农杆菌介导的"川农"系列小麦品种遗传转化效率研究初探

基因型是影响小麦农杆菌转化效率的关键因素.本研究采用携带双元表达载体PCAMBIA-1303的根癌农杆菌菌株AGL 1,对12个"川农"系列小麦品种的幼胚和愈伤进行了遗传转化.GUS瞬时表达的染色结果表明:"川农"系列小麦不同基因型间转化效率差异较大,愈伤组织普遍较幼胚的转化率高,其中幼胚转化效率较高的品种有川农21和川农22,分别为90%和85%;愈伤组织的转化效率普遍高于幼胚,川农22和川农25的愈伤转化率都达到了100%.这些材料可进一步用来转化有益目的基因.     

适用于4种玉米基因型的农杆菌转化方法的探讨

利用改良的农杆菌培养液、侵染液、共培养培养基和筛选培养基等技术体系,对4个玉米基因型Hi-Ⅱ、H99、国内2个优良自交系R18-599和齐319的新鲜幼胚、预培养幼胚、胚性愈伤组织进行了农杆菌转化研究,并比较了不同共培养方式对农杆菌侵染不同玉米组织的影响。结果表明,Hi-Ⅱ新鲜幼胚在固体培养基上共培养和滤纸上共培养后GUS基因瞬间表达率分别为83.7%和4.4%,前法优于后法;Hi-Ⅱ新鲜幼胚、预培养3 d的幼胚愈伤组织经农杆菌侵染后GUS基因瞬间表达率分别为83.7%和12.1%,新鲜幼胚比预培养的幼胚愈伤组织更适合于农杆菌转化。用上述优化的条件对另外3个不同基因型的2种不同外植体H99、齐319(新鲜幼胚)和R18-599（胚性愈伤组织）进行遗传转化,共培养3 d后的GUS基因瞬间表达率分别为65.2%、52.6%和58%,表明该转化体系适合于上述4种基因型的幼胚和胚性愈伤组织的遗传转化。此外农杆菌侵染Hi-Ⅱ新鲜幼胚后经在含巴龙霉素25~100 mg L^-1培养基上3轮选择后,抗性愈伤组织获得率为2.4%,近似反映了本研究的遗传转化率。其他3个基因型的抗性愈伤也正在筛选中。结果初步表明,本研究建立的农杆菌介导的玉米遗传转化体系可能对4种基因型均适用。     

我国部分主推小麦品种组织培养再生能力评价

小麦细胞工程育种和基因工程育种存在强烈的基因型特异性, 从目前推广的优良小麦品种中筛选不同外植体再生能力强的基因型, 对于提高小麦生物技术育种效率和加速育成品种的生产应用具有重要意义。本研究以全国大面积推广的24个优良小麦品种和抗白粉病优良品系CB037为材料, 连续2年进行花药培养、幼胚培养和成熟胚培养, 统计愈伤组织诱导率、愈伤组织分化率和植株再生率, 分析、评价这些小麦品种(系) 3种外植体的组织培养再生性能。结果表明, 25个小麦品种(系)花药、幼胚、成熟胚的植株再生率分别为0~41.75%、2.25%~531.92%和3.24%~84.34%, 基因型差异显著; 组织培养再生能力以幼胚最强(119.79%), 成熟胚其次(36.23%), 花药最弱(4.91%)。CB037的3种外植体组织培养再生效率均最高, 轮选987、扬麦16、内麦836、科农199、新春6号、郑麦366、郑麦9023、新冬20、烟农19和川麦42幼胚培养植株再生能力表现较强, 新春6号、京冬8号、石麦4185、科农199和轮选987成熟胚培养植株再生率较高, 石麦4185和邯6172花药培养绿苗诱导率较高。小麦组织培养效率与基因型和外植体类型密切相关, 不同品种同一外植体再生能力差异显著, 同一品种不同外植体再生能力也存在显著差异, 并且3种外植体的组织培养再生能力不存在相关性。本研究筛选到不同外植体再生能力较好的优良小麦基因型, 可进一步用于小麦转基因育种和单倍体育种。     

