梅花鹿心脏组织cDNA文库的构建

[目的]构建梅花鹿心脏cDNA文库。[方法]提取梅花鹿心脏总RNA,纯化mRNA;合成双链cDNA,连接载体,并电转化至感受态细胞;测定文库的克隆数、重组率及插入片段大小。[结果]经鉴定,所构建梅花鹿心脏组织cDNA文库,库容量为3.8×106个克隆,重组率为100%,插入片段大小为0.5～2.0kb,平均长度约为1.0kb。[结论]所构建cDNA文库的各项指标均达到要求。     

毛竹萌发种子全长cDNA文库的构建(英文)

[目的]构建毛竹萌发种子的全长cDNA文库。[方法]以毛竹萌发种子为材料,利用Oligo-capping法构建其全长cDNA文库。[结果]试验得到文库的库容达650万克隆,空载较少;插入片段大小在0.3~5.0kb之间,片段大小的分级严格且一致性良好,其中显著的是长片段全长cDNA(1.0~5.0kb)的比例高达30%,达到了高质量全长cDNA文库的标准。[结论]毛竹萌发种子全长cDNA文库的成功构建将为竹类植物功能基因组研究奠定重要的前期科研基础。     

毛竹萌发种子全长cDNA文库的构建

[目的]构建毛竹萌发种子的全长cDNA文库。[方法]以毛竹萌发种子为材料,利用Oligo-capping法构建其全长cDNA文库。[结果]试验得到文库的库容达650万克隆,空载较少;插入片段大小在0.3～5.0 kb之间,片段大小的分级严格且一致性良好,其中显著的是长片段全长cDNA(1.0～5.0 kb)的比例高达30%,达到了高质量全长cDNA文库的标准。[结论]毛竹萌发种子全长cDNA文库的成功构建将为竹类植物功能基因组研究奠定重要的前期科研基础。     

利用改进的SMART法构建花生种皮全长cDNA文库

SMART法是目前全长cDNA文库构建的重要方法之一。在研究多种构建全长cDNA文库的方法基础上,吸收和改进了SMART法,对特异引物和PCR条件进行可行性的优化,成功构建了高质量的花生种皮全长cDNA文库,改进后的方法更经济、简便易行。经过涂平板测定和酶切反应快速鉴定表明,原始文库的滴度为1.23×106cfu.mL-1,重组率达93.3%,全长率为59%。插入片段大小多在1.0～2.0kb,所占比例为70%,平均大小在1.1kb左右,采用涂平板均匀扩增得到的扩增文库滴度达到了3.84×109 cfu.mL-1,可用于长期保存。     

葱蝇夏滞育蛹的全长cDNA文库构建

葱绳具有夏滞育的特性且与果绳近缘.为构建葱蝇夏滞育蛹的全长cDNA文库,并为进一步的夏滞育专化基因筛选、克隆和表达分析莫定基础,利用RNAiso试剂盒提取葱绳夏滞育蛹的总RNA,采用SMART技术合成全长cDNA,限制性酶切消化后将cDNA克隆到质粒载体pDNR-LIB.经鉴定原始文库的滴度为2.4×107cfu/mL.随机挑取克隆,经PCR快速鉴定,插入片段大小在0.35～2.2kb之间,平均大小约为0.9kb,重组率达100%,获得了高质量的葱绳夏滞育场cDNA文库.     

春大豆花芽cDNA文库的构建及质量分析

【目的】为了解大豆多荚、多粒相关基因的调控机制,构建了大豆花芽cDNA文库,根据要求初步鉴定了所构建文库的质量.【方法】以大豆吉农18突变体的幼嫩花芽为材料提取总RNA,采用SMART技术合成双链cDNA.经蛋白酶K的消化及SfiⅠ酶切后,将所得cDNA克隆到λTriplEx质粒载体中,成功构建了大豆花芽全长cDNA文库.【结果和结论】将初始文库经扩增后保存,检测扩增文库滴度为2.13×108pfu/mL,重组率接近95.3%,菌落PCR鉴定插入片段主要分布在0.5~2.0 kb.插入片段平均大小在1.0 kb左右.表明本研究所构建的文库既满足了目的基因的分离筛选,又可保证全长cDNA文库的获得,该文库的构建为进一步开展相关基因的克隆及分子生物学研究奠定基础.     

