2010-2011年中国部分地区禽坦布苏病毒感染调查及分子变异分析

为了解中国目前禽坦布苏病毒在家禽中的流行状况及病毒分子演化特征,对2010-2011年采集自中国沿海及周边的9个省的439份疑似家禽坦布苏病毒感染的临床样品进行了鉴定,并进行了分离毒株NS5基因的分子遗传进化分析。结果表明,2010年采集的187份家禽病料中检测出42份阳性样品,阳性率为21．6％,而2011年采集的252份样品中检测出37份阳性样品,阳性率为13．9％。对部分毒株的NS5基因测序表明,本研究分离的禽坦布苏病毒与已发布的同时期分离的禽坦布苏病毒NS5基因同源性在98％以上,与2010年前分离的鸡源及蚊媒坦布苏病毒的同源性介于83．8％-85．8％之间;所有2010年后分离的禽坦布苏病毒毒株在系统进化上共同构成了一个进化分支。结果表明,2011年禽坦布苏病毒仍在中国沿海及周边的9个省的家禽中流行,病毒NS5基因的测序分析表明,到目前为止在家禽中流行的禽坦布苏病毒未出现明显的分子变异。     

坦布苏病毒鸡源分离株全基因组及遗传变异分析

为了解引起鸡产蛋骤降的坦布苏病毒全基因组分子特征,本试验运用RT-PCR技术克隆测定了2株坦布苏病毒鸡源分离株全基因组序列,其基因组为10 990nt,包含1个10 278nt的开放阅读框架,与GenBank数据库中登录的坦布苏病毒参考株一致,与2010年以来的坦布苏病毒毒株核苷酸及推导氨基酸同源性均在98%以上,与2010年前的坦布苏病毒核苷酸和氨基酸序列同源性仅分别为88%和96%左右。基于坦布苏病毒全基因组序列的分子系统进化分析,发现2株鸡源坦布苏病毒与2010年以来分离的各种禽源坦布苏病毒株均处于同一大的进化分支,且相互间的遗传距离均小于2%。以上研究结果表明,坦布苏病毒鸡源分离株与其他禽源病毒分离株的基因组差异不明显,各分离株亲缘关系非常近。     

山东地区鸭坦布苏病毒流行病学调查及分子变异分析

为了解山东地区鸭坦布苏病毒(DTMUV)的流行及其分子的遗传变异情况,本研究自山东的菏泽、泰安、济宁、枣庄等9个地区搜集临床样品,利用RT-PCR、荧光定量PCR等方法进行检测,并进行分离株E基因及全基因的遗传进化分析;同时,采用阻断ELISA方法检测不同地区未免疫DTMUV病疫苗的不同品种鸭群的血清样品。结果显示,临床样品中DTMUV检出率为13.3%(36/270)。对分离株E基因的序列分析表明,本研究分离的DTMUV与已发布的禽坦布苏病毒基因的同源性在96.5%以上。两株分离株的全基因序列分析表明,部分氨基酸位点发生了变异。血清抗体检测结果显示,不同地区及品种的DTMUV感染情况差别较大,肉鸭在德州和滨州未检测到阳性,而在泰安的阳性率为42.2%,后备种鸭和蛋鸭在各地区的阳性率高低不一;从鸭的品种来分析,蛋鸭是感染最严重的鸭群,阳性率为55.6%。结果表明,坦布苏病毒对山东水禽养殖仍有一定的危害,目前山东地区流行的DTMUV与之前分离的禽坦布苏病毒同源性较高,未出现明显的分子变异。     

基于宏基因组学的鸭源样本中坦布苏病毒检测方法的建立

利用二代高通量测序技术建立检测鸭源样品中坦布苏病毒的方法。首先将样品过滤和经核酸酶处理,再利用等温链位移扩增(SPIA)技术快速制备样品总cDNA,最后经磁珠纯化和文库构建后,通过Ion Torrent进行高通量测序获得基因组信息。结果显示,通过SPIA扩增和核酸文库制备的优化,可从微量病原样本中获得327pmol/μL的核酸文库样本。Ion Torrent测序共获得1 725 436条reads,约6.2M数据,平均109bp。数据拼接并Blast发现,病原样品的核酸序列可注释鸭坦布苏病毒全部基因组数据,与首次发生在我国的鸭坦布苏病毒BYD-1株参考序列的同源性为100%。将所测病毒序列与其他5种黄病毒科成员进行同源性比对,发现与近3年发生在我国的鸭坦布苏病毒同源性最高,在98%以上。且NS基因进化树分析与鸭坦布苏病毒处于同一分支上,符合鸭坦布苏病毒特征。本研究建立的基于未知病原SPIA扩增结合高通量测序检测方法,可同步获知坦布苏病毒基因的核酸信息。     

