VvmiR396及其靶基因VvGRF1在葡萄种子发育过程中的表达分析

[目的]本文旨在鉴定葡萄miR396家族成员(VvmiR396)及其靶基因VvGRF1,探究VvmiR396-VvGRF1在种子败育/发育中的作用模式。[方法]通过miR-RACE、RLM-RACE、PPM-RACE、烟草共转化活体验证等方法鉴定VvmiR396及其靶基因，利用生物信息学分析其潜在功能与进化保守性，利用RT-qPCR方法检测VvmiR396在有核和无核品种中的时空表达差异及VvmiR396-VvGRF1相关性差异。[结果]与葡萄品种‘魏可’相比，‘京可晶’花后28 d时种子发育被严重抑制，出现败育且种子萎缩，而‘魏可’种子正常发育。对VvmiR396a、VvmiR396b、VvmiR396c、VvmiR396d的前体及其成熟体序列进行鉴定，其前体均可形成典型的茎环结构，成熟体序列均位于茎环的5′臂上。VvmiR396与烟草、番茄等物种的同源序列亲缘关系较近，而与小麦的亲缘关系较远。预测到VvmiR396的8条潜在靶基因，利用RLM-RACE、PPM-RACE技术体外鉴定到VvGRF1和VvGRF10是VvmiR396的真实靶基因，且VvmiR396对VvGRF1的裂解位...     

尾叶桉苯丙氨酸解氨酶基因的克隆、表达与单核苷酸多态性分析

【目的】通过获得尾叶桉Eucalyptus urophylla苯丙氨酸解氨酶(PAL)基因序列,分析其在不同水肥处理下的表达模式及在尾叶桉群体中的单核苷酸多态性(SNP),为研究该基因与尾叶桉抗逆性的相关性提供基础。【方法】根据巨桉E.grandis的PAL基因序列设计引物,通过基因克隆、测序获得尾叶桉PAL基因序列;采用逆转录定量聚合酶链式反应(RT-qPCR)分析该基因在不同水肥处理下的表达模式。【结果】PAL基因组全长4 507 bp,包括166 bp的5′非编码区、411 bp的3′非编码区、2 172 bp的氨基酸编码序列(由2个外显子组成,分别为422和1 750 bp)和1 759 bp的内含子区域。PAL基因在AT4处理中表达量最高,在AT5处理中表达量最低。尾叶桉PAL基因与巨桉具有高度相似性。尾叶桉PAL基因的SNP位点主要集中在内含子区域,可见尾叶桉PAL基因在长期进化过程中保持着稳定的遗传。【结论】获得尾叶桉PAL基因全长4 507 bp,该基因具有遗传稳定性,且可能在尾叶桉抗逆性中起重要作用。     

红花miR397a基因表达及对靶基因LAC2的调控作用

【目的】研究红花miR397a前体基因及成熟基因在红花不同组织中的表达水平,并对miR397a基因序列、靶基因及基因功能进行分析,为深入研究红花抗逆机制提供参考。【方法】提取红花籽粒、花瓣、茎、根、叶片等5个组织材料的总RNA,使用荧光定量PCR鉴定miR397a在不同组织中的表达水平;利用生物信息学方法分析红花miR397a基因序列,用原生质体转化方法验证红花miR397a调控的靶基因LAC2,并利用转基因拟南芥表型研究miR397a基因的功能。【结果】miR397a前体基因和成熟基因均能在红花不同组织中表达,且均以叶片组织中的表达量最高,分别是籽粒组织的2.5与1.9倍,差异达极显著水平;miR397a序列在不同物种间高度保守,序列中仅存在1~2个碱基的错配或缺失;miR397a对LAC2基因有调控作用,miR397a的过表达可引起LAC2表达水平降低,红花miR397a表达引起植物对NaCl的敏感性增加。【结论】红花miR397a在叶片组织中的表达量最高,基因序列保守,且红花miR397a表达可增强植物对NaCl的敏感性。     