农杆菌介导水稻BADH2基因RNA干涉表达载体的转化

利用农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）介导将水稻BADH2的RNAi载体导入多个水稻品种幼胚、成熟胚诱导的愈伤组织。试验表明，不同外植体来源影响愈伤组织的诱导和转化，并且愈伤组织的诱导和转化效果受基因型的影响。在农杆菌转化过程中，潮霉素和除草剂都是较好的筛选剂，前者筛选所得的抗性愈伤分化成苗所需时间较短；但后者筛选所得的抗性愈伤形成的苗更健壮。T0代PCR检测表明，通过转化确已获得一定数量的转基因植株。     

小麦幼胚愈伤组织诱导影响因素的研究

小麦幼胚愈伤组织是目前小麦遗传转化中最常用的转化受体系统。以小麦幼胚为外植体,对愈伤组织诱导中的不同基因型、基本培养基、激素、碳源进行了研究。结果表明,不同基因型材料、不同基本培养基的幼胚愈伤组织诱导存在明显差异,其中西农1376和小偃22两个基因型小麦的组培特性较好,MS培养基适于作为小麦幼胚愈伤组织诱导的基本培养基。在MSD培养基中加入1.0mg/LABA或0.2mg/L6-BA能明显改善愈伤组织的生长状态,并以ABA的效果更为显著。将MSD培养基中的蔗糖浓度从30g/L降为15g/L,同时加入15g/L山梨醇,可显著提高愈伤组织的质量。选择适宜的基因型和合理的培养基构成是改良小麦幼胚愈伤组织诱导效果的关键。     

苜蓿不同外植体愈伤组织诱导效果及其相关性分析

以4种苜蓿的下胚轴、叶片、子叶和茎为外植体,分析同一品种间和不同品种间不同外植体愈伤组织的诱导成果.结果表明:同一外植体不同基因型的培养效果无显著差异,而同一基因型不同外植体的培养效果存在显著差异.不同外植体都可以诱导产生愈伤组织,其中相同品种的不同外植体愈伤组织的诱导率和褐化率均存在显著差异(p＜0.01),效果最佳的是下胚轴所诱导的愈伤组织,诱导率平均达99.4％,褐化率最低;叶片的诱导率最低,平均为84.3％,褐化率最高.苜蓿不同外植体愈伤组织诱导率的高低为:下胚轴＞子叶＞茎＞叶片.茎和子叶之间的愈伤组织诱导率存在极显著负相关.     

二倍体、四倍体小麦成熟胚组织培养研究初报

以栽培二粒小麦(Triticum dicoccum Schuble)、硬粒小麦(Triticum durum Desf.)以及普通六倍体小麦祖先种野生二粒小麦(Triticum dicoccoides Kom.)、野生一粒小麦(Triticum aegilopides Bal.)4个基因型麦属植物成熟胚(MEs)为外植体,对成熟胚愈伤组织诱导、分化及植株再生的组织培养效果做了初步研究,筛选出适合于非六倍体小麦成熟胚组织培养的基因型.结果表明,不同基因型成熟胚愈伤组织的诱导、分化及植株再生差异显著,具有很强的基因型效应和基因型依赖性.其中栽培二粒小麦的成熟胚表现出较好的组织培养特性,它的愈伤组织诱导率、分化率、成苗率以及组培效率分别为95.00%、90.00%、32.40%、27.70%,显著高于其它基因型.二倍体、四倍体小麦成熟胚组织培养特性的研究以及组织培养基因型的筛选,为遗传转化体系的建立、小麦功能基因的分离和克隆,以及小麦分子育种工作奠定了基础.     