2020年福建省龙岩市水禽坦布苏病毒检测及其NS5基因变异分析

为了解龙岩市水禽坦布苏病毒（ATV）感染情况及其NS5基因遗传变异情况,对采自福建省龙岩市7个县（市、区）农贸市场、规模化禽场和散养户的鸭泄殖腔棉拭子2 885份、鹅泄殖腔棉拭子样品320份进行ATV RT-PCR检测,并对部分阳性样品进行病毒分离鉴定及NS5基因序列测定与遗传进化分析。结果显示：ATV总阳性率为17.19%（551/3 205）,其中鸭、鹅样品阳性率分别为16.81%（485/2 885）、20.63%（66/320）,差异显著（P＜0.01）;按不同场所统计,散养户水禽样品ATV阳性率最高（20.68%,304/1 470）,农贸市场次之（15.19%,224/1 475）,规模化养殖场最低（8.85%,23/260）,相互间差异显著（P＜0.01）;按被检水禽日龄统计,90~＜180日龄水禽样品阳性率最高（21.29%,397/1 865）,180~＜380日龄次之（17.62%,74/420）,30日龄内最低（4.44%,4/90）;春季水禽样品阳性率（22.74%,362/1 592）明显高于秋节（11.72%,189/1 613）。将部分ATV阳性样品经鸭胚分离培养,共分离出13株鸭源、鹅源ATV毒株。对这13株分离株NS5基因片段进行核苷酸序列分析发现,其同源性高达98.6%~100%,与国内ATV代表株核苷酸序列同源性介于96.5%~99.7%,且处于同一进化树分支,而与澳大利亚等国外分离株亲缘关系较远。结果表明,目前福建省龙岩市鸭、鹅等水禽中存在不同程度的ATV感染,流行毒株仍为国内当前流行毒株,未出现明显变异。本研究了解了该地区ATV的流行特点及基因遗传进化情况,为制定ATV感染防控措施提供了依据。     

1株麻雀源坦布苏病毒的分离鉴定及全基因组序列分析

从山东地区某发病鸭场周围的麻雀体内分离到1株坦布苏病毒,命名为SDS株,并对分离毒株进行毒力测定。应用RT-PCR技术对分离株全基因组进行扩增并测序,将获得的SDS株坦布苏病毒全基因组序列与已在Gen Bank发表的24株坦布苏病毒和6株其他黄病毒属病毒全基因组序列进行遗传进化分析。结果表明,该株坦布苏病毒的基因组全长为10 990 nt,包含94 nt的5'端非编码区、618 nt的3'端非编码区和一个开放阅读框(3 425个氨基酸),编码11种病毒蛋白;与Gen Bank已发表的坦布苏病毒的核苷酸序列同源性为98.2%~99.5%,氨基酸序列同源性为98.1%~99.4%,其中与鸭源WFZ株(KC990545.1)的核苷酸序列同源性最高为99.5%,与鹅源坦布苏病毒(duck eggdrop syndrome virus strain goose,JQ920424.1)和鸡源坦布苏病毒(CJD50,JF926699)的核苷酸序列同源性较低为98.9%。用Net NGlyc 1.0 Server在线软件对病毒蛋白潜在糖基化位点进行预测,结果表明在SDS株病毒多聚蛋白中共有13个潜在的糖基化位点,分别位于5个不同病毒蛋白中。     

