根癌农杆菌介导的橡胶树花药愈伤组织遗传转化体系的建立

为建立根癌农杆菌介导的橡胶树遗传转化体系,以花药愈伤组织为受体,研究了农杆菌菌株、共培养温度、共培养时间、乙酰丁香酮(AS)等因素对遗传转化效率的影响。结果表明,农杆菌菌株、共培养温度和共培养时间对转化效率具有显著影响,AS不影响转化效率。2.2万个花药愈伤组织经EHA105菌株侵染后,转入未添加AS的培养基,22℃共培养6d,通过50mgL-1卡那霉素抗性筛选、叶片GUS染色、uidA和NptII基因PCR特异扩增、PCR产物测序及NptII基因Southern检测,鉴定出11株转基因植株,并通过嫁接和次生体胚发生,获得来自8个转基因株系的681株转基因植株,移栽成活253株。     

高粱转基因再生体系建立初探

为建立高粱转基因再生体系,本研究以XL52、‘三尺三’、M81-E、07-27、BJ-285幼穗和幼胚的愈伤组织及幼胚为材料,利用农杆菌介导法进行高粱转Bar基因转基因体系研究。结果表明:以XL52幼胚、XL52和M81-E幼胚愈伤组织、‘三尺三’幼穗愈伤组织为外植体转化都获得了抗性愈伤组织,通过分化培养只有XL52幼胚转化所获得的愈伤组织获得转基因苗。本研究成功获得了抗性愈伤组织,为以后高粱转基因再生体系建立提供借鉴。     

通过基因枪和农杆菌介导用BADH基因转化小麦

土壤盐碱是一种严重障碍作物生产的环境因子,甜菜碱醛脱氢酶BADH基因是一种重要的可赋予植物渗透调节抗性的基因。本研究用基因枪法及农杆菌介导法向小麦幼胚和成熟胚愈伤组织导入了BADH基因。用PDS-1000／HE基因枪轰击2933块幼胚愈伤组织,分化出了45株再生植株,分化率为1．53％。PCR分析表明,其中的5株为BADH基因转化植株。用PPT涂抹其叶片,进一步证实了PCR的结果。以小麦成熟胚愈伤组织为受体,用农杆菌介导转化1968块愈伤,仅再生出了5株绿苗,PCR检测结果均为阴性。但对其转化愈伤组织的PCR检测表明,外源基因已在受体细胞中实现了整合。以幼胚愈伤组织为受体,用农杆菌介导转化2933块愈伤,共再生出了21株绿苗。对其进行PCR检测,仅有5株为BADH基因转化植株。转化处理过的幼胚愈伤组织的绿苗再生率（0．72％）高于成熟胚愈伤（0．25％）。与对照相比,所有的转化植株均能够在0．5％NaCl（w／w）条件下正常生长,表明外源BADH基因已经整合并表达。     

沙冬青脱水素基因转化紫花苜蓿的研究

为获得抗旱性较强的转基因苜蓿植株,以紫花苜蓿品种中苜2号作为基因转化受体,通过对外植体选择、菌液浓度、选择压确定、侵染时间和共培养时间等因素进行优化,成功建立了农杆菌介导的遗传转化体系。在此基础上,将沙冬青脱水素基因通过农杆菌的介导,转化到中苜2号中。试验结果显示,子叶和下胚轴作为外植体愈伤组织诱导频率最高,可达100%;获得抗性愈伤组织与转基因植株的卡那霉素最佳筛选浓度为25 mg/L;外植体与农杆菌的共培养时间以5 d为最佳。试验共获得126株T0抗性株,PCR检测30株表现为阳性,表明脱水素基因已转入受体植株中。     

商陆抗病毒蛋白基因在麝香百合中的转化和表达

以麝香百合叶片愈伤组织为受体,利用根瘤农杆菌介导法将美洲商陆蛋白（PAP）基因和抗卡那霉素筛选基因以共转化的方式转入百合叶片愈伤组织中,然后在含有MS培养基中筛选愈伤组织并得到再生植株,在建立的农杆菌转化百合的遗传转化体系中,获得49株再生植株,经PCR检测表明PAP基因已经转移到有抗性愈伤组织再生出百合植株中。     

农杆菌转化小麦幼胚获得转bar基因再生植株

用农杆菌转化小麦授粉10d后的幼胚，经5‰PPT筛选获得大量正常再生植株。PCR及PCR－Southern杂交检测证明其中23％（18株）再生苗为转化bar基因植株，这些植株可明显提高对basta的抗性。还总结了农杆菌转化小麦幼胚高效获得转基因再生植株的处理程序。     