燕麦愈伤组织诱导和分化再生影响因素的研究

以燕麦3个品种(系)幼胚、幼穗为材料,通过组织培养方法,研究了基因型、培养基、外植体对愈伤组织诱导、继代和分化再生的影响。结果表明,对愈伤组织的诱导,基因型和培养基起重要作用,对幼胚作用极显著,对幼穗作用显著;外植体不同也影响愈伤组织形成,随培养基成分改变而变化,且幼穗较幼胚更易培养;2,4-D浓度影响愈伤组织生长和胚性愈伤组织形成,3 mg/L 2,4-D有利于愈伤生长,促进胚性愈伤形成;草莜一号幼穗愈伤组织有很强的继代能力,继代培养330 d仍具有46.58%的分化率,该材料在组织培养和基因工程研究中具有很大潜力。     

优良玉米自交系丹598和丹988幼胚愈伤组织的诱导和再生

采用玉米自交系丹598和丹988的幼胚作为外植体,以N6和MB培养基为基本培养基,探讨基因型、培养基种类、激素种类和浓度对愈伤组织诱导率的影响,分析不同基因型愈伤组织生长旺盛时期的异同.结果显示:基因型对愈伤组织诱导率高低影响显著,且基因型和培养基之间存在相互作用.2,4-D对玉米幼胚愈伤组织的诱导形成是必需的,浓度为2.0mg/L时大多能诱导出胚性愈伤组织.本试验建立了玉米自交系丹598和丹988的优良再生体系,为以后的基因转化工作打下了良好基础.     

基因型和外植体对小麦离体培养的影响

为建立适合小麦遗传转化的高效离体培养体系,本实验用14个优良小麦新品种(品系)为材料,对不同基因型的小麦进行幼胚离体培养研究,通过培养基激素的变化,寻找最适合遗传转化的基因型及培养基成分;结果表明:不同基因型间差异显著,其中09P200和SH905在小麦离体培养中反应较好,幼胚愈伤组织绿原基分化率和出苗率显著高于其他基因型,可作为幼胚培养和转基因受体材料的优良基因型,在分化培养基中添加100mg/L水解酪蛋白、100mg/L脯氨酸和2.0mg/LKT对愈伤组织诱导分化及成苗效果较好,所有供试基因绿原基分化率、成苗率平均分别为31.93%和14.42%;另外采用4个不同基因型的小麦幼胚和成熟胚为外植体,通过继代次数的改变,筛选各外植体最适合遗传转化的培养条件;结果表明幼胚继代两次、成熟胚继代三次可以获得相对理想的绿原基分化率,且此时的愈伤组织是遗传转化较理想的受体材料。     

用根癌农杆菌介导法转化大豆萌动子叶节细胞

利用根癌农杆菌转化萌动大豆成熟子叶节获得了高频率的转基因大豆。从萌发12～16 h的大豆种子切取半片种子作为目标组织,对其子叶节组织进行伤处理后,接种于含有pGB载体的LBA4404农杆菌溶液。pGB载体含有除草剂（phosphinothricin, PPT）抗性基因bar和绿色荧光蛋白基因sgfp。将接种的外植体分别在含有3或5 mg/L PPT的芽诱导培养基、3 mg/L PPT的芽伸长培养基及2～4 mg/L PPT的根诱导培养基上进行了筛选。利用萌发5 d的外植体进行PPT浓度筛选的结果表明,芽诱导、芽伸长及根诱导阶段的PPT浓度分别为5、3及3 mg/L时,转化效率达到最大值,为5.3%。PCR和Southern杂交结果证实了外源基因稳定地整合在大豆基因组中。Northern杂交和GFP分析结果表明被整合的外源基因在大豆细胞中得到了稳定的表达。成熟植株对体外喷洒100 mg/L PPT溶液产生抗性。转化效率达8.9%。     

