沙冬青脱水素基因转化紫花苜蓿的研究

为获得抗旱性较强的转基因苜蓿植株,以紫花苜蓿品种中苜2号作为基因转化受体,通过对外植体选择、菌液浓度、选择压确定、侵染时间和共培养时间等因素进行优化,成功建立了农杆菌介导的遗传转化体系。在此基础上,将沙冬青脱水素基因通过农杆菌的介导,转化到中苜2号中。试验结果显示,子叶和下胚轴作为外植体愈伤组织诱导频率最高,可达100%;获得抗性愈伤组织与转基因植株的卡那霉素最佳筛选浓度为25 mg/L;外植体与农杆菌的共培养时间以5 d为最佳。试验共获得126株T0抗性株,PCR检测30株表现为阳性,表明脱水素基因已转入受体植株中。     

提高农杆菌介导法将PinII抗虫基因导入滇型水稻的转化效率

本论文对滇型水稻品种玉优一号、HT-7的愈伤组织诱导、基因转化及植株再生进行了研究。通过实验，将质粒pCAMBI1300上带有的PinⅡ抗虫基因导入水稻愈伤组织细胞中，获得了一批Hyg抗性植株。185株抗性苗经过PCR检测和叶片对潮霉素的抗性试验，证明其中有59株为转基因阳性植株。结果显示，受体、农杆菌状态以及共培养方式等是影响基因转化效率的关键因素；以叶片对潮霉素的抗性作为转基因植株的快速筛选是可行的，大大提高了检测效率。     

根癌农杆菌介导获得稗草Ecppc转基因小麦的研究

采用携带pUbi-Ecppc质粒的3个根癌农杆菌菌株（LBA4404、EHA105和C58c1）,对经过预培养10~12 d的春小麦品种扬麦158、Bobwhite和扬麦12的幼胚愈伤组织进行了遗传转化。对筛选中的抗生素浓度、菌液浓度、共培养温度和时间、受体基因型、菌株-质粒组合等影响转化的重要因素进行了研究。首次将单子叶野生C₄植物稗草的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因（Ecppc）导入小麦受体基因型,并得到具有潮霉素（Hyg）抗性的转化植株。从816块共培养愈伤组织中转化得到34株抗性植株,其中14株PCR检测为阳性。扬麦158的转化效率达3.03%。Southern和RT-PCR分析表明外源基因已整合到小麦基因组并得到正确的转录。生理学检测显示,转基因小麦植株的光合速率和PEPC活性都有所提高。说明Ubiqintin基因启动子控制的稗草PEPC cDNA基因在小麦中可以正确表达和起到一定的生理作用。这些工作为进一步探讨PEPC对小麦光合作用及其他生理过程的影响奠定了基础。     

玉米淀粉分支酶SBEIIb基因遗传转化玉米自交系的研究

以玉米自交系丹黄25为试材,用农杆菌介导法将玉米淀粉分支酶SBEIIb基因转入玉米中,探讨了农杆菌介导玉米愈伤组织转化的影响因素.结果表明:愈伤组织经过9d的继代,菌液中乙酰丁香酮(AS)浓度为10 mg/L,侵染时间为20 min,共培养60 h为最佳转化条件.获得的4株再生植株经PCR分析鉴定,其中3株表现阳性,证...     

细胞转化获得转白细胞介素-4基因胡萝卜(Daucus carrot)

本研究以胡萝卜‘开拓者’无菌苗胚轴诱导的愈伤组织经振荡培养获得悬浮培养细胞为受体材料,以卡那霉素抗性基因为选择标记基因,对农杆菌介导的胡萝卜细胞遗传转化体系进行了优化。结果表明:悬浮细胞预培养1~3d,胡萝卜细胞与农杆菌细胞比例为1:10或1:100,共培养时间为1~3d时,转化效率较高;但以悬浮细胞预培养1d,胡萝卜细胞与农杆菌细胞比例为1:10,共培养时间为1d时,可得到较多的转化苗。共获得抗性苗290株,经PCR检测66株扩增出特异性条带;部分阳性植株经PCR-Southern检测,初步证明目的基因已转入到胡萝卜中,并收获了转基因胡萝卜。     

