制备鼠抗猪肺炎支原体抗体的方法

小鼠饲养管理方便,价格亦很低廉,用常规方法免疫小鼠,虽可获得较高滴度的抗体,但是由于小鼠的血清量甚少,所产生的血清抗体在数量上远不能满足实验的需要。因此,通常均采用兔、羊、马等个体大的动物来制备所需抗体。这就在管理上和经费上带来一些困难。能否利用小鼠免疫制备大量的血清抗体?我们在制备抗猪肺炎支原体抗体时,利用接种小鼠骨髓瘤细胞诱生腹水的方法,解决了这一问题。     

大量制备鼠抗猪肺炎支原体抗体的方法

小鼠饲养管理方便,价格很低廉,用常规方法免疫小鼠,虽可获得较高效价的抗体,但是由于小鼠的血清量甚少.所产生的血清抗体在数量上远不能满足实验的需要。因此,通常均采用兔、羊、马等个体大的动物来制备所     

人乳铁蛋白多克隆抗体的制备、初步纯化及其应用

制备并初步纯化人乳铁蛋白的多克隆抗体，然后将抗体用于该蛋白的检测。分别对8周龄的昆明白小鼠和12周龄的新西兰白兔进行多次皮下免疫注射，采集血清并用硫酸铵沉淀法进行抗体的初步纯化。将初步纯化的抗体用于抗体夹心ELISA法检测转基因小鼠乳汁中人乳铁蛋白的表达量。经三次免疫后的新西兰白兔和昆明白小鼠血清中抗体的效价分别达到了1：48000和1：24000，并能在较高水平上维持两周以上，经初步纯化后抗体纯度得到很大提高。用抗体夹心EUSA法能够测出转基因小鼠乳汁中人乳铁蛋白含量。使用皮下注射的方法对昆明白小鼠和新西兰白兔进行免疫来制备多克隆抗体是可行的，硫酸铵沉淀法纯化后的抗体去除了大多数杂蛋白，可以满足测定的需要。     

PRRSV GP5和M蛋白滴鼻免疫小鼠后特异性抗体的中和活性分析

为探讨猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)GP5和M蛋白滴鼻免疫小鼠后产生的特异性抗体的中和活性,研究以原核表达的重组蛋白GP5和M为抗原分别与霍乱毒素B亚基(CTB)佐剂按10∶1的比例混合制备成CTB黏膜佐剂疫苗,滴鼻免疫小鼠,于首次免疫后0,7,14,21,28,35,42 d收集唾液和血清样品,利用间接ELISA方法分别检测免疫小鼠唾液中特异性抗体IgA,结果均于28 d时S/N值达到最高,ELISA效价均为1∶2;血清中特异性抗体IgG分别于21,28 d时S/N值达到最高,ELISA效价均为1∶800。通过本实验室建立的基于PAM细胞中和试验方法分别检测唾液中特异性抗体IgA和血清中特异性抗体IgG中和滴度均1∶2,结果表明PRRSV GP5和M蛋白滴鼻免疫小鼠后产生的特异性抗体未达到免疫保护作用的中和抗体水平。     

己烯雌酚完全抗原及其单抗的制备与分析

为建立己烯雌酚免疫学检测技术,试验采用混合酸酐法制备完全抗原DES-HS-BSA,并对制备产物进行紫外光谱、红外光谱、SDS-PAGE、MS分析鉴定,以DES-HS-BSA免疫Balb/c小鼠,用ELISA试验测定抗体.结果表明:半抗原衍生物DES-HS已被成功地偶联到牛血清白蛋白上,计算得每分子牛血清白蛋白上结合26个DES-HS;ELISA试验结果证实免疫小鼠血清中含有抗己烯雌酚的抗体,将免疫好的小鼠脾脏细胞和SP2/0细胞融合,筛选出了1株能稳定分泌己烯雌酚单抗的杂交瘤细胞株18G5,抗体亚型为IgG3.     