观赏海棠中McmiR160a的克隆及调控红叶着色的功能分析

【目的】为了验证观赏海棠叶片McmiR160a对花色素苷代谢的调控作用。【方法】以观赏海棠常色红叶品种‘王族’为试验材料,确定miR160a的前体基因序列并对其靶基因进行预测,克隆McmiR160a前体序列并构建过表达载体并瞬时转入‘王族’组培苗。通过高效液相色谱和qRT-PCR分析瞬时侵染植株中花色素苷的含量及其合成途径中结构基因的表达量。【结果】结果表明,在观赏海棠中过表达McmiR160a可以降低花色素苷的含量,同时降低其靶基因和花色素苷代谢途径关键基因表达水平。【结论】研究结果表明,观赏海棠中McmiR160a对花色素苷的合成具有负调控作用。     

烟草microRNA827及其靶基因的鉴定与分析

[目的]本文旨在明确林烟草(Nicotiana sylvestris)microRNA827(miR827)及其靶基因的表达调控特征,揭示其靶基因在进化上的变异性及其功能,为全面解析植物磷信号途径提供新的证据。[方法]基于本课题组前期工作从普通烟草(Nicotiana tabacum)中克隆到的miR827基因序列,采用生物信息学手段结合RACE和RT-q PCR,以及本氏烟草叶片表皮细胞瞬时表达和酵母突变体回补试验,对林烟草miR827的靶基因进行克隆,对miR827及其靶基因的表达模式、靶基因的定位和功能进行研究。[结果]获得林烟草miR827两个靶基因Ns-SPX-MFS1/2的c DNA全长序列,发现Ns-miR827受缺磷诱导表达,而Ns-SPX-MFS1和Ns-SPX-MFS2响应缺磷信号分别发生下调和上调。Ns-SPX-MFS1/2均定位于液泡膜和细胞核。此外,不论Ns-SPX-MFS1/2的开放阅读框全长或截去SPX结构域的2个基因片段均能回补酵母磷吸收突变株。[结论]miR827及其靶基因调控模块在物种进化中存在复杂的变异性,Ns-SPX-MFS1/2具有转运磷的活性,其可能通过介导液泡和细胞质间磷的转运实现对植株磷稳态的调控。     

观赏海棠中McmiR160a的克隆及调控红叶着色的功能分析

【目的】为了验证观赏海棠叶片McmiR160a对花色素苷代谢的调控作用。【方法】以观赏海棠常色红叶品种‘王族’为试验材料,确定miR160a的前体基因序列并对其靶基因进行预测,克隆McmiR160a前体序列并构建过表达载体并瞬时转入‘王族’组培苗。通过高效液相色谱和qRT-PCR分析瞬时侵染植株中花色素苷的含量及其合成途径中结构基因的表达量。【结果】结果表明,在观赏海棠中过表达McmiR160a可以降低花色素苷的含量,同时降低其靶基因和花色素苷代谢途径关键基因表达水平。【结论】研究结果表明,观赏海棠中McmiR160a对花色素苷的合成具有负调控作用。     

csi-miR399响应柑橘溃疡病菌侵染的表达模式及其抗病性分析

【目的】明确csi-miR399响应柑橘溃疡病菌（Xanthomonas citri subsp. citri,Xcc）侵染的表达模式，筛选其靶基因，进而分析csi-miR399与寄主Xcc抗性的相关性，为柑橘溃疡病抗性种质的创制打下基础。【方法】分别以柑橘溃疡病抗性品种四季橘（Citrus microcarpa）和感病品种纽荷尔脐橙（Citrus sinensis）为试材，通过茎环qPCR方法分析csi-miR399在叶片离体注射Xcc 1、3和5 d时的表达量变化，明确抗/感品种中csi-miR399响应Xcc侵染的表达模式；利用在线软件psRNATarget预测csi-miR399的靶基因，并通过qPCR分析候选靶基因在接种Xcc柑橘叶片和瞬时表达csi-miR399叶片中表达量的变化；克隆csi-miR399前体基因序列，通过同源重组方法构建病毒表达载体pCLBV202-MIR399，根癌农杆菌介导的真空浸润法接种尤力克柠檬（Citrus limon），通过qPCR分析csi-miR399表达量；进而采用离体叶片针刺法接种Xcc，观察发病症状，统计病情指数，分析csi-miR3...     

