2014年中国不同地区对虾白斑综合征病毒ORF14/15和ORF23/24缺失区序列比较

对虾养殖面临诸多病害威胁,对虾白斑综合征病毒(White spot syndrome virus, WSSV)是养殖对虾主要病原之一,WSSV不同地理株的变异可能导致WSSV毒力的变化。为了解2014年中国大部分地区WSSV ORF14/15和ORF23/24的变异情况,本研究选择2014年1月–8月期间采集的48份WSSV阳性样本,用特异引物扩增ORF14/15和ORF23/24片段,连接于T载体,转化至Top10中,筛选阳性克隆,测序分析不同样本之间的缺失差异。结果显示,能够扩增ORF14/15和ORF23/24样品的比例分别为43.75%和33.33%。在ORF14/15扩增中,分别扩增出1260 bp、1270 bp、1892 bp和2662 bp片段,与TH-96-Ⅱ比对共有4种缺失情况,即缺失6540 bp、6530 bp、5908 bp和5138 bp。而在ORF23/24扩增中,分别扩增出1140 bp和1146 bp片段,与中国台湾株(TW)比对有两种缺失情况,即缺失12070 bp和12064 bp。研究结果表明,WSSV在中国大部分地区存在一定程度的变异,而不同毒株之间在ORF14/15可变区差异比较明显,在ORF23/24可变区差异不大,但均具有大片段缺失。     

湖北地区克氏原螯虾白斑综合征病毒变异区ORF14/15、ORF23/24基因序列比较分析

试验扩增、克隆了在湖北地区采集的19份克氏原螯虾(Procambarus clarkii)白斑综合征病毒(White spot syndrome virus,WSSV)阳性样品的变异区ORF14/15和ORF23/24基因,通过测序比较分析了湖北各WSSV毒株与Gen Bank公布的标准毒株间在变异区ORF14/15及ORF23/24基因的差异性。结果显示,19份WSSV阳性样品中有部分样品在变异区扩增出ORF14/15、ORF23/24基因片段,变异区基因序列分析发现,与Gen Bank已公布的标准毒株相比,存在大片段缺失。在变异区ORF14/15,有3个毒株扩增出1 442 bp的片段,4个毒株扩增出630 bp的片段,基于变异区ORF14/15构建的系统进化树显示,这些毒株归属两个不同的分支。在变异区ORF23/24,有2个毒株扩增出大小为2 096 bp的片段,进化分析发现这2个毒株在变异区ORF23/24的遗传距离较近。     

2017年中国部分地区白斑综合征病毒高变异区的序列分析

白斑综合征病毒(WSSV)自暴发以来给全球范围内的对虾养殖产业带来了巨大的损失。为了解我国凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)养殖区WSSV的流行变异情况,选取2017年中国部分地区的42个WSSV阳性样本,对ORF14/15、ORF23/24、ORF75、ORF94和ORF125共5个可变区进行PCR特异性扩增,分析其序列的缺失变异和重复单元(Ru)中单核苷酸多态性的变化。研究结果显示,在ORF14/15的扩增中共出现4种缺失片段;ORF23/24只出现11945bp的缺失片段;ORF75扩增中,总RUs数目为3、4、9,其中45bp的RUs在12、27、80位点发生多核苷酸多态性;ORF94的RUs数目为6,其各重复单元在48位发生单核苷酸多态性;ORF125的RUs数目为4、6、7不等,其各重复单元分别在20、27、50、53、61位发生碱基突变。研究结果表明,2017年样本中,WSSV在中国大部分地区均出现一定程度的缺失变异,其中部分可变区表现出缺失情况的稳定性,某些可变区的重复单元数目及SNP表现出地区的差异性以及不稳定性。     