雏鸭坦布苏病毒分离鉴定及全基因序列分析

山东潍坊地区某鸭场养殖的21日龄樱桃谷鸭突然发病,病鸭主要表现翅腿瘫痪等神经症状,排黄绿色或黄白色稀粪,病死率5%左右。为了确定发病鸭群感染病原的种类,首先采集病死鸭肝脏,处理后接种9日龄~11日龄SPF鸡胚进行病原分离。其次,对分离的病原RT-PCR扩增和序列测定,MEGA5绘制系统发育进化树,DNA Star软件分析核苷酸同源性。结果表明,通过SPF鸡胚分离到一株坦布苏病毒(TMUV),命名为TMUV-SDWF。该病毒株基因组全长为10 990nt,编码1个含3 426个氨基酸的多聚蛋白。系统发育进化树分析显示,TMUV-SDAG毒株属于Ⅰa分支。核苷酸同源性分析表明,TMUV-SDSG与GenBank上公布的16株不同TMUV分离株核苷酸同源性高达97.0%~99.8%。成功分离鉴定一株鸭坦布苏病毒并对其进行了遗传进化分析,为鸭坦布苏病毒弱毒或灭活疫苗的筛选制备及该病毒分子流行病学的研究奠定了基础。     

禽腺病毒血清4型吉林株的分离鉴定与遗传变异分析

对吉林地区送检的疑似禽腺病毒感染样品进行了分子流行病学调查,并对检测为阳性的样品进行病毒分离鉴定,共得到61个I型禽腺病毒流行毒株。对hexon基因进行的PCR扩增,获得长度为1 414,1 786,1 670bp的基因片段。通过测序分析发现,吉林地区禽腺病毒流行毒株基因型由B型变化为C型,血清型4型。根据同源性分析结果显示,本次获得的3个分离株与禽腺病毒4型标准毒株ON1株的核苷酸序列相似性较高,达到了99.1%。     

鸭坦布苏病毒山东流行株的分离鉴定及其基因组序列分析

为了解山东省鸭坦布苏病毒(duck tembusu virus,DTMUV)的流行与变异情况,对2018年下半年至2019年上半年泰安、济宁和淄博等地送检的临床病鸭样品进行了DTMUV病原学检测,并对阳性病料进行病毒分离鉴定及分离株的全基因组序列分析。结果显示:从102份样品中,共检测到8份DTMUV阳性,阳性率检出率为7.8%,从阳性病料中分离到3株DTMUV分离株;3个分离株基因全长均为10 993 bp,彼此间的氨基酸同源性为99.2%～99.3%,与24个参考毒株的同源性为95.8%～99.9%,均属于中国株I型;与参考毒株相比,分离株的核衣壳蛋白C、囊膜蛋白E和非结构蛋白NS1的同源性相对较低,分别为86.1%～99.2%,95.0%～99.4%和92.3%～99.7%,同时存在数量不等的氨基酸突变位点,但关键的蛋白结构和潜在的糖基化位点无差异。结果表明,DTMUV在山东部分地区仍有流行,但流行毒株基因结构及致病特性与经典毒株相比无明显变化,但应持续关注和深入研究。     

广东省猪流感病毒的分离鉴定及遗传进化分析

为了解广东地区猪流感病毒(SIV)的流行和变异情况,本研究于2013年10月至2014年1月从广东省4个不同地区采集猪鼻拭子和肺脏病料共203份,对样品处理之后进行鸡胚分离和RT-PCR检测,从中分离得到5株SIV,对其进行病毒纯化、全基因组测序和遗传进化分析。结果表明,5株SIV分离毒株其中3株为H1N1亚型,2株为H1N2。分离毒株HA裂解位点位于PSIQSR↓GL,具有典型的低致病性流感病毒特征。HA基因序列比对结果显示,5株SIV分离毒株与A/Jiangsu/ALS1/2011(H1N1)株同源性最高,核苷酸相似性为97%~99%。遗传进化分析结果显示,5株分离毒株的PB2、PB1、PA和NP基因片段属于PDM/09分支,M基因片段以及外部基因片段HA属于欧亚类禽分支,NS基因片段属于北美三元重组分支,3株H1N1亚型的NA基因属于欧亚类禽分支,2株H1N2亚型的NA基因属于人季节性流感分支。抗原位点分析结果表明,分离毒株的抗原位点基本保守,但YJ28分离株HA1蛋白上发现3个氨基酸突变,分别是L69S、S137P、E222G。本研究通过对广东省不同地区分离到的SIV进行鉴定分析,掌握SIV的变异趋势,为猪流感的防控提供切实有效的理论依据。     