观赏海棠中McmiR160a的克隆及调控红叶着色的功能分析

【目的】为了验证观赏海棠叶片McmiR160a对花色素苷代谢的调控作用。【方法】以观赏海棠常色红叶品种‘王族’为试验材料，确定miR160a的前体基因序列并对其靶基因进行预测，克隆McmiR160a前体序列并构建过表达载体并瞬时转入‘王族’组培苗。通过高效液相色谱和qRT-PCR分析瞬时侵染植株中花色素苷的含量及其合成途径中结构基因的表达量。【结果】结果表明，在观赏海棠中过表达McmiR160a可以降低花色素苷的含量，同时降低其靶基因和花色素苷代谢途径关键基因表达水平。【结论】研究结果表明,观赏海棠中McmiR160a对花色素苷的合成具有负调控作用。     

MYL1基因mRNA选择性剪切体的鉴定及其在不同发育时期的蓝塘与长白猪骨骼肌中的表达

肌球蛋白轻链1基因(MYL1)的2个剪切体MLC1f及MLC3f在骨骼肌不同发育时期中发挥着重要作用。为进一步了解MYL1基因在猪骨骼肌发育过程中的重要作用,通过电子克隆、RT-PCR扩增及实时定量PCR方法克隆和鉴定了猪MYL1基因mRNA 5个选择性剪切体(MLC1f、MLC3f、MLC5f-A、MLC5f-B和MLC5f-C)。其中MLC5f-A、MLC5f-B和MLC5f-C是在猪背最长肌中鉴定到的MYL1基因的3个新转录本,目前在人、鼠等其它物种尚无这三种转录本的报道。结果表明,剪切体MLC3f在180日龄长白猪中的表达量最高,而剪切体MLC1f则是在90日龄蓝塘猪的表达量最高;剪切体MLC5f-A在蓝塘与长白猪中各发育时期的表达量都很低;除了剪切体MLC1f外,其余转录本的表达量均为随个体体重的增加而逐步增加。通过对MYL1基因不同选择性剪切体的鉴定,为其在骨骼肌不同发育阶段或组织类型特异性表达调控研究奠定了基础,为该基因功能的研究提供重要线索。     

大豆rbcS基因启动子的克隆及在转基因烟草中的功能缺失分析

【目的】进一步验证栽培大豆rbcS基因启动子功能,为植物基因工程相关研究提供启动子资源。【方法】从栽培大豆中克隆了rbcS基因5′端上游1 538bp的DNA序列,根据光诱导表达调控元件及顺式作用功能元件所在的位置,设计含1 089,712和190bp 3个5′端缺失体,并将rbcS基因启动子(1 538bp)及3个5′端系列缺失体序列分别与gus基因融合,构建植物表达载体并命名为pGmrbcS、pA、pB和pC,用农杆菌介导法转化烟草,通过gus基因活性变化检测不同缺失体的表达特性。【结果】克隆了1 538bp的大豆rbcS基因启动子序列及1 089,712和190bp的5′端缺失体启动子片段。GUS活性检测表明,在pGmrbcS转基因烟草的叶中GUS活性最高,且与pCAMBIA1301转基因烟草叶片中CaMV35S启动子驱使gus基因的表达量相当,而茎、根中GUS活性较低。GUS定量分析表明,T1代转基因烟草光下培养时,3种缺失体启动子叶片中的GUS表达活性均与CaMV35S启动子相当,其中pB活性最高,是CaMV35S启动子活性的1.4倍,pA、pC活性低于pB,分别为pB活性的84%和71%;含pA的转基因烟草于黑暗中萌发的幼苗叶片gus基因不表达,光下萌发幼苗叶片有gus基因表达,而含有pB、pC的转基因烟草,在黑暗和光下萌发的幼苗叶片中均有gus基因表达,且表达量以pB最高。【结论】含有长度为1 089bp(pA)光诱导元件的rbcS基因缺失体启动子具有光诱导和组织特异表达特性,长度为712bp(pB)的缺失体启动子的启动活性最高。     

绵羊miRNA-411a与其靶基因FLT3的相互作用

miRNAs是一类长约22 nt的非编码单链小RNA分子,主要与靶基因的3′UTR结合参与生物体基因的表达和调控过程。已经证实许多miRNA通过对靶标的调控,在支原体肺炎感染过程中起重要作用。为验证miRNA-411a与预测的靶基因 FLT3间存在相互作用,采用生物信息学方法分析预测其二级结构,利用荧光定量PCR技术分析miRNA-411a的正常表达和过量表达后靶基因 FLT3的相对表达量,双荧光素酶报告基因试验验证两者的相互作用。结果表明,miRNA-411a与其靶基因 FLT3能形成典型的二级茎环结构;在过量表达miRNA-411a后,其靶基因 FLT3的表达量显著降低。综上所述,miRNA-411a是通过与 FLT3的3′UTR结合而发挥作用,确定 FLT3是miRNA-411a的靶基因。     