2015年中国典型对虾养殖区WSSV流行株高变异区序列的分析比较

为了解我国白斑综合征病毒(WSSV)流行变异特征,本研究对2015年4~10月期间在山东、江苏、天津、浙江、海南和广东6省市采集到的57份WSSV阳性的样本,通过特异性的扩增目的片段,根据测序结果分析比较不同地区、不同分离株之间在ORF14/15、ORF23/24上的缺失变异情况,以及ORF75、ORF94和ORF125上的重复单元(Repeat unit, RU)数目差异。结果显示,在ORF14/15扩增中,分别有6530、5908和5725 bp的片段缺失,而在ORF23/24扩增中均有12070 bp大片段的缺失,ORF75的45 bp的RU数目分别为1、2和3,102 bp的RU数目均为1,而ORF94的RU数目分别为4、5、10和12不等,ORF125的RU数目为3、5和6。结果表明,WSSV在部分开放型阅读框上表现出明显的变异差异,而在某些开放型阅读框上的缺失情况则有显著的稳定性。     

白斑综合征病毒江苏分离株变异区和缺失区基因的序列比较

为了解白斑综合征病毒(White spot syndrome virus,WSSV)在养殖克氏原螯虾(Procambarus clarkii)中的感染流行情况和分子流行病学特征,以及探讨不同病毒株间的遗传进化差异,2008年7月至2010年6月在江苏各主要克氏原螯虾养殖产区共采集了83份样品,应用环介导等温扩增技术(LAMP)检测42份样品为病毒感染阳性,阳性率达50.6%。在此基础上考虑地理和时间因素选取了兴化、盱眙等地的6份样品,PCR扩增、克隆了样品中所携带病毒的变异区和缺失区基因并对其进行了测序。分析结果显示,在变异区除兴化毒株为1 829 bp之外,其余各分离株间差异微小,均在1 440 bp左右;而在缺失区各毒株大小均为384 bp,且核苷酸序列完全一致。随后将各分离株序列与GenBank已公布的毒株做进一步的序列比较分析,结果表明在江苏境内流行的兴化毒株与其余毒株间存在明显差异,在遗传上相距较远,并且推测WSSV变异区和缺失区可能是各自独立进化变异的;同时,缺失变小的病毒基因组更易于适应宿主和环境的变化。     

2013年中国典型对虾养殖区白斑综合征病毒流行株高变异区序列的分析比较

为了解中国不同地区白斑综合征病毒的流行变异情况,本研究取用2013年3—12月从7个省市发病地区采集到的64份WSSV阳性样本,以特异的引物扩增目的片段,通过测序分析不同样本的缺失及变异差异。结果显示,在开放阅读框ORF14/15的扩增中,分别有6530 bp、6533 bp和5138 bp的片段缺失,而在ORF23/24扩增中有12070bp大片段的缺失,不同地区样本中未能成功扩增ORF75,而ORF94的重复单元数目分别为0、3、4、12不等,ORF125的重复单元数目为0、7。SNP分析表明,含有3个重复单元的ORF94在48位的碱基为T、T、T,重复单元数为4的在48位的碱基为T、T、T、T,重复单元数为12的在48位的碱基分别为T及11个A。而ORF125所有重复单元数为7的情况在8、18、25、66、69位置的碱基均为G、G、G、G、A,在9、50、53、61位的碱基也普遍出现了变异。结果表明,WSSV在中国不同地区存在一定程度的变异,其在序列中的缺失、重复单元数目以及SNP的差异较为明显。     

白斑综合征病毒(WSSV)在市售克氏原螯虾中携带情况调查

近年来白斑综合征成为制约克氏原螯虾养殖的重要病害。对市场销售的克氏原螯虾抽样调查,采用PCR仪检测白斑综合征病毒(WSSV)的携带情况,结果为:湖泊养殖的克氏原螯虾不携带WSSV,池塘单养的克氏原螯虾及江河野生克氏原螯虾携带WSSV。     