农杆菌介导谷子成熟胚遗传转化体系的建立与优化

为建立一个稳定的谷子遗传转化体系,对216份谷子种质资源进行筛选,确定材料178成熟胚为受体材料,从植物激素浓度、防褐化剂、农杆菌菌液浓度、侵染时间、乙酰丁香酮（AS）浓度等方面对谷子再生及转化体系进行优化。结果表明,在MS培养基中加入生长素2,4-D 9μmol/L、细胞分裂素Kinetin 4μmol/L、硝酸银8mg/L,愈伤组织诱导率最高且能有效防止褐化。在侵染液和共培养基中加入100μmol/L AS,gus表达效果最好。农杆菌溶液OD₆₀₀为0.3~0.5,侵染15min,共培养3d时,抗性愈伤组织率最高。获得的转基因植株,经PCR检测及gus染色分析,确定外源bar基因已成功整合到谷子基因组中。初步建立了一套谷子遗传转化体系,为今后谷子遗传转化提供一些参考。     

延缓衰老基因PPF1转化水稻的初步研究

利用农杆菌介导法,把短日豌豆花后特异表达、具有延缓衰老作用的基因PPF1（post-floral-specific gene expressed in short-day-grown G2 pea）转入水稻,以期获得延缓衰老的转基因植株。约970块未成熟胚性愈伤组织与农杆菌共培养后,得到了约280块抗性愈伤组织,从中分化出抗性绿苗54株。PCR和Southern blotting检测结果表     

高粱BTx623幼胚遗传转化及再生体系的建立

高粱是世界上仅次于小麦、水稻、玉米和大麦的重要作物之一,虽然高粱基因组已经完成了测序,但是针对高粱测序品种BTx623,高效、稳定的遗传转化和再生体系的缺乏,阻碍了高粱遗传育种和功能基因组研究发展。本研究以高粱基因组测序品种BTx623幼胚为外植体材料,利用农杆菌介导的方法以抗草铵膦的Bar基因为筛选标记进行高粱遗传转化。通过筛选愈伤组织对不同浓度草铵膦的适应性,确定了高粱品种BTx623遗传转化中合适的草铵膦浓度为2.5 mg/L。以BTx623幼胚为外植体转化材料,通过农杆菌遗传转化方法,获得抗性愈伤组织。通过在分化培养中添加浓度为0.006 7 mg/L的ZNC,建立了高粱品种BTx623的植株再生体系,获得了再生植株。因此,本研究成功获得了抗性愈伤组织和再生植株,建立了高粱品种BTx623遗传转化及再生体系,这对高粱功能基因组研究和遗传育种技术发展具有重要意义。     

表达bar基因的抗除草剂转基因甘薯的获得

用农杆菌介导法将bar基因导入甘薯主栽品种徐薯18的胚性悬浮细胞中,获得了抗除草剂的转基因植株.农杆菌菌株EHA105携带的双元载体pCAMBIA3300上含有bar基因.来自于徐薯18胚性悬浮细胞的直径为0.7～1.3 min的280个胚性细胞团用于遗传转化.共培养3 d后,首先在含有2 mg/L 2,4-D、100 mg/L Carb的液体MS培养基中培养1周,然后将胚性细胞团转移到添加2 mg/L 2,4-D、100 mg/L Carb 和0.3 mg/L PPT的固体MS培养基上进行选择培养.选择8周后,将获得的37个PPT抗性愈伤组织转移到添加1 mg/L ABA、100mg/L carb和0.3 mg/L PPT的固体MS培养基上,其中的34个愈伤组织诱导得到体细胞胚并发芽形成小植株,共获得了164株拟转基因植株.PCR分析表明,其中的123株为转基因植株.Southern blot和Northern blot分析表明,bar基因稳定整合到转基因植株的基因组中并正确表达.除草剂喷洒试验结果表明,转基因植株具有高度除草剂抗性.     