高山松miR171a及其靶基因的鉴定与表达分析

以裸子植物高山松为试验材料,利用笔者所在实验室前期构建的高山松miRNA数据,通过生物信息学方法筛选与高山松生长发育相关的miR171a,并通过基于RNA连接酶的cDNA末端快速扩增法(RLM-5′RACE)验证得出,GRAS家族转录因子(Unigene10015)和肌动蛋白结合蛋白(Unigene83401)的基因为高山松miR171a的靶基因.通过PCR技术克隆得到的高山松miR171a前体序列可形成茎环发夹结构,但其成熟序列的碱基保守性较差.系统进化分析显示,pde-miR171a与裸子植物火炬松的进化关系较近.经qRT-PCR分析发现,pde-miR171a在高山松茎中的相对表达量最高,其次是在针叶中,而靶基因Unigene10015在茎、针叶中的相对表达量较低,暗示pde-miR171a可以通过调控靶基因Unigene10015而参与高山松的生长发育.     

烟草NtNAC-R1基因内含子鉴定与瞬时表达分析

克隆烟草NtNAC-R1基因,并进行瞬时表达分析,探讨其是否含有内含子及其在烟碱生物合成中的调控作用.以烟草基因组DNA为模板克隆得到NAC转录因子NtNAC-R1,鉴定结果表明,该基因含有2个内含子.通过构建真核表达载体,建立瞬时表达分析体系,RT-PCR检测结果显示NtNAC-R1基因过表达,烟碱生物合成关键基因PMT表达量升高,JA信号途径标记基因PDF1.2和IAA响应基因IAA13表达量降低.瞬时表达分析表明,该基因受JA信号和IAA信号途径的交互对话影响,进而调控烟碱的生物合成.     

巨尾桉EuDQD/SDH5基因的克隆与表达分析

【目的】植物莽草酸途径中的莽草酸脱氢酶(Shikimate dehydrogenase,SDH)与脱氢奎尼酸脱水酶(Dehydroquinate dehydratase,DQD)形成的二聚体复合酶(DQD/SDH),是木质素、单宁和黄酮类物质等生物合成的直接或间接前体。体外分离3个巨尾桉EuDQD/SDH5基因(GenBank登录号:KY401151.1、KY401150.1、KY401149.1),研究3个酶的酶动力学及其在巨尾桉中的表达特性,是开展桉树莽草酸脱氢酶家族研究的重要基础。【方法】利用RT-PCR方法克隆EuDQD/SDH5,原核表达DQD/SDH5蛋白,进行纯化蛋白和酶活性分析,通过实时定量PCR技术研究EuDQD/SDH5基因在桉树各组织中的表达特性。【结果】EuDQD/SDH5的3个突变基因的原核表达体系构建成功,3个DQD/SDH5蛋白均具有SDH活性,但是因为基因序列存在差异,导致其对莽草酸的亲和力存在差异,在植物体内EuDQD/SDH5-10对莽草酸的催化效率最大,而EuDQD/SDH5-6对莽草酸的催化效率最低。在桉树组培苗中EuDQD/SDH5基因在叶片中表达量最高,在茎中的表达量稍低,在根中的表达量最低。盆栽苗不同节间的叶片中,该基因的表达量也有差异,在第一节间的叶片中EuDQD/SDH5表达量最高,在中间节间和最下层节间叶片中的表达量相似且都很低。转基因巨尾桉中木质素含量降低的植株其EuDQD/SDH5基因的表达量也降低。【结论】EuDQD/SDH5具有以莽草酸为底物的SDH活性,该基因在植物的不同组织和不同节间的叶片中差异表达,主要在幼叶和茎中表达量高,可能为巨尾桉木质素的生物合成提供前体物质。     