养殖克氏原螯虾体内白斑综合征病毒的绝对定量分析

近年来克氏原螯虾的养殖受到WSSV的威胁,病毒在宿主组织中的绝对定量对于了解病毒的致病性具有重要意义,但克氏原螯虾组织中WSSV的绝对定量分布还有待研究。实验调查了湖北省5个主养区克氏原螯虾WSSV的感染率,结果表明80%以上克氏原螯虾都携带有WSSV。采用WSSV-VP28蛋白特异性抗体对克氏原螯虾提取蛋白进行Western Blot检测,在WSSV-PCR阳性样品中可检测到VP28特异性条带,在WSSV-PCR阴性样品中没有检测到相应条带。采用实验室建立的WSSV绝对定量PCR方法,对携带病毒的克氏原螯虾6个组织(鳃、胃、肠、血淋巴细胞、肝胰腺和心脏)进行检测。结果表明,在鳃、胃和肠可检测到较多病毒量(约108拷贝/mg),其次是血淋巴细胞(107拷贝/mg)、肝胰腺(106拷贝/mg),在心脏中病毒的含量最低(103拷贝/mg),表明病毒的复制存在组织特异性。结果显示WSSV主要存在于消化系统中,预示着克氏原螯虾可能主要在摄食过程中感染WSSV;不同地区克氏原螯虾组织病毒携带量表现出一定差异,预示着WSSV感染可能受到环境因素的影响。     

白斑综合征病毒(WSSV)对不同规格克氏原螯虾(Procambarus clarkii)致病力及ATPase活性的影响

以投喂患白斑综合征病毒病(WSSV)的南美白对虾组织的方法人工感染健康的克氏原螯虾,利用PCR检测实验克氏原螯虾的感染情况;同时比较健康的克氏原螯虾和感染病毒的克氏原螯虾体内ATPase活性.结果显示:白斑综合征病毒可以感染克氏原螯虾,受感染的克氏原螯虾体内病毒含量与其死亡呈正相关;健康的克氏原螯虾和感染病毒的克氏原螯虾体内的ATPase活性分别为7.337 U/mgprot和4.212 U/mgprot,有极其显著的差异.     

湖北省潜江地区克氏原螯虾(procambarus clarkii)白斑综合征(White Spot Syndrome)PCR诊断及组织病理学观察

近年来在湖北省范围内人工养殖的克氏原螯虾暴发了严重的疾病,其中白斑综合征病毒（WSSV）已成为危害克氏原螯虾健康养殖的重要病原。2016年5月湖北省潜江市养殖区暴发了一种传染性疾病,为探究此次疾病病因和流行规律,将染病虾进行临床症状观察、对病料进行PCR检测、系统发育树分析、人工感染和组织病理学观察。结果显示,发病克氏原螯虾临床症状主要表现为摄食减少,活力下降,反应迟钝;组织病理学观察结果显示,克氏原螯虾的肝胰腺、肠、肌肉、鳃组织均出现不同程度变性和坏死以及炎性细胞浸润等典型病理学变化,与WSSV感染克氏原螯虾出现的病变相似;PCR检测患病克氏原螯虾样品,结果显示WSSV呈阳性,阳性检出率为55.56%（15/27）,未检测到斑节对虾杆状病毒（MBV）和传染性皮下及造血组织坏死病毒（IHHNV）;检测产物测序并进行系统发育树分析,结果显示,该基因序列与WSSV的EG3株（KR083866.1）核苷酸序列同源性为100%。将病虾的肝胰腺、肠和肌肉组织投喂健康克氏原螯虾,投喂组均表现为急性死亡（累积死亡率为100%）,并出现与自然发病虾相同的症状。WSSV的巢式PCR检测结果显示,人工感染病虾为WSSV阳性。根据以上显示,本次养殖克氏原螯虾大规模死亡的病原是WSSV。     

