的致病机制,将向日葵锈菌转录组中表达量较高的一个基因(KU994904)中成熟部分进行生物信息学分析及基因克隆。利用Interpro对蛋白ORF区域进行分析,确定其成熟区域,通过生物信息学相关软件对其进行结构预测及预测分析,从向日葵锈菌中提取总RNA,并利用RT-PCR方法扩增此蛋白酶成熟基因并克隆。结果显示:该蛋白酶成熟基因序列全长1 335 bp,编码445个氨基酸,分子质量49.5 ku,其与M36家族中5条序列具有较高相似性,并发现同胞外金属蛋白酶基因序列相似度达到53.77%。因此,推断其为弹性金属蛋白酶。     

向日葵全基因组NBS抗病基因密码子使用偏好性分析

为分析了解向日葵(Helianthus annuus L.)核苷酸结合位点(nucleotide binding site,简称NBS)型抗病基因编码时各密码子的使用情况,以向日葵全基因组NBS型抗病基因的255条基因序列为来源,利用CodonW软件对每个基因序列进行密码子统计分析.结果表明,向日葵NBS型抗病基因使用A/T(U)结尾的密码子占比大于G/C结尾的密码子,且有效密码子数(effective number of codon,简称ENC)平均值为51.40,整体偏好性较弱,但第3位碱基偏好使用以A/T(U)结尾的密码子.从同义密码子相对使用频率(relative synonymous codonw usage,简称RSCU)分析得到第3位为A、T结尾的密码子占密码子总数(RSCU>1)的比例最高.ENC-GC3s分布图表明,碱基突变是影响密码子偏好性的关键因素.同时相关性分析结果还表明,ENC与A3s、T3s呈极显著负相关关系,多种不同分析都印证了向日葵NBS型抗病基因序列偏好于以A/T(U)结尾的密码子.分析向日葵NBS型抗病基因密码子偏好性,通过优化密码子来提高NBS抗病基因在向日葵中的表达,可为向日葵分子改造和抗病育种提供理论依据.     

转Rs-AFP2基因小麦的分子分析及其纹枯病抗性

Rs-AFP2属于r-硫堇类抗菌肽,主要通过形成离子通道直接破坏细胞来杀灭病原菌。本研究通过基因枪介导法结合对目标基因的分子检测,证明已将外源Rs-AFP2基因转入小麦推广品种扬麦12中。通过逐株抗纹枯病接种鉴定、PCR、PCR-Southern blot、Southern blot和 RT-PCR/荧光定量RT-PCR(Q-RT-PCR)分析,对转Rs-AFP2基因小麦T₁至T₄代植株跟踪检测。结果表明,Rs-AFP2在转基因小麦中能够稳定遗传,以单拷贝整合到小麦基因组中,遗传方式符合孟德尔遗传规律,并能在转录水平上表达。对转Rs-AFP2基因小麦的抗病性、主要农艺性状以及Rs-AFP2表达活性分析结果表明,与受体扬麦12相比,Rs-AFP2表达活性高的转基因小麦植株对纹枯病抗性有明显提高,其抗病性可以遗传,而主要农艺性状没有明显差异,证明可以利用Rs-AFP2基因和基因工程途径创制抗纹枯病小麦新种质。     

抗纹枯病、赤霉病的转TaPIEP1基因小麦的分子鉴定与选育

小麦纹枯病(主要病原为禾谷丝核菌)和赤霉病(主要病原为禾谷镰刀菌)已成为我国小麦生产的重要病害。TaPIEP1是从小麦中分离到的1个病原诱导的基因,其编码蛋白是可与GCC-box顺式元件结合、转录激活型的ERF转录因子。本研究以8个转TaPIEP1基因小麦株系的T₄和T₅代植株为试材,进行了外源转TaPIEP1基因的PCR检测、Southern杂交、RT-PCR与Q-RT-PCR的分析以及纹枯病菌、赤霉病菌接种与抗性鉴定。结果表明,外源TaPIEP1基因在转基因小麦中能够稳定遗传,以单拷贝或双拷贝整合到7个转基因小麦株系基因组的不同位点;外源TaPIEP1基因在转基因小麦中能超量表达;与受体扬麦12相比,TaPIEP1表达水平高的8个转基因小麦株系对纹枯病抗性显著提高,4个株系中一些材料对赤霉病抗性显著提高,3个株系中一些材料兼抗纹枯病和赤霉病,说明TaPIEP1正向参与了小麦对纹枯病和赤霉病抗性反应,利用该基因通过基因工程可创制抗纹枯病、赤霉病的小麦新种质。     

向日葵锈病抗性相关microRNA的挖掘及其靶基因预测

前期利用高通量测序技术及生物信息学分析方法，在向日葵上预测筛选到10个差异表达的新microRNA （miRNA）可能与锈病抗性相关。本试验利用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）技术，对筛选到的10个miRNA做进一 步的定量验证。结果表明，相比于水处理的健康叶片(对照组A)，接种锈菌300生理小种的叶片中（抗病组B）HanmiR21 、Han-miR25、Han-miR42表达量呈上调趋势，Han-miR11、Han-miR34、Han-miR43、Han-miR47、Han-miR67 表达量呈下调趋势；接种锈菌737生理小种的叶片中（感病组C）Han-miR25、Han-miR42的表达量呈上调趋势， Han-miR11、Han-miR21、Han-miR34、Han-miR43、Han-miR47、Han-miR67表达量呈下调趋势。qRT-PCR的检测 结果与前期高通量测序结果80%相一致。利用miRanda软件预测靶基因，10个miRNA共预测到117个靶基因，其 中86个靶基因获得其生物信息学功能注释。运用miRBase数据库，对10个新预测miRNA进行同源性分析发现，新 预测的10个miRNA与拟南芥、烟草、水稻等作物中参与病害逆境胁迫响应的miRNA有较高相似性（62%～100%）。 定量检测和验证miRNA作用的靶基因时发现，抗病组表达量上调的Han-miR21对应的靶基因有1个下调、表达量 下调的Han-miR43对应的靶基因有3个上调，符合miRNA与其靶基因互作的规律。     