以抗除草剂Bar基因稳定转化谷子技术研究

农杆菌介导的谷子遗传转化效率一直是制约谷子功能基因研究及转基因育种效率的主要因素。本研究以冀谷11谷子幼穗为外植体, 选取0.5~1.0 cm的幼穗, 切成0.5 cm左右的小段, 置改良后的MS培养基上诱导15~20 d形成胚性愈伤组织3120块。愈伤组织侵染转化前用侵染液悬浮浸泡, 并经45°C热激预处理3 min, 可以有效提高26.1%的瞬时遗传转化效率。将转化后的愈伤组织经草丁膦(PPT)筛选后获得513块抗性愈伤组织, 抗性愈伤组织获得率为16.4%。抗性愈伤组织经分化、壮苗培养后获得7株抗性植株, 经PCR和Southern杂交检测得到6株T₀代转基因阳性株, 对T₃代转化植株叶片进行PPT抗性分析, 并结合Bar蛋白抗体试纸条鉴定, 表明Bar基因已稳定整合到谷子基因组中。本研究建立了农杆菌介导转化谷子优良品种的遗传转化体系, 对提高谷子转基因育种效率和谷子模式研究系统的建立有重要意义。     

根癌农杆菌介导获得稗草Ecppc转基因小麦的研究

采用携带pUbi-Ecppc质粒的3个根癌农杆菌菌株（LBA4404、EHA105和C58c1），对经过预培养10~12 d的春小麦品种扬麦158、Bobwhite和扬麦12的幼胚愈伤组织进行了遗传转化。对筛选中的抗生素浓度、菌液浓度、共培养温度和时间、受体基因型、菌株-质粒组合等影响转化的重要因素进行了研究。首次将单子叶野生C₄植物稗草的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因（Ecppc）导入小麦受体基因型，并得到具有潮霉素（Hyg）抗性的转化植株。从816块共培养愈伤组织中转化得到34株抗性植株，其中14株PCR检测为阳性。扬麦158的转化效率达3.03%。Southern和RT-PCR分析表明外源基因已整合到小麦基因组并得到正确的转录。生理学检测显示，转基因小麦植株的光合速率和PEPC活性都有所提高。说明Ubiqintin基因启动子控制的稗草PEPC cDNA基因在小麦中可以正确表达和起到一定的生理作用。这些工作为进一步探讨PEPC对小麦光合作用及其他生理过程的影响奠定了基础。     

提高农杆菌介导的籼稻成熟胚愈伤组织再生频率研究

为了提高籼稻红莲型保持系粤泰B(YTB)成熟胚愈伤组织再生频率和遗传转化效率,利用培养基种类、菌液浓度、侵染方法、共培养方法、愈伤组织干燥处理方法、筛选剂浓度等6个方面设计农杆菌不同的培养条件进行试验。结果表明：LB和YEB培养基都可以作为农杆菌的培养方法;真空负压处理可以明显提高转化率;共培养时在共培养基上加滤纸有利于后续的除菌工作,能够提高转化效率;愈伤组织经过适当的干燥处理可以明显提高转化效率;适宜的潮霉素浓度在40~50 mg/L之间;采用V型筛选的方法,可以使转基因植株的阳性率有所提高。总之,通过对农杆菌培养条件的优化能有效地提高农杆菌介导的籼稻成熟胚愈伤组织再生频率。     

农杆菌介导法将DREB2A基因转入玉米

通过农杆菌介导法将耐盐基因DREB2A转入玉米自交系H99以及杂交种H99×A188中,同时研究了农杆菌浓度、侵染时间和AS浓度等因素对转化效率的影响。研究表明:农杆菌菌液浓度在OD值为0.5~0.6时农杆菌感染能力最强,适宜的侵染时间为20min;共培养基中乙酰丁香酮(AS)的适宜浓度为150μmol/L。通过该优化体系获得的转基因植株110株,经PCR分析鉴定,其中5株表现阳性,初步证明外源基因已经整合到玉米基因组中。     

根癌农杆菌介导的花魔芋遗传转化体系的研究

本研究以潮霉素抗性基因为选择标记,建立了根癌农杆菌介导的花魔芋(Amorphophalluskonjac)的遗传转化体系。同时探讨了魔芋愈伤组织的培养基、筛选剂和筛选时间等因素对转化效率的影响。通过筛选时间不同的两个转化试验,分别从300个花魔芋愈伤组织中得到了16个和18个具有潮霉素抗性的愈伤组织,其抗性愈伤率为5.33%和6.00%。获得的抗性愈伤组织进一步在分化培养基上进行分化,其分化效率分别为31.2%和22.2%。移栽后,分别得到了39株和36株成活植株。PCR检测表明分别有26株和21株再生花魔芋出现了800bp的特异性扩增带型,其阳性率分别为66.7%和58.3%。随机挑取20个PCR阳性植株的DNA进行斑点杂交检测,结果表明外源基因已经整合到花魔芋的基因组中。     