布鲁氏菌外膜囊泡生物信息学分析及免疫原性评价

【目的】探索布鲁氏菌外膜囊泡(OMVs)在亚单位疫苗上的应用前景,制备布鲁氏菌OMVs亚单位疫苗,评估布鲁氏菌OMVs的免疫原性。【方法】利用高速离心法制备羊种布鲁氏菌OMVs,通过透射电镜、SDS-PAGE和生物信息学分析对制备的OMVs进行形态和组分分析;使用纳米佐剂(LDH)和弗氏佐剂乳化OMVs后免疫小鼠,通过间接ELISA方法检测免疫后7、14、21、28和35 d小鼠血清中的特异性抗体,利用小鼠IgG ELISA检测试剂盒检测免疫后小鼠血清中IgG抗体水平,评估OMVs诱导产生的体液免疫水平;通过小鼠脾脏淋巴细胞分离与细胞因子白细胞介素4(IL-4)和γ-干扰素(IFN-γ)测定及小鼠外周血T淋巴细胞亚群的流式细胞术测定评估OMVs免疫小鼠的细胞免疫水平。【结果】成功提取并纯化了布鲁氏菌OMVs,其直径大小为20～160 nm。生物信息学分析结果显示,OMVs主要组成蛋白OMP25、OMP31、OMP16、OMP19、BP26及SOD均属于亲水性蛋白和抗原性蛋白,且存在多个B细胞和T细胞优势抗原表位。与PBS组相比,OMVs免疫小鼠后,不同佐剂组均可诱导小鼠产生高水平的特异...     

抗氨苄青霉素单克隆抗体的制备及初步鉴定

利用碳化二亚胺(EDC)法将氨苄青 霉素(Ampicillin,AMP)与匙孔嘁血蓝蛋白 (mcKLH)偶联制备免疫原免疫Balb/c小鼠, 应用杂交瘤技术将免疫鼠脾细胞与小鼠骨髓 瘤细胞(SP2/0)融合,建立分泌氨苄青霉素单 克隆抗体的杂交瘤细胞株。同上方法将氨苄 青霉素连接到阳离子化的牛血清白蛋白(cB SA)上制备检测抗原,对AMP KLH偶联物 免疫小鼠产生的抗体进行检测。通过对杂交 瘤细胞培养上清的检测、鉴定,筛选出8株高 亲和力的杂交瘤细胞株,用其制备的腹水 ELISA效价达到2×106,纯化后的单克隆抗 体(McAb)可以应用于氨苄青霉素残留的快 速检测。     

A型清道夫受体在口蹄疫病毒VP1-VP4蛋白诱导小鼠免疫应答中的作用

为研究A型清道夫受体(SR-A)在重组口蹄疫病毒(FMDV)VP1-VP4蛋白诱导小鼠产生抗免疫应答中的作用,通过构建Pet32a-VP1-VP4原核表达系统制备VP1-VP4蛋白,用纯化的VP1-VP4蛋白分别免疫预先注射SR-A抑制剂的BALB/c小鼠和未作处理的BALB/c小鼠,用ELISA检测免疫7d后小鼠血清中IFN-γ和IL-4的含量,用琼脂扩散法测血清的抗体效价,用ELISA检测血清抗体亚类的含量。结果发现,经SR-A抑制剂处理的小鼠血清IFN-γ含量和IL-4含量均降低,血清总抗体效价也降低,但血清IgA水平显著升高,这表明SR-A在识别VP1-VP4蛋白进而启动免疫应答的过程中发挥广泛的调节作用。     

磺胺氯吡嗪钠单克隆抗体的制备及鉴定

应用重氮化方法制备了磺胺氯吡嗪钠(sulfachloropyrazine sodium,SPZ)完全抗原SPZ-OVA,将成功偶联的人工全抗原(SPZ-OVA)免疫BALB/c小鼠,免疫4次后,经间接ELISA检测,1号小鼠血清抗体效价达到1:6.4×104。取该小鼠脾细胞与SP2/0细胞融合。利用ELISA方法对融合后的杂交瘤细胞上清进行检测,筛选出能够稳定分泌抗体的细胞株:D9。将细胞株D9扩大培养后,经腹腔注射小鼠使其产生腹水。腹水单抗经纯化后,通过间接竞争ELISA对该单克隆抗体的效价、半数抑制浓度以及特异性进行检测。结果表明,所制备的单克隆抗体效价为1:4×105,半数抑制浓度为326 ng/m L,特异性良好。     