2007-2010年江苏地区猪繁殖与呼吸综合征病毒RT-PCR检测及部分Nsp2基因序列分析

本研究参考GenBank已发表的猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV）Nsp2基因序列,在高致病性病毒Nsp2基因缺失区的两端保守区设计并合成了一对引物,建立并优化了能够区分经典PRRSV和高致病性PRRSV的RT-PCR诊断方法,并利用该方法对2007～2010年间江苏地区的45份可疑临床病料进行了检测。结果表明临床病料阳性率为40％,所有毒株均属于高致病性毒株。对PRRSV阳性病毒的Nsp2基因序列分析表明,所有18株PRRSV均属于美洲型毒株,与中国高致病性PRRSV代表毒株JXA1、WUH1的氨基酸同源性分别在82．2％～97．6％、80．4％～95.3％。此外,18株病毒的Nsp2共同存在不连续的30个氨基酸缺失,缺失位置与同期中国高致病性PRRSV具有相同的特征。通过本研究掌握了江苏地区2007～2010年间PRRSV流行情况及Nsp2基因变异特征,为地方猪繁殖与呼吸综合征的临床诊断和防治提供参考依据。     

Influenza A viruses in birds and humans: Prevalence,molecular characterization,zoonotic significance and risk factors' assessment in poultry farms

This study aimed to investigate the prevalence of influenza A viruses in birds and humans residing in the same localities of Sharkia Province, Egypt and the risk factors' assessment in poultry farms. A total of 100 birds comprised of 50 chickens, 25 ducks and 25 wild egrets were sampled. Swab samples were collected from 65 people (50 poultry farm workers and 15 hospitalized patients). All samples were screened for the presence of influenza A viruses using isolation and molecular assays. Avian influenza viruses were only detected in chicken samples (18%) and molecularly confirmed as subtype H5. The infection rate was higher in broilers (40%) than layers (8.6%). Influenza A (H1) pdm09 virus was detected in a single human case (1.54%). All the isolated AI H5 viruses were clustered into clade (2.2.1.2) and shared a high similarity rate at nucleotides and amino acid levels. In addition, they had a multi-basic amino acid motif (ـــPQGEKRRKKR/GLFـــ) at the H5 gene cleavage site that exhibited point mutations. Chicken breed, movement of workers from one flock to another, lack of utensils' disinfection and the introduction of new birds to the farm were significant risk factors associated with highly pathogenic AI H5 virus infection in poultry farms (p ≤ 0.05). Other factors showed no significant association. The HPAI H5 viruses are still endemic in Egypt with continuous mutation. Co-circulation of these viruses in birds and pdm09 viruses in humans raises alarm for the emergence of reassortant viruses that are capable of potentiating pandemics.     

Molecular characterization of the surface glycoprotein genes of highly pathogenic H5N1 avian influenza viruses detected in Iran in 2011

Highly pathogenic avian influenza (HPAI) H5N1 virus is causing the death of a large number of wild birds and poultry. HPAI H5N1 was reported in the north of Iran in 2011. In this study, two A/Chicken/Iran/271/2011 and A/Duck/Iran/178/2011 viruses were genetically characterized by sequence analysis of Hemagglutinin (HA) and Neuraminidase (NA) genes. Phylogenetic analysis revealed that these viruses were different from previous Iranian isolates (Clade 2.2) and belonged to the subclade 2.3.2.1. The results showed that the detected viruses are almost identical to each other and closely related to HPAI H5N1 strains isolated in Mongolia in 2010. Based on the amino acid sequence analysis, these viruses at their HA cleavage sites contained the multibasic amino acid motif PQRERRRK-R/GLF lacking a lysine residue compared with the previous reports of the same motif. There is also a 20-amino acid deletion (resides 49–69) in the NA stalk similar to other viruses isolated after 2000. It seems that introduction of HPAI H5N1 to Iran might have happened by wild birds from Mongolian origin virus.     