12种杀菌剂对小麦赤霉病病菌的室内毒力及不同植保器械施药效果研究

近年来,小麦赤霉病在我国东北地区发生日趋严重,高效的药剂和植保喷雾器械的筛选将为生产上推广优化的防治模式提供依据.本研究选用12种杀菌剂采用菌丝生长速率法和孢子萌发法2种方法测定其对小麦赤霉病病菌的毒力和抑制效果,并以抑菌效果最好的药剂进行3种常用植保器械的田间防效测定.菌丝生长速率法的测定结果表明,25％苯醚甲环唑的EC50最小,抑菌效果最佳,430 g/L戊唑醇和50％氟啶胺效果次之.孢子萌发法的测定结果表明,25％苯醚甲环唑的EC50最小,对孢子萌发和芽管伸长抑制效果最好,其次是430 g/L戊唑醇、250 g/L嘧菌酯、50％氟啶胺,进一步对苯醚甲环唑采用3种植保器械对其施药效果进行测定,结果表明,自走式喷杆喷雾机的农药利用率最高,为81.98％,防效最好,达到80.60％.     

向日葵锈菌胞外金属蛋白酶的特性分析

为进一步了解锈菌侵染向日葵的致病机制,对向日葵锈菌（Puccinia helianthi）分泌的一种新型的金属蛋白酶（metalloproteinase,Mep）水解活性和生物学特性进行了表征。使用偶氮酪蛋白法测定蛋白酶的活性,在波长280 nm下测吸光度。结果表明,该蛋白酶对偶氮酪蛋白具有水解活性,纯酶最适温度和pH分别是50℃和7.0,在pH 5.0~9.0和温度50℃以下保持稳定。蛋白酶受到抑制剂乙二胺四乙酸二钠（EDTA）、乙二醇双（2-氨基乙基醚）四乙酸（EGTA）、1,10-菲咯啉的显著抑制; Ca²⁺、Zn²⁺、Mg²⁺可以显著提高该蛋白酶的活性,表明该酶为金属蛋白酶。另外,利用qRT-PCR试验测定了基因Mep在锈菌侵染向日葵的过程中的表达情况,结果显示,在接菌48 h时,基因表达量达到高峰,后逐渐降低,表明该蛋白酶参与了锈菌对向日葵的早期侵染过程。     

向日葵柄锈菌效应蛋白的预测及筛选

向日葵柄锈菌（Puccinia helianthi Schw.）引发向日葵锈病,对生产具有破坏性。为深入了解锈菌效应蛋白,研究病原与寄主的互作机理,在获得向日葵柄锈菌分泌蛋白组的基础上,利用生物信息学软件预测及分析向日葵柄锈菌效应蛋白,采用qRT-PCR检测其中7个候选效应蛋白基因在接种叶片中的相对表达量。结果表明：在供试的900个锈菌的分泌蛋白中预测到候选效应蛋白497个。基因特征分析显示,开放阅读框长度在200～399 bp之间的最多;信号肽长度集中在16～27个氨基酸残基（占92.96%）;信号肽氨基酸组成中亮氨酸出现频率最高,其次为丙氨酸、异亮氨酸;信号肽识别位点以SpⅠ型为主。本研究获得了7个向日葵柄锈菌的效应蛋白,qRT-PCR检测表明柄锈菌接种向日葵叶片后,与纯孢子相比,这7个效应蛋白编码基因均上调表达,说明其参与了锈菌侵染向日葵的过程。     

枯草芽孢杆菌S-16产抗菌蛋白发酵条件优化及蛋白分离纯化

以抑菌率为指标,采用单因素试验和响应面法对枯草芽孢杆菌S-16菌株产抗菌蛋白的发酵条件进行优化.结果表明,以可溶性淀粉为碳源,大豆蛋白胨为氮源,初始pH值为7.5的LB液体培养基,接种量为4.74％,在温度为34℃条件下振荡培养53 h,转速为200 r/min为菌株最佳发酵条件.在此条件下纯化得到的抗菌蛋白分子量约为35 ku,对向日葵核盘菌抑菌率达58.6％,比优化前提高了3.19倍.稳定性试验结果表明,抗菌蛋白0～80℃、pH值为2～10时均有抑菌活性,说明该蛋白具有很好的热稳定性和酸碱稳定性.     

不同哈密瓜品种对细菌性果斑病抗病性及发展动态的研究

为明确不同哈密瓜品种对果斑病的抗病能力,采用人工接种和田间自然发病2种方法测定了13个哈密瓜不同品种对细菌性果斑病的抗病性。结果表明,供试的13个哈密瓜品种对细菌性果斑病的抗病性存在显著的差异,其中超早丰F1为高抗品种,华夏密宝、甘密宝、西域甘露IIF1、红脆宝、泰丰密和玉金香为中抗品种,骄密二号、早皇后、金龙花为中感品种,新密杂十一号、新密雅7号、金8_4为感病品种,没有对果斑病完全免疫的品种。通过田间发病情况系统调查分析得知,生产中感病品种发病早,病情发展速度快,病情指数高;抗病品种发病晚,病情发展缓慢,病情指数低。