湖北省潜江地区克氏原螯虾白斑综合征PCR诊断及组织病理学观察

近年来在湖北省范围内人工养殖的克氏原螯虾暴发了严重的疾病,其中白斑综合征病毒(WSSV)已成为危害克氏原螯虾健康养殖的重要病原。2016年5月湖北省潜江市养殖区暴发了一种传染性疾病,为探究此次疾病病因和流行规律,将染病虾进行临床症状观察、对病料进行PCR检测、系统发育树分析、人工感染和组织病理学观察。结果显示,发病克氏原螯虾临床症状主要表现为摄食减少,活力下降,反应迟钝;组织病理学观察结果显示,克氏原螯虾的肝胰腺、肠、肌肉、鳃组织均出现不同程度变性和坏死以及炎性细胞浸润等典型病理学变化,与WSSV感染克氏原螯虾出现的病变相似;PCR检测患病克氏原螯虾样品,结果显示WSSV呈阳性,阳性检出率为55.56%(15/27),未检测到斑节对虾杆状病毒(MBV)和传染性皮下及造血组织坏死病毒(IHHNV);检测产物测序并进行系统发育树分析,结果显示,该基因序列与WSSV的EG3株(KR083866.1)核苷酸序列同源性为100%。将病虾的肝胰腺、肠和肌肉组织投喂健康克氏原螯虾,投喂组均表现为急性死亡(累积死亡率为100%),并出现与自然发病虾相同的症状。WSSV的巢式PCR检测结果显示,人工感染病虾为WSSV阳性。根据以上显示,本次养殖克氏原螯虾大规模死亡的病原是WSSV。     

克氏原螯虾白斑病毒株(WSSV-Cc)基因组的一个印迹

从自然感染、濒死的克氏原螯虾中分离出的白斑病毒株(Cambarus clarkii whispovirus,WSSV-Cc或Cc株)是一株基因组较小的新毒株。为寻找白斑病毒进化过程在基因组中留下的印迹,进行了显微和超微观察、基因组架构与系统发育分析及相关基因扩增等研究。选择Cc株74L、86L、87R、88R、92R和95R的6个基因,与8个白斑病毒株的同源基因所编码蛋白序列构建进化树,结果可分为克氏原螯虾病毒(Cc株、CN02株、Pc株)和海水对虾病毒(CN株、CN01株、CN03株、CN04株、TW株和KR株) 2支。再对不同毒株的同源蛋白进行多重序列比对,显示Cc-87R是与海水对虾病毒株同源蛋白差异显著、缺失跨膜区(TMD)及其相邻287 aa序列、但仍有完整PI3K_rbd结构域的病毒膜蛋白。进一步设计和使用87R-F/87R-R和238-F/87R-R两对引物,分别以淡水小龙虾病毒Cc株和海水对虾病毒CN株的基因组为模板进行核酸扩增,结果从Cc株模板中扩增到大小为709 bp,含Cc-87R全部序列的核酸片段;而从CN株的模板中却扩增到大小分别为1 600和4 810 bp,仅含Cc-87R部分序列的核酸片段,为Cc-87R是Cc株基因组中一个序列结构独特的印迹提供了实验证据。这一发现将有助于克氏原螯虾白斑病毒病原的检测及其流行趋势预警。     

常规PCR与巢式PCR法快速检测克氏原螯虾白斑综合征病毒(WSSV)

对传统对虾白斑综合征病毒(WSSV)的PCR检测方法中的病毒模板DNA的提取方法加以改进,建立了一种快速检测克氏原螯虾(Procambarus clarkii)WSSV的PCR方法。本方法将克氏原螯虾肝胰腺组织匀浆液冻融3次进行差速离心后,在病毒沉淀中加入50μL蛋白酶K溶液,室温消化5 min,沸水中煮10 min后,10000 r/min高速离心5 min即可取上清液用于PCR扩增,结果显示:与传统的病毒模板DNA提取方法相比,本方法的PCR结果特异性强,扩增效率高,准确率高,可应用于快速大规模检测克氏原鳌虾中的WSSV。     