抗草甘膦基因aroA转化陆地棉胚性愈伤组织的研究

为了建立以草甘膦为选择标记的农杆菌介导的棉花胚性愈伤组织转化体系,本研究将草甘膦抗性基因(aroA)转化陆地棉WC和YZ-1的胚性愈伤组织,分别以5 mg·L-1和10 mg·L-1的草甘膦浓度作为选择压,经过2~3轮筛选,获得了抗性胚性愈伤组织,诱导出胚状体并发育成苗。对T0再生植株进行PCR及草甘膦抗性检测,以WC和YZ-1为受体的转抗草甘膦基因(aroA)分别获得了33株和10株阳性植株,转化效率分别为82.5%和62.5%。该体系为棉花遗传转化提供了实验方法,获得的抗草甘膦棉花为棉花育种提供种质资源;同时抗除草剂基因还可以作为筛选标记与其它基因串联在一起转化棉花,进行基因功能验证。     

农杆菌介导的植酸酶基因转化棉花的研究

摘要：本研究采用农杆菌介导的方法,将外源植酸酶(Phy)基因导入棉花品种的胚性愈伤组织中,经培养获得再生植株。PCR检测证明植酸酶基因已经插入到棉花基因组中,晋棉14和陕724的转化效率分别为33%和8.3%。此外,本研究还对影响农杆菌侵染棉花胚性愈伤转化效率的因素,如卡那霉素浓度、胚性愈伤组织生长状态、受体材料的基因型等进行了较为系统的比较研究,旨在建立一种转化效率高、稳定性好的棉花农杆菌遗传转化体系。     

基于CRISPR/Cas9技术的水稻温敏不育基因tms5突变体的构建

为创新优良温敏不育系, 促进两系杂交稻育种的发展, 我们以水稻温敏不育基因TMS5为编辑对象, 设计了由水稻U3启动子驱动、长20 bp的guide RNA (gRNA)靶点以靶向编辑 TMS5 基因的第1个外显子, 将靶点与表达载体pCAMBIA1301连接, 再用农杆菌介导法获得水稻转基因株系。提取T₀代转基因株系的基因组DNA, 并对TMS5编辑位点附近的DNA片段进行PCR检测及测序分析。结果表明, T₀代植株的突变率为63.89%, 其中纯合缺失突变率为34.78%。对T₁代纯合缺失突变体的不育起点温度和农艺性状调查分析结果表明, 28℃是tms5突变体花粉育性的转换温度。大田试验结果表明, 与野生型相比, tms5突变体的结实率和单株重均显著降低。粳稻tms5突变体的获得为培育粳稻不育系奠定了材料基础。     

水稻OsAAA1基因超表达载体构建及遗传转化

为了构建带Flag标签的OsAAA₁超表达载体,获得阳性转基因植株并分析其OsAAA₁基因表达情况。以日本晴的cDNA为模板,将OsAAA₁克隆至pU1301-Flag载体;重组质粒通过PCR、酶切及测序鉴定正确后,以农杆菌为介导进行遗传转化至日本晴;转基因植株通过分子鉴定正确后,采用Real-time PCR检测OsAAA₁基因的mRNA表达水平变化。成功构建了OsAAA₁-pU1301-Flag重组载体;遗传转化后获得33株转基因植株;通过分子鉴定筛选出26株阳性转基因植株;荧光定量PCR结果分析发现23株阳性转基因植株OsAAA₁基因的表达出现不同程度上调。与日本晴相比,有8株表达量达到30倍以上,其中有5株表达量超过40倍。成功构建了带Flag标签的OsAAA₁超表达载体;遗传转化结果表明OsAAA₁-Flag能整合到日本晴的基因组DNA中,从而使OsAAA₁基因的表达水平增加。本研究为后续通过Flag标签,在水稻植物体内直接挖掘与OsAAA₁互作的功能蛋白奠定了基础。     

农杆菌介导海岛棉转化体系优化的研究

为建立高效规模化棉花转基因技术体系,解决棉花转化率受基因型限制、转化效率低以及转化苗畸形率高等问题。以棉花胚性愈伤组织作为受体,用农杆菌介导法将Bt基因导入海岛棉棉花品种‘新海16号’,在提高海岛棉遗传转化效率的同时,建立了相对高效地转基因再生植株成苗技术体系。结果表明：分3次依次继代于具头孢霉素浓度梯度的抗性愈伤增殖培养基,较3次均继代于含500 mg/L头孢霉素(Cef)的抗性愈伤增殖培养基MS₂,抗性愈伤增殖速度较快。且60天添加1次50 mg/L Kan时,转化苗成苗率达到最大值。降低NH₄⁺/NO₃^-水平对提高体胚发生率具有有效促进作用。选择继代90天后的愈伤组织,胚状体诱导率可达到最大值;继代180天以上的愈伤组织可以摒弃。经转化后所获的子叶畸形胚,具有较强再生能力,其产生的次生胚经再次培育出正常转基因植株这一途径可有效缩短转化周期。     