狂犬病减毒脂质体口服冻干活疫苗免疫效果检测

将制备的狂犬病rSRV9减毒口服冻干脂质体活疫苗配合以自制的复合佐剂,免疫小鼠、犬、猫,根据ELISA抗体定量检测方法,对免疫后小鼠血清IgG、小鼠粪便IgA、犬和猫血清IgG、犬和猫唾液IgA的ELISA抗体水平进行检测,其检测结果与注射狂犬病疫苗免疫效果进行对比。结果显示,复合佐剂+rSRV9病毒口服免疫后70d,小鼠血清抗狂犬病特异性IgG抗体水平为4 214.00U/mL,小鼠粪便中SIgA抗体水平为137.00U/mL;复合佐剂+rSRV9病毒口服免疫犬120d抗体水平最高,犬抗狂犬病特异性IgG抗体水平为1 420.00U/mL,唾液中SIgA抗体水平为1 199.00U/mL;猫抗狂犬病特异性IgG抗体水平为2 088.00U/mL,唾液中SIgA抗体水平为1 896.00U/mL。狂犬病疫苗口服组与注射组特异性抗体水平差异均不显著。结果表明,狂犬病rSRV9减毒口服冻干脂质体活疫苗的抗体产生水平已接近注射狂犬病疫苗的免疫效果,能够达到对动物的免疫效果。     

小鼠抗青霉素和头孢菌素酰化酶抗体制备及交叉反应研究

为探讨用不同方法制备的抗原对抗体效价的影响以及抗体之间的交叉反应 ,采用 3种不同方法制备的抗原分别免疫 BAL B/ c小鼠 ,制备出抗青霉素酰化酶 α亚基、β亚基和抗头孢菌素酰化酶α亚基、β亚基 4种抗体 ,测定了它们的效价 ;同时还比较了用同一种方法制备的抗原免疫小鼠后制作这两类抗体的效价以及上述 4种抗体之间对应抗原的交叉反应。结果表明 ,用割胶法制备的抗原免疫小鼠后所得抗体效价较高 ;同样用割胶法制备的抗原免疫小鼠后所得的两类抗体效价无显著差异 ;在交叉反应测试中 ,抗头孢菌素酰化酶抗体也能识别青霉素酰化酶 ,但抗青霉素酰化酶抗体却几乎不能识别头孢菌素酰化酶 ,即抗头孢菌素酰化酶抗体更为活跃 ,而抗青霉素酰化酶抗体则更为专一。同类抗体对应抗原 2个亚基之间的交叉反应说明其互相结合部位结构的类似 ,同时也说明只有进一步制作单克隆抗体才能筛选出特异性强的抗体     

日本血吸虫重组IAP蛋白的免疫保护效果评估

为研究日本血吸虫凋亡蛋白抑制因子（inhibitor of apoptosis protein of Schistosoma japonicum,SjIAP）重组蛋白诱导BALB/c小鼠的免疫保护效果,利用PCR技术扩增SjIAP基因,构建重组表达质粒pET-28a（＋）-SjIAP,诱导表达重组SjIAP蛋白,并利用重组蛋白制备兔源多克隆抗体血清。然后,选用SjIAP重组蛋白免疫BALB/c小鼠,利用ELISA检测免疫小鼠血清中的特异性抗体水平,以及免疫小鼠脾脏淋巴细胞在SjIAP重组蛋白刺激后产生的细胞因子水平。强化免疫后,将小鼠进行血吸虫尾蚴攻虫试验,感染38 d,进行剖杀,计算虫体减虫率及肝脏减卵率。Western blot结果表明本研究制备的兔源多抗血清能特异性识别SjIAP重组蛋白。ELISA检测表明免疫SjIAP重组蛋白可诱导较高水平的IgG及IgG亚型（IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3）抗体和IFN-γ、IL-2及IL-4细胞因子。动物试验表明,免疫SjIAP重组蛋白的小鼠与PBS组相比分别获得了31.5%的减虫率和37.2%的肝脏减卵率。免疫SjIAP重组蛋白能诱导小鼠获得一定减虫和减卵保护效果,提示血吸虫凋亡蛋白抑制因子可作为抗血吸虫病的疫苗候选分子。     

免疫小鼠血清中猪圆环病毒2型抗体ELISA检测试剂盒的研究

为研制一种小鼠血清中猪圆环病毒2型（Porcine circovirus type 2,PCV2）抗体检测试剂盒,以PCV2 Cap蛋白兔多抗作为包被用抗体,捕获纯化的PCV2 Cap蛋白,制备抗原检测板,辣根过氧化物酶(HRP)标记羊抗小鼠IgG作为二抗,建立检测小鼠血清中PCV2抗体ELISA检测方法并制备试剂盒。采用所制备的ELISA试剂盒对50份已知阴性血清样本进行检测,临界OD450nm值为0335;采用ELISA试剂盒与IFA分别对100份血清检测,总符合率为96%,检测小鼠血清敏感性效价达1∶16000,与其他常见的猪病毒小鼠阳性血清无交叉反应,2～8 ℃保存15个月稳定,批内变异系数为2.28%～4.17%,批间变异系数为4.27%～6.02%,具有良好的敏感性、特异性、稳定性及重复性;采用ELISA试剂盒对不同来源疫苗免疫组小鼠血清进行检测,均显示良好效果。研究表明,本研究制备的ELISA试剂盒可用于小鼠血清中PCV2抗体效价检测。     