表达bar基因的抗除草剂转基因甘薯的获得

用农杆菌介导法将bar基因导入甘薯主栽品种徐薯18的胚性悬浮细胞中,获得了抗除草剂的转基因植株.农杆菌菌株EHA105携带的双元载体pCAMBIA3300上含有bar基因.来自于徐薯18胚性悬浮细胞的直径为0.7～1.3 min的280个胚性细胞团用于遗传转化.共培养3 d后,首先在含有2 mg/L 2,4-D、100 mg/L Carb的液体MS培养基中培养1周,然后将胚性细胞团转移到添加2 mg/L 2,4-D、100 mg/L Carb 和0.3 mg/L PPT的固体MS培养基上进行选择培养.选择8周后,将获得的37个PPT抗性愈伤组织转移到添加1 mg/L ABA、100mg/L carb和0.3 mg/L PPT的固体MS培养基上,其中的34个愈伤组织诱导得到体细胞胚并发芽形成小植株,共获得了164株拟转基因植株.PCR分析表明,其中的123株为转基因植株.Southern blot和Northern blot分析表明,bar基因稳定整合到转基因植株的基因组中并正确表达.除草剂喷洒试验结果表明,转基因植株具有高度除草剂抗性.     

农杆菌介导胡萝卜转化体系的诱导培养基优化

高频再生系统是外源基因成功转化的先决条件,但再生系统不等同于转化系统。为提高农杆菌共培养后胡萝卜的再生频率,以日本新黑田五寸参和林丰改良五寸参2个品种胡萝卜下胚轴为外植体,利用农杆菌介导法将人源白细胞介素-2基因(IL-2)导入其中,探讨了共培养后诱导培养基中激素浓度和筛选剂对再生的影响。结果显示：不同基因型胡萝卜的分化对激素浓度的反应不同,林丰改良五寸参在3种培养基上的胚性愈伤率差异不显著;日本新黑田五寸参胚性愈伤率和每个外植体分化的抗性株数随激素浓度的提高而呈上升趋势,2,4-D和6-BA浓度为1.0mg/L时胚性愈伤率和每个外植体分化的抗性株数最高,分别为87.50%和59株;日本新黑田五寸参以bar基因为标记基因、PPT作筛选剂时,分化较好。因此,遗传转化过程中,为提高共培养后胡萝卜胚状体的分化率,对共培养后的诱导培养基进行再优化是必要的。     

根癌农杆菌介导番茄‘白果强丰’遗传转化体系优化

以番茄无菌苗的子叶为外植体,通过农杆菌介导法对其遗传转化体系进行了优化,结果表明：外植体在MS+2 mg/L 6-BA+0.2 mg/L IAA的进行2天的预培养后,用农杆菌EHA105（浸染浓度为OD600=0.6）浸染6 min,转化效率最高,经过PCR检测初步证明NPTII基因已整合到番茄再生植株中,本研究建立了高效番茄‘白果强丰’子叶农杆菌介导的遗传转化体系。     

小麦茎生长点转化研究初报

为了躲避转基因技术对组织培养的过分依赖,本研究以小麦为材料尝试了一种对生长点直接进行转化的方法,并初步证明了这一方法的可行性。具体做法是：将种子萌芽,然后剥去胚芽鞘暴露出生长点,再用玻璃纤维制作的小刷子将生长点刺伤,最后用带有外源基因的农杆菌进行侵染处理。用携带hph-GUS基因的LBA4404农杆菌,侵染处理1～11日龄幼苗(生长点),共培养7d后检测新生芽中GUS的瞬时表达情况;侵染1～2日龄幼苗(生长点),取长成植株的2～3朵小花进行GUS稳定表达检测。又用携带BADH和npt Ⅱ基因的AGL1农杆菌菌株侵染1日龄的幼苗(生长点),在含：100mg／L卡那霉素的蛭石中进行选择。结果表明,GUS的瞬时表达率随被处理幼苗的日龄增加而降低,以2日龄幼苗为最高(10．7％)。用花序检测GUS的稳定表达,被侵染受体为1日龄幼苗时的表达率高于2日龄的幼苗。蔗糖的存在并不提高GUS基因在花序中表达的频率。不过花序表现为GUS阳性的植株后代,经PCR检测后并没有证实GUS基因存在。用AGL1菌株进行转化,获得了13．6％的抗卡那霉素的绿色植株,但只有3株呈现PCR阳性,且只有1株结了实。     