谷子芽期耐盐碱综合鉴定及评价

以全国主推的53个谷子品种为材料,在100 mmol L~(-1)混合盐碱(NaCl∶NaHCO_3=4∶1)胁迫下研究了不同谷子品种的耐盐碱性。结果表明,在盐碱胁迫下, 53个谷子品种的发芽势、发芽率、根长、芽长、根鲜重和芽鲜重均受到不同程度的抑制,以对根长的影响最大;相对发芽势与相对发芽率、相对根长与相对芽长及相对根鲜重与相对芽鲜重均呈显著或极显著正相关。通过主成分分析将14个单项性状指标转化为4个主成分,累积贡献率为90.4%;以4个主成分的得分值通过隶属函数分析获得不同品种耐盐碱的综合得分值,并通过聚类分析将53个谷子品种划分为6种耐盐碱类型,其中强耐盐碱品种2个,耐盐碱品种16个,中间型品种17个,盐碱敏感品种6个,不耐盐碱品种9个和极不耐盐碱的品种3个。同时利用回归分析建立了可用于评价谷子耐盐碱性的回归方程D'=0.298+0.037X_2+0.144X_3+0.018X_6+0.209X_7-0.183X_9+0.115X_(11)-0.201X_(12)+0.112X_(13)-0.101X_(14)+0.284X_(15),相对发芽率、根长盐害率、芽长盐害率和根冠比盐害率可以作为谷子耐盐碱性的评价指标。     

谷子黄叶色突变体ylm-1的精细定位与功能分析

谷子叶色突变体在研究C₄光能利用效率和叶绿素代谢机制方面具有重要作用。为探究谷子叶色突变的分子机制,利用甲基磺酸乙酯（EMS）处理谷子品种豫谷1号,获得1个稳定遗传的黄叶色突变体ylm-1。通过表型和遗传分析及遗传背景检测,同时利用突变位点图谱（MutMap）技术对突变基因进行精细定位。结果表明,ylm-1整个生育期叶色均为淡黄色;ylm-1与野生型遗传背景相同且受1对隐性核基因控制;MutMap精细定位到第9号染色体关联区间内共13个非同义突变基因,其中,Seita.9G249900是一个编码与红叶绿素代谢还原酶（RCCR）相关的基因,该基因位于第9号染色体19 937 988与19 940 620bp之间,含有2个外显子和1个内含子,在第2外显子361bp处发生A/T碱基突变,导致1个谷氨酸（E）变成天冬氨酸（D）。根据突变碱基设计了dCAPS标记,进一步验证了ylm-1候选基因突变位点。黄叶色突变体ylm-1的鉴定与基因功能分析将为该基因的有效利用、功能验证及作用机制研究奠定理论与技术基础。     

Construction of RNAi Vector of Cotton (Gossypium hirsutum L.) FAD2-1 Gene and Acquisition of New High Oleic Acid Germplasm

[Objective] Here, the aim was to create a new cotton (Gossypium hirsutum L.) germplasm with high oleic acid and low linoleic acid contents without affecting the fiber yield and quality. [Method] The fatty acid desaturation 2-1 (FAD2-1) gene catalyzes the formation of polyunsaturated linoleic acid from monounsaturated fatty acid in cotton. The protein’s properties, structure and functions were analyzed using the information analysis method. A conserved 381-bp fragment of GhFAD2-1 was cloned to construct an RNA interference vector, which was transformed into cotton by Agrobacterium-mediated hypocotyl infection. The fatty acid compositions and contents of T₂―T₄ transgenic plants were determined using gas chromatography-mass spectrometry. The T₄ transgenic lines were used to investigate the copy number, target gene expression, agronomic traits, and fiber quality. [Results] The RNA interference vector of GhFAD2-1 was successfully constructed and transformed into cotton. The target gene’s expression level was significantly lower in transgenic plants than in controls. The transgenic plants had high oleic acid and low linoleic acid contents, which could be stably inherited by the offspring. The oleic acid contents of transgenic cotton seeds increased by 224.1%, and the linoleic acid content decreased by 237.5%, compared with the control seeds. There were no significant differences in the agronomic traits and fiber quality of the transgenic lines compared with the control. [Conclusion] These results verified the function of GhFAD2-1 in cotton and provide a basis for breeding cotton varieties with high oleic acid contents.