Agrobacterium-mediated transformation of Japanese lawngrass (Zoysia japonica Steud.) containing a synthetic cryIA(b) gene from Bacillus thuringiensis

Transgenic Japanese lawngrass plants containing a synthetic cryIA(b) gene from Bacillus thuringiensis under the control of a maize ubiquitin promoter were developed by Agrobacterium -mediated transformation. A total of 1540 embryogenic calluses derived from dormancy-removal mature seeds were co-cultured with the disarmed strain EHA105 harbouring the binary vector pKUB. Three days after co-culture with EHA105 in the dark at 21°C, transient β -glucuronidase (GUS) expression frequency was 74.2%. After selection with 100 mg/l hygromycin B, a total of over 50 independent resistant cell clones and 25 regenerated plants were obtained. The integration and expression of the cryIA(b) gene into the genome was confirmed in 22 regenerated plants by the GUS histochemical assay, PCR amplification, Southern blotting and Western blotting analysis, with a transformation efficiency of 1.4%. The entire process from callus induction of mature seeds to production of transgenic plantlets was 80–100 days. T₁ progeny segregation analysis of these transgenic lines demonstrated that 59.1% of the transgenic events were inherited in a typical Mendelian fashion.     

农杆菌介导的半夏GUS基因瞬时表达

采用根癌农杆菌感染半夏无菌叶片、叶柄和愈伤组织,对GUS基因的瞬间表达进行研究,并分析了不同转化受体、感染时间、菌液浓度、共培养、预培养时间、菌种对GUS基因的瞬间表达的影响。结果显示,以半夏的无菌苗叶柄和愈伤组织,在OD值为0.2的EHA101或EHA105农杆菌液中感染15 min,叶柄暗处共培养3 d,愈伤组织2 d,能够得到较高的GUS基因瞬间表达。     

根癌农杆菌介导的巴西橡胶树胚性悬浮细胞的遗传转化

为了建立橡胶树胚性悬浮细胞遗传转化体系,用根癌农杆菌EHA105（携带pCAMBIA1301,含有gusA和hpt Ⅱ）侵染胚性悬浮细胞团,用GUS检测的方法分析了共培养时间和菌液浓度对转化效率的影响;同时,测定了胚性细胞团对潮霉素敏感性。结果表明适宜的共培养时间为3天,适宜的菌液浓度为OD600=0.4~0.6。潮霉素的致死剂量为15 mg/L。使用大约1 g鲜重的胚性细胞团,经过转化和选择培养,获得53块抗性愈伤组织,经诱导获得7个体细胞胚。GUS检测和PCR鉴定证实了gusA基因已经整合到橡胶树基因组中。本研究为根癌农杆菌介导的橡胶树胚性悬浮细胞遗传转化体系建立奠定了基础。     

玉米成熟胚胚性愈伤组织的诱导、高频再生及转化的研究

以玉米自交系CML295、CML304和18-599R的成熟胚为外植体, 结合幼胚离体培养方法, 探讨并优化了成熟胚来源的胚性愈伤组织诱导及继代培养方法。对其愈伤组织的形态和组织切片的研究结果显示, 继代过程可产生良好的Ⅱ型胚性愈伤组织。在分化培养中分别获得68.6%、75.4%和84.8%的高频再生率, 每愈伤组织块成苗数分别为2.45、2.43和2.75。利用基因枪法转化pCAMBIA1301质粒后的GUS瞬时表达效率分别为57.9%、62.5%和73.1%, 转化pCAMBIA1303质粒后检测GFP的瞬时表达效率分别为23.3%、40%和45.5%。以上3种基因型成熟胚来源的愈伤组织转化率与其对应的幼胚来源的胚性愈伤组织转化率相似。这一技术体系为玉米的遗传改良和功能基因组研究提供了重要的技术平台。     

农杆菌介导玉米遗传转化体系的研究

为了提高玉米自交系的遗传转化率,建立农杆菌介导玉米遗传转化体系。通过农杆菌菌株EHA105侵染玉米自交系7922的胚性愈伤组织,以β-葡萄糖苷酶基因(GUS)为报告基因研究几种因素对遗传转化体系的影响。结果表明：（1）当农杆菌浓度OD600=0.6时,GUS瞬时表达率最高为35.3%;（2）当侵染时间为15 min时,GUS瞬时表达率最高为37.3%;（3）当共培养时间为3天和恢复培养时间为4天时,GUS瞬时表达率最高为29.1%。因此选择农杆菌浓度OD600=0.6,侵染时间15 min,共培养3天和恢复培养4天,为最佳遗传转化条件。通过优化影响遗传转化体系的因素,初步建立了农杆菌介导的玉米遗传转化体系。     