克氏原螯虾自噬相关基因PcAtg2的克隆及其在白斑综合征病毒胁迫下的表达分析

为了解自噬相关基因Atg2在克氏原螯虾(Procambarus clarkia)先天免疫中的作用,本研究克隆了克氏原螯虾Atg2 (PcAtg2)基因全长序列。生物信息学分析显示,PcAtg2蛋白编码序列全长为9 966 bp,推测其编码2 189个氨基酸。组织定量表达分布显示,PcAtg2在克氏原螯虾的各个组织中均有表达,其中在肝胰腺中表达最高,在眼柄中表达最低。在白斑综合征病毒(WSSV)感染实验中,PcAtg2基因表达量在不同组织中均呈现显著上调趋势。RNA干扰(RNAi)实验显示,PcAtg2基因沉默后,WSSV在克氏原螯虾体内的增殖明显被抑制,同时,自噬相关基因的表达量上调。透射电镜分析结果显示,在WSSV感染后,PcAtg2基因沉默组中克氏原螯虾肝胰腺组织中的自噬小体多于对照组。本研究结果可为了解克氏原螯虾应对WSSV胁迫下的调控机制提供理论参考。     

高温应激对克氏原螯虾免疫酶活性及抗WSSV感染的影响

为探明高温应激对克氏原螯虾(Procambarus clarkia)抗病力的影响,分别采用30℃和35℃水温进行高温应激试验,应激前和应激后3、6、12、24和48 h分别采集血淋巴样本,测定总超氧化物歧化酶(T-SOD)、多酚氧化酶(PPO)、溶菌酶(LYZ)、酸性磷酸酶(ACP)以及碱性磷酸酶(ALP)等免疫相关酶类指标。并在上述高温应激下开展白斑综合征病毒(WSSV)人工感染实验,同时设置25℃为阳性和阴性对照组,于感染后3、6、12、24、48、72 h取鳃组织定量测定WSSV在组织中的载量,同时记录克氏原螯虾的发病和死亡情况,统计累积死亡率。结果显示,克氏原螯虾血淋巴中的T-SOD与LYZ含量在高温应激后都出现了显著性降低,而PPO、ACP和ALP的变化差异不大。在35℃饲养条件下,WSSV在克氏原螯虾体内的增殖受到抑制,实验虾发病慢,累积死亡率相对较低,但在30℃饲养条件下,WSSV在克氏原螯虾体内的增殖较常温(25℃)下更活跃,发病和死亡更快。结果表明,高温应激能导致克氏原螯虾机体非特异性免疫力降低,30℃时能加快克氏原螯虾感染WSSV的发病进程,而35℃时因病毒复制被抑制而导致疾病的发展受阻。     

克氏原螯虾细胞色素c基因通过调节凋亡途径抑制WSSV感染

细胞凋亡是由一系列相关基因严格调控的细胞程序性死亡,在抵御病原入侵、维持机体内环境稳态等方面有着重要意义。其中细胞色素c从线粒体释放到细胞质中是凋亡开始的关键一步。本研究利用RACE技术首次克隆获得了克氏原螯虾(Procambarus clarkii)细胞色素c基因(PcCytc),全长为897 bp,包括163 bp的5′-UTR、419 bp的3′-UTR和315 bp的开放阅读框,编码104个氨基酸。定量PCR检测结果显示,PcCytc基因在克氏原螯虾的各组织中均有表达,其中在鳃、肠道和肌肉中表达高,在胃中表达最低。WSSV感染实验显示,在病毒感染后PcCytc在肝胰腺、肠道和肌肉组织中的表达水平均出现上调,并在24 h达最高值,约是此时PBS组表达量的2.65、2.07和2.20倍,均存在极显著性差异(P<0.01)。PcCytc基因干扰后,克氏原螯虾体内WSSV病毒拷贝数显著增加(P<0.05),表明PcCytc能够抑制WSSV在克氏原螯虾体内的复制,延迟感染;同时,凋亡相关基因bcl-2、bax和caspase-3的表达均发生显著上调或下调(P<0.05)。本研究表明,PcCytc可通过调节凋亡途径抑制WSSV感染,为克氏原螯虾对WSSV感染的免疫反应提供了新的见解。     