观赏海棠叶片McmiR159a克隆及功能验证

【目的】为了验证观赏海棠叶片McmiR159a对花色苷代谢的调控作用。【方法】以观赏海棠红叶品种‘王族’为试验材料,确定McmiR159a前体基因序列并对其靶基因进行预测,构建McmiR159a过表达载体并瞬时转入‘王族’组培苗。其次通过高效液相色谱和qRT-PCR分析瞬时侵染植株中花色苷的含量及其合成途径中结构基因的表达量。【结果】结果表明,McmiR159a在观赏海棠中过表达下调其靶基因表达,上调花色苷代谢途径关键基因的表达,进而增加花色苷的含量。【结论】研究结果表明,观赏海棠中McmiR159a对花色苷的合成具有正调控作用。     

烟草钾离子通道基因NtTPK的克隆及表达分析

采用同源克隆的方法对烟草品种K326中的一个钾离子通道基因NtTPK进行了研究,该基因序列全长1 317 bp,编码438个氨基酸。实时荧光定量PCR结果表明,该基因在茎中的表达量最高;在低钾处理24 h后该基因表达量最低;200 mmol·L~(-1)NaCl处理24 h后该基因表达量最高;在烟草打顶7 d后,该基因在叶和根中的表达量达到最高。这些结果为进一步研究该基因的功能提供了一定理论基础。     

串联的人胸腺素α1基因在番茄中的高效表达

 【目的】提高免疫活性多肽人胸腺素α1（Tα1）在番茄中的表达量。【方法】根据植物偏爱密码子对Tα1基因进行优化,并将其顺式串联成四联体,同时在单体基因间插入肠激酶剪切位点基因序列,以便表达的融合蛋白可以被肠激酶切割成单体。利用农杆菌介导法将单体Tα1基因和四联体Tα1基因分别转化进入番茄。【结果】两个基因转化番茄后分别得到卡那霉素抗性再生植株19株和10株,PCR和Southern杂交检测证明,部分番茄基因组中整合了外源基因。经过Western和ELISA分析,串联的Tα1基因已经在番茄果实中表达,表达量最高相当于20.2 μg Tα1?g-1果实鲜重,高于单体基因的表达量。【结论】基因串联的方式提高了Tα1基因在番茄中的表达量。     

表达全长与截短HarpinXoo对转基因烟草抗病性的影响

将水稻黄单胞细菌白叶枯致病变种(Xanthomonas oryzae pv.oryzae)编码HarpinXoo的hrfA基因及其N-末端缺失突变基因AB分别连接到双元载体pBI121上,构建成转基因载体,并经冻融法转化土壤杆菌EHA105.采用叶盘法转化烟草,用卡那霉素抗性筛选再生植株.通过PCR扩增检测了转化烟草中的靶基因序列及35S启动子序列,对T1代PCR阳性植株进行了PCR-Southern杂交和RT-PCR分析.结果显示,外源基因已经整合到转基因烟草基因组中,并在转录水平正常表达.用从转hrfA基因和AB片段的烟草中提取的可溶性蛋白注射烟草都能引起过敏反应,说明目的基因在转基因烟草中能表达出有活性的蛋白.抗病性鉴定结果表明,转N-末端AB片段的烟草和转hffA全长基因的烟草一样表现出对烟草花叶病毒(TMV)的抗性.     

表达全长与截短HarpinXoo对转基因烟草抗病性的影响

将水稻黄单胞细菌白叶枯致病变种(Xanthomonas oryzae pv.oryzae)编码HarpinXoo的hrfA基因及其N-末端缺失突变基因AB分别连接到双元载体pBI121上,构建成转基因载体,并经冻融法转化土壤杆菌EHA105.采用叶盘法转化烟草,用卡那霉素抗性筛选再生植株.通过PCR扩增检测了转化烟草中的靶基因序列及35S启动子序列,对T1代PCR阳性植株进行了PCR-Southern杂交和RT-PCR分析.结果显示,外源基因已经整合到转基因烟草基因组中,并在转录水平正常表达.用从转hrfA基因和AB片段的烟草中提取的可溶性蛋白注射烟草都能引起过敏反应,说明目的基因在转基因烟草中能表达出有活性的蛋白.抗病性鉴定结果表明,转N-末端AB片段的烟草和转hffA全长基因的烟草一样表现出对烟草花叶病毒(TMV)的抗性.