广东地区鸭黄病毒JM株的分离和初步鉴定

2010年4月以来,我国部分地区陆续发生以产蛋鸭产蛋急剧下降为特点的疾病。从广东省江门地区某鸭场的发病鸭群采集样品,接种鸭胚后分离到一株病毒,并命名为JM株,经RT-PCR检测为黄病毒核酸阳性。序列测定后分析显示,该分离株JM株与黄病毒属Tembusu病毒的对应序列相似性最高,其中与Tembusu病毒JS804株相似性最高达98%。结果表明,JM株为黄病毒,与该病鸭产蛋急剧下降有关。     

Isolation and characterization of influenza A virus (subtype H5N1) that caused the first highly pathogenic avian influenza outbreak in chicken in Bhutan

We characterized Influenza A/H5N1 virus that caused the first outbreak of highly pathogenic avian influenza (HPAI) in chickens in Bhutan in 2010. The virus was highly virulent to chicken, killing them within two days of the experimental inoculation with an intravenous pathogenicity index (IVPI) of 2.88. For genetic and phylogenetic analyses, complete genome sequencing of 4 viral isolates was carried out. The isolates revealed multiple basic amino acids at their hemagglutinin (HA) cleavage site, similar to other "Qinghai-like" H5N1 isolates. The receptor-binding site of HA molecule contained avian-like amino acids ((222)Q and (224)G). The isolates also contained amino acid residue K at position 627 of the PB2 protein, and other markers in NS 1 and PB1 proteins, highlighting the risk to mammals. However, the isolates were sensitive to influenza drugs presently available in the market. The sequence analysis indicated that the Bhutan viruses shared 99.1-100% nucleotide homology in all the eight genes among themselves and 2010 chicken isolate from Bangladesh (A/chicken/Bangladesh/1151-11/2010) indicating common progenitor virus. The phylogenetic analysis indicated that the Bhutan isolates belonged to sub-clade 2.2.3 (EMA 3) and shared common progenitor virus with the 2010 Bangladesh virus. Based on the evidence of phylogeny and molecular markers, it could be concluded that the outbreaks in Bhutan and Bangladesh in 2010 were due to independent introductions of the virus probably through migratory birds.     

Novel reassortant H5N6 highly pathogenic influenza A viruses in Vietnamese quail outbreaks

Avian influenza A H5N6 virus is a highly contagious infectious agent that affects domestic poultry and humans in South Asian countries. Vietnam may be an evolutionary hotspot for influenza viruses and therefore could serve as a source of pandemic strains. In 2015, two novel reassortant H5N6 influenza viruses designated as A/quail/Vietnam/CVVI01/2015 and A/quail/Vietnam/CVVI03/2015 were isolated from dead quails during avian influenza outbreaks in central Vietnam, and the whole genome sequences were analyzed. The genetic analysis indicated that hemagglutinin, neuraminidase, and polymerase basic protein 2 genes of the two H5N6 viruses are most closely related to an H5N2 virus (A/chicken/Zhejiang/727079/2014) and H10N6 virus (A/chicken/Jiangxi/12782/2014) from China and an H6N6 virus (A/duck/Yamagata/061004/2014) from Japan. The HA gene of the isolates belongs to clade 2.3.4.4, which caused human fatalities in China during 2014–2016. The five other internal genes showed high identity to an H5N2 virus (A/chicken/Heilongjiang/S7/2014) from China. A whole-genome phylogenetic analysis revealed that these two outbreak strains are novel H6N6-like PB2 gene reassortants that are most closely related to influenza virus strain A/environment/Guangdong/ZS558/2015, which was detected in a live poultry market in China. This report describes the first detection of novel H5N6 reassortants in poultry during an outbreak as well as genetic characterization of these strains to better understand the antigenic evolution of influenza viruses.     

H9N2禽流感病毒中国分离株血凝素基因序列的初步分析

10株中国H9N2禽流感病毒分离株的血凝素基因分析表明，这些分离株间的亲缘关系较近，推测它们可能来源于同一种系，H9亚型分离株的HA1亚单位系统发育分析表明中国AIV分离株与97香港禽类市场上分离到的毒株不同，中国分离株中在HA切割位点上均未见到典型的高致病力毒株H5、H7所具有的一系列碱性氨基酸，其排列均为－PARSSGLF－，系统发育分析表明该10株属欧亚种系。