小麦TaPHR1基因表达载体的构建

本研究以植物表达载体pROK2-Ubi为基础,设计带有酶切位点KpnⅠ和BamHⅠ的一对引物,从载体pAC25上扩增到目的基因TaPHR1。酶切回收后与同样双酶切的表达载体pROK2-Ubi连接,获得新的表达载体pTaPHR1,并将所构建的载体导入根瘤农杆菌LB4404菌株。另外以小麦品种济麦22为受体,利用农杆菌介导小麦成熟胚愈伤组织的遗传转化体系和构建的表达载体进行了初步的遗传转化。实验结果表明选择抗生素选择压Kan50mg/L,接种菌液浓度为OD600=0.6,侵染时间为60min时,抗性愈伤的获得率最高,达到4.08%,抗性愈伤组织的分化率达到3.28%。本研究为农杆菌介导缺磷响应基因TaPHR1的小麦遗传转化和小麦磷高效遗传改良研究提供了研究数据。     

普那菊苣高效再生体系建立和遗传转化研究

普那菊苣为菊科多年生草本植物,从国外引种后已在我国得到广泛种植。普那菊苣草质柔嫩,适口性优良,营养丰富,牛、羊、猪、鱼、兔极喜食,是一种非常优良的牧草,具有广阔的发展前景。本研究通过对不同激素浓度配比实验,建立普那菊苣的高频再生体系,结果表明MS 6-BA2.0mg/L IBA0.1mg/L培养基可高效诱导愈伤组织和芽的分化,1/2MS培养基可快速诱导根的生成,形成再生植株。通过构建植物表达载体pBI121-GFP,利用农杆菌介导转化普那菊苣以探寻高效的普那菊苣转化体系,结果显示以农杆菌LBA4404为介导菌株、以叶片为转化受体、3d预培养时间和3d共培养时间以及350mg/L羧苄青霉素和40mg/L卡那霉素筛选浓度转化效果较好,为利用普那菊苣生产动物口服型疫苗建立了初步的技术基础。     

草莓抗除草剂bar基因工程菌的构建及其检验

为探索草莓抗除草剂bar基因转化高效方法,试验利用三亲杂交法,将构建的真核表达载体pBI121-bar转入根癌农杆菌菌株LBA4404,对菌落PCR、质粒PCR和质粒双酶切产物进行电泳检测．用构建的工程菌转化草莓试管苗。研究结果表明,真核表达载体pBI121-bar被成功转入根癌农杆菌LBA4404;草莓试管苗工程菌侵染最佳浓度菌液OD600值为0．5,脱菌Cef适宜浓度200mg／L;已筛选出草莓抗除草剂bar基因抗性芽。     

根癌农杆菌介导的甘薯遗传转化及转基因植株的再生

以甘薯优良品种"新大紫”的茎尖培养再生植株为试材,经根癌农杆菌介导将甘薯块根贮藏蛋白启动子(Sporaminpromoter)调控下的10kD玉米醇溶蛋白基因导入到"新大紫”中,并获得了转化植株.甘薯品种"新大紫”再生植株的茎切段,与携带有表达载体质粒pSP10Z的根癌农杆菌菌株LBA4404共培养后,在含75mg/L卡那霉素(Kan)的筛选培养基上可     

The use of visual marker genes as cell-specific reporters of Agrobacterium-mediated T-DNA delivery to wheat (Triticum aestivum L.) and barley (Hordeum vulgare L.).

Transfer of T-DNA from Agrobacterium tumefaciens and A. rhizogenes to cells of wheat (Triticum aestivum L.) and barley (Hordeum vulgare L.) is demonstrated following the inoculation of immature embryos and immature embryo-derived callus. Agrobacterium T-DNA vectors containing the C1/Lc anthocyanin-biosynthesis regulatory genes, the gusA gene or a synthetic green fluorescent protein gene (sgfp-S65T) were constructed from original binary vectors. The visual T-DNA markers were used as cell-autonomous reporters of early Agrobacterium-mediated transformation events in the wheat and barley cells. This localization of the transformed cells revealed a non-random distribution throughout each embryo and callus piece.