安徽省克氏原螯虾白斑综合征病毒检测及疾病分析

2018年4—5月在安徽省4个市采集稻田养殖的克氏原螯虾(Procambarus clarkii)样本480份,采集池塘、水库的野生克氏原螯虾样本180份,进行白斑综合征病毒(white spot syndrome virus, WSSV)套式PCR检测,并对稻田的水环境、虾的养殖密度、产量及疾病发生情况进行跟踪调查。结果显示,野生虾、养殖虾的WSSV携带率分别为8.89%、98.13%。虾中WSSV首轮PCR检测阳性率≥50%的稻田有10个,其中5个稻田中高密度养殖虾的病死率达20%及以上,5个稻田中适宜密度养殖虾的病死率为10%及以下。pH值偏高、溶解氧过饱和的5号稻田和溶解氧过饱和的6号稻田中高密度养殖虾的病死率也分别高至50%、60%。     

WSSV感染对克氏原螯虾血细胞吞噬和肝胰腺磷酸酶活性的影响

分析了克氏原螯虾Procambarus clarkia人工感染白斑综合征病毒(White Spot Syndrome Virus,WSSV)后,其血细胞吞噬(Phagocytosis)活性,肝胰腺酸性磷酸酶(ACP)、碱性磷酸酶(AKP)活性的变化规律,其目的是为WSSV感染与螯虾的免疫防御反应等研究提供依据.分析结果显示,随着WSSV感染克氏原螯虾时间的延长,血细胞吞噬活性、肝胰腺酸性磷酸酶(ACP)和碱性磷酸酶(AKP)活性也随之改变,其中血细胞吞噬活性的变化规律性比较明显,可作为WSSV感染的敏感指标,也可以用作间接指示克氏原螯虾健康状况的指标.而在不同的感染时间,克氏原螯虾肝胰腺ACP与AKP的活性波动较大,无明显的规律可循,难以作为WSSV感染的敏感指标.     

注射白斑综合征病毒对克氏原螯虾酚氧化酶活力的影响

将白斑综合征病毒(white spot syndrome virus,WSSV)、嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila,Ah)、大肠杆菌(Escherichia coli)(DH5α)用注射法接种克氏原螯虾(Procambarus clarkii),在0~72 h之间定时检测克氏原螯虾血细胞和肝胰脏中酚氧化酶(Phenoloxidase,PO)活力变化。结果显示:(1)0.1 mg/m L和1 mg/m L胰蛋白酶处理样品后,样品间差异不显著。(2)加胰蛋白酶处理与未加胰蛋白酶相比,供试克氏原螯虾PO活力均升高。(3)未加胰蛋白酶与加胰蛋白酶表现出相似的特征,WSSV和Ah注射组与对照组相比均表现为,12~48 h PO活力显著高于对照组,并且在48 h达到最大值,72 h时基本恢复正常;注射DH5α组与对照组相比没有显著性变化。可见感染WSSV后,克氏原螯虾体内酚氧化酶活力发生了变化,由此推测,PO参与了螯虾体内抵御病毒的免疫反应。     

基于线粒体Cytb和COⅠ基因的洞庭湖区养殖克氏原螯虾遗传多样性分析

为了解洞庭湖区养殖克氏原螯虾的遗传多样性，从线粒体Cytb和COⅠ基因入手，经基因组DNA提取、PCR扩增、序列测定和拼接，比较分析了岳阳华容县和益阳南县2处主养殖区内共11个采集点的克氏原螯虾遗传结构。试验结果显示，在华容县的6个采集点中，基于Cytb基因的克氏原螯虾的单倍型多样性指数为0.506,核苷酸多样性指数为0.272 65;基于COⅠ基因的克氏原螯虾的单倍型多样性指数为0.258,核苷酸多样性指数为0.136 1。在南县的5个采集点中，基于Cytb基因的克氏原螯虾的单倍型多样性指数为0.467,核苷酸多样性指数为0.259 74;基于COⅠ基因的克氏原螯虾的单倍型多样性指数为0.244,核苷酸多样性指数为0.122 3。单倍型系统进化树和遗传距离分析表明，11个采集点的克氏原螯虾呈现交叉分布，遗传分化不显著。结果表明，洞庭湖区养殖克氏原螯虾近亲交配严重，遗传多样性低。