农杆菌介导谷子成熟胚遗传转化体系的建立与优化

为建立一个稳定的谷子遗传转化体系,对216份谷子种质资源进行筛选,确定材料178成熟胚为受体材料,从植物激素浓度、防褐化剂、农杆菌菌液浓度、侵染时间、乙酰丁香酮（AS）浓度等方面对谷子再生及转化体系进行优化。结果表明,在MS培养基中加入生长素2,4-D 9μmol/L、细胞分裂素Kinetin 4μmol/L、硝酸银8mg/L,愈伤组织诱导率最高且能有效防止褐化。在侵染液和共培养基中加入100μmol/L AS,gus表达效果最好。农杆菌溶液OD₆₀₀为0.3~0.5,侵染15min,共培养3d时,抗性愈伤组织率最高。获得的转基因植株,经PCR检测及gus染色分析,确定外源bar基因已成功整合到谷子基因组中。初步建立了一套谷子遗传转化体系,为今后谷子遗传转化提供一些参考。     

Regeneration and transformation of cassava

A prerequisite for the development of a successful transformation system is the availability of efficient regeneration systems. Up to 1995 the only available regeneration system in cassava was an organized type of somatic embryogenesis. Transformation of these organized somatic embryogenic cultures with particle bombardment or Agrobacterium tumefaciens resulted in chimeric transformed embryos. However, the transformed sector was lost after repeated cycles of secondary somatic embryogenesis. After 1995 a less organized system of somatic embryogenesis was developed, so called friable embryogenic callus (FEC) and a system of adventitious shoot regeneration. The FEC regeneration system was combined successfully with particle bombardment. Selection of transgenic plants was based on either luciferase activity, or resistance to the aminoglycoside paromomycin or the herbicide phosphinothricin. Furthermore, protoplasts of FEC are able to regenerate into plants and can be transformed by electroporation. The adventitious shoot regeneration system was combined successfully with Agrobacterium tumefaciens. For this mature somatic embryos were cocultivated with Agrobacterium and cultured for adventitious shoot development. After selection based on the aminoglycoside geneticin or on hygromycin transgenic plants were formed. This revised version was published online in July 2006 with corrections to the Cover Date.     

35S启动子甲基化引起棉花转基因沉默

 用带PBI121质粒的农杆菌LBA4404菌株转化泗棉3号胚性愈伤组织,获得的再生植株进一步对gus和nptⅡ基因进行PCR跟踪检测,共得到97株阳性转基因植株。GUS组织化学检测发现,97株转基因幼苗中有10株GUS检测阴性,嫁接后,只成活一株。利用来源于同一愈伤系的GUS检测阳性植株作为对照,对这一GUS检测阴性的植株进行gus基因沉默机理研究。Southern分析表明,该GUS检测阴性植株与GUS检测阳性植株有相同拷贝数。GUS组织化学检测和RT-PCR分析显示,gus基因在GUS检测阴性植株中没有表达,而nptⅡ基因在这两株转基因棉花中都表达。用限制性内切酶-PCR法分析35S启动子区甲基化发现：GUS检测阴性植株35S启动子区TATA box的HapII/MspI酶切位点发生甲基化,而GUS检测阳性植株该位点没有甲基化。以上研究表明,这株gus沉默的转基因棉花可能是由于其35S启动子区甲基化引起的。     

棉花遗传转化和植株再生的研究

利用农杆菌（ＧＵＳ基因（β－葡萄糖苷酸酶基因）为标记基因，ＮＰＴⅡ为选择基因）用共培法对棉花下胚轴切段直接转化，在０．１ｍｇ／Ｌ２，４－Ｄ和０．１ｍｇ／ＬＫＴ的ＭＳ的培养基上共培４８ｈ，转移到加头孢霉素５００ｍｇ／Ｌ和５０～１００ｍｇ／Ｌ卡那霉素的上述培养基中诱导和筛选抗性愈伤组织，７０～８０天计算愈伤组织的诱导频率，并有组织化学定位法检测ＧＵＳ基因的表达，统计转化频率，结果表明：平均出愈率为４０