猪瘟病毒E2蛋白单克隆抗体的制备及阻断ELISA抗体检测方法的建立

为了建立一种经济可靠的猪瘟病毒(CSFV)抗体检测方法,本研究利用杆状病毒表达系统表达可溶性CSFV E2蛋白,并免疫BALB/c小鼠,制备了45株可稳定分泌抗CSFV E2蛋白单克隆抗体(McAb)的杂交瘤细胞。经CSFV阳性血清阻断试验筛选出4株具有阻断活性的McAb,并经抗原表位鉴定确定单抗15A9识别的是可用于鉴别CSFV和牛病毒性腹泻病毒(BVDV)的线性表位TAVSPTTLR。利用辣根过氧化物酶(HRP)标记的15A9建立了CSFV阻断ELISA抗体检测方法,用此方法检测猪瘟疫苗免疫的猪血清,免疫后2周即可检测到抗体,且该方法检测BVDV阳性血清为阴性。本研究建立的CSFV阻断ELISA抗体检测方法为CSFV的疫苗免疫效果评估及其与BVDV的抗体鉴别提供了一种有效、便捷的方法。     

CVC1302对O型口蹄疫病毒细菌样颗粒疫苗的免疫增强作用

为探究免疫增强剂CVC1302对O型口蹄疫(FMD)细菌样颗粒(BLP)疫苗的免疫增强作用,本研究将革兰氏阳性增强基质(GEM)处理的口蹄疫病毒(FMDV)VP1结构蛋白表位的重组蛋白B(T1BT2)4B与CVC1302混合,与白油佐剂乳化制成疫苗,免疫4周龄ICR小鼠及45日龄FMDV抗体阴性仔猪。免疫后利用FMDV VP1结构蛋白ELISA抗体检测试剂盒检测小鼠血清中的特异性ELISA抗体水平;利用淋巴细胞增殖试验检测免疫小鼠淋巴细胞增殖情况;利用荧光定量PCR方法检测免疫小鼠相关细胞因子水平以及利用液相阻断抗体检测试剂盒检测免疫仔猪血清中的液相阻断抗体滴度。结果显示,免疫增强剂CVC1302可以显著提高GEM-B(T1BT2)4B免疫后小鼠血清中的抗体水平(p0.05);小鼠T淋巴细胞增殖率及细胞因子IL-4、IFN-γ的转录水平均显著升高(p0.05);仔猪血清中的液相阻断抗体水平也明显高于对照组。以上结果表明免疫增强剂CVC1302可以提高O型FMD BLP疫苗的细胞免疫和体液免疫水平,对FMD BLP疫苗具有较好的免疫增强作用。本研究为提高FMD亚单位疫苗的免疫效力提供了新的思路。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒核衣壳蛋白刺激小鼠产生抗体的研究

为比较传统免疫、脾内免疫、胶粒免疫和硝酸纤维素膜皮下包埋等4种方法制备的猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)核衣壳蛋白抗原免疫小鼠后刺激机体产生特异性抗体的水平,比较不同方法对于特定抗原刺激机体产生免疫应答的影响,筛选一种最有效的能够用于PRRSV核衣壳蛋白多克隆抗体和单克隆抗体制备的免疫方法。用PRRSV核衣壳蛋白作免疫原,分别用传统皮下免疫法、脾内免疫法、胶粒免疫和硝酸纤维素皮下包埋法免疫BABL/c小鼠,间接ELISA检测血清效价,用Western blotting检测其特异性。三免后,常规免疫小鼠血清效价为1.28×105,脾内免疫法为1.28×105,胶粒免疫为3.2×104,NC膜皮下包埋法为6.4×104。结果表明,4种免疫方法均获得了高滴度、高特异性的多克隆抗体,与传统免疫法相比,其他3种方法有其明显的优势,即节省抗原,其中脾内免疫法为优先选用的免疫方法,其免疫效果好,可节省大量抗原和时间。     

野生动物用狂犬病口服疫苗复合免疫佐剂与诱饵的筛选及其对免疫效果的影响

本研究旨在筛选最佳的复合佐剂和口服疫苗诱饵组方,并将筛选出的复合佐剂口服免疫试验小鼠,检测免疫小鼠血清IgG和肠道IgA抗体效价。采用牛肉粉、鸡肉粉、鱼肉粉、奶粉、血粉为主要原料,以细菌脂多糖、氢氧化锌、枸杞多糖、甘露低聚糖为疫苗免疫佐剂,通过正交试验方法将复合免疫佐剂和口服疫苗诱饵与狂犬病SRV₉病毒混匀后口服免疫试验小鼠,并对免疫动物血清IgG抗体效价进行检测。优化的复合佐剂组方是细菌脂多糖100 μg、氢氧化锌0.8 mg、枸杞多糖50 mg、甘露低聚糖10 mg,免疫小鼠血清IgG抗体含量为3.24 mg/L,肠道IgA抗体含量为1.56 ng/mL;在疫苗诱饵的投喂试验中,狼、狐狸、犬、猫对鱼肉味诱饵的采食率最高,其次是血味和奶味诱饵;诱饵与狂犬病SRV₉病毒混匀后口服免疫小鼠28 d后,血清IgG平均值为1.20 U/L。本试验筛选出口服疫苗复合免疫佐剂,经筛选制备的鱼肉味诱饵具备高采食性,适合野生食肉类动物口服疫苗的制备。可增加狂犬病SRV₉病毒的免疫效应,为进一步研发重组减毒狂犬病口服疫苗提供了必要的技术支撑。     

锡兰钩虫谷胱甘肽-S-转移酶基因的克隆表达与免疫原性分析

为了克隆表达锡兰钩虫谷胱甘肽-S-转移酶(Ace-GST)基因,制备多克隆抗体并分析其免疫原性,为疫苗候选分子的筛选奠定基础。根据GenBank上锡兰钩虫GST基因序列设计引物,利用RT-PCR法扩增Ace-GST基因,将扩增产物克隆至pET-32a载体并转入E.coli BL21(DE3)宿主菌表达,重组蛋白纯化后免疫昆明小鼠,分别用间接ELISA法和MTT法检测免疫鼠血清IgG抗体水平与脾淋巴细胞增殖情况。结果显示Ace-GST基因ORF全长468 bp,编码155个氨基酸,与ν类GSTs聚为同一分支;重组Ace-GST相对分子质量为36 000,可诱导产生特异性IgG抗体,并能显著刺激免疫小鼠脾淋巴细胞增殖。结果表明重组Ace-GST蛋白能诱导昆明小鼠产生特异性免疫应答,具有良好的免疫原性。     

非洲猪瘟病毒p17蛋白的哺乳动物细胞表达及鉴定

研究旨在利用哺乳动物细胞悬浮培养系统表达非洲猪瘟病毒(ASFV)p17蛋白,纯化并免疫小鼠,制备针对ASFV p17蛋白的特异性多克隆抗体。根据GenBank中公布的ASFV SY18毒株p17蛋白编码基因序列,设计特异性引物扩增p17基因片段,构建重组真核表达质粒pCDNA3.1-p17-strep。将其瞬时转染293i细胞,并利用下游strep标签进行蛋白纯化。纯化后的重组p17蛋白配合MnJ(β)胶体锰佐剂免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体血清。利用Western blot、间接免疫荧光试验鉴定该多克隆抗体的反应原性和特异性。结果显示：本试验成功构建pCDNA3.1-p17-strep真核表达质粒,转染293i细胞后纯化获得重组p17蛋白。免疫小鼠后制备的多克隆抗体与真核表达的p17蛋白及表达ASFV p17蛋白的猪繁殖与呼吸综合征病毒均有良好的特异性免疫反应。本试验为深入探讨ASFV p17蛋白的生物学功能奠定了基础。     

猪传染性胃肠炎核酸疫苗免疫小鼠后的血清抗体IgG检测

本试验旨在对猪传染性胃肠炎核酸疫苗(含有TGEV-S基因质粒)开展免疫原性研究,为科学评价该TGE核酸疫苗的免疫效果提供依据。通过灌胃口服免疫TGE核酸疫苗诱导小鼠机体产生特异性免疫,定期采样监测其血清抗体产生规律,采用间接ELISA方法测定免疫小鼠血清抗体IgG的抗体效价。结果发现:TGE核酸疫苗免疫小鼠后有效地激发了TGEV特异性抗体,首免后第二周开始就能检测到血清抗体应答,且该组抗体水平一直都与空载体组和PBS空白对照组之间呈极显著差异(P0.01),表现出良好的免疫原性。