石蒜叶片全长cDNA文库的构建

以石蒜叶片为材料,根据SMART[TM] cDNA文库构建试剂盒所示方法,提取叶片总RNA合成cDNA,连接到质粒载体pDNR-LIB上,采用电穿孔法将重组质粒转化到大肠杆菌DH5α中,构建了石蒜叶片全长cDNA文库.文库质量鉴定结果表明:文库滴度为1.15×106 PFU/ml,重组率99.17%,插入片段大小多为0.5～2.0 kb,1.0 kb以上的占60%.     

多花水仙花朵全长cDNA文库的构建

采用SMART技术,以多花水仙‘黄花水仙2号’盛开期花朵为材料,构建其全长cDNA文库,并对文库质量进行鉴定．结果表明,所构建初始文库的滴度为6.30×10^5 cfu·mL^-1,扩增后文库的滴度为1.58×10^8 cfu·mL^-1,重组率为84％,插入片段大小集中在500-2000bp之间,平均长度约970bp,符合eDNA文库的质量标准．可见,所构建的文库比较完整,能够反映黄花水仙花朵盛开期基因的表达情况．     

橡胶树胶乳均一化全长cDNA文库的构建与EST测序分析

 【目的】构建橡胶树胶乳均一化全长cDNA文库,降低胶乳中存在的高丰度表达基因的拷贝数,提高胶乳表达基因的分离鉴定和EST测序分析效率。【方法】以橡胶树无性系热研7-33-97的胶乳为材料,将胶乳全长cDNA与Gateway供体载体pDONR222重组,构建了橡胶树胶乳的非剪切型全长cDNA原始文库,经检测原始文库的滴度为6.0×106 cfu/mL,平均插入片段长度大于1.5 kb,重组率约为100%,全长cDNA比例约为76%;利用基因组DNA饱和杂交技术对胶乳原始cDNA文库进行均一化处理,构建橡胶树胶乳的均一化全长cDNA文库。【结果】胶乳均一化全长cDNA文库的总库容量(总CFU)为1.87×105,重组率大于95%。定量RT-PCR检测表明,橡胶树胶乳2个高丰度表达基因,即小橡胶粒子蛋白(SRPP)和橡胶延长因子(REF)基因,在均一化cDNA文库中的表达量均下降了约1 000倍。【结论】构建了均一化效果良好的橡胶树胶乳全长cDNA文库,并对文库中随机的12 000个克隆进行了测序,获得高质量的有效EST(expressed sequence tag)序列为11 951条,经拼接共获得单一基因(unigene)为3 394个,其中包括片段重叠群(contig)2 061个和单一EST序列(singlet)1 333个。此cDNA文库将可用于橡胶树功能基因组研究、新基因筛选、高通量EST测序以及橡胶树胶乳cDNA芯片的制备。     

彩叶草叶片cDNA文库的构建与分析

用植物(叶)总RNA抽提试剂盒提取彩叶草红色品种顶部叶片总RNA,用SMARTcDNALi-braryConstructionKit构建cDNA文库。经测定原始文库滴度为1.2×106pfu/ml,扩增总文库滴度为6.7×109pfu/ml,重组率达到98%,插入片段在0.5kb到2kb之间,1kb以上的占60%。通过PCR检测,从总文库中检测到了彩叶草CHS、DFR及ANS基因的特异片段。各项指标都表明,已获得较高质量的cDNA文库,为彩叶草叶色基因的分离克隆,彩叶草类黄酮类色素合成的分子调控的研究奠定了基础。     

赤子爱胜蚓全长cDNA文库的构建及初步鉴定

以赤子爱胜蚓(Eisenia foetida)为材料,λTriplex2TM为载体,利用SMART技术构建全长cDNA文库,从而筛选全长目的基因并研究其结构和功能。经测定原始文库滴度为1.3×106pfu/mL,扩增总文库滴度为1.0×108pfu/mL,重组率达到99%以上,插入片段长度在1.1 kb左右。该文库的建立为功能性新基因的发现奠定了坚实的基础。     

东北梅花鹿鹿茸尖端组织全长cDNA文库的构建

为克隆出与鹿茸生长发育相关基因的全长序列,采用SMART技术构建了东北梅花鹿鹿茸尖端组织的全长cDNA文库.用SV Total RNA Isolation System试剂盒提取总RNA,以逆转录酶PowerScriptTM 反转录合成第一链cDNA,然后通过LD-PCR合成并扩增ds cDNA.扩增产物经纯化、SfiⅠ酶切、过CHROMA SPIN-400柱去除小片段后,连接到SfiⅠ消化过的pDNR-LIB质粒载体中,最后用电转化法将重组质粒转化到E. coli DH5α内得到原始文库.经测定,构建的原始文库约含有2.56×10~6个重组子,插入片段多在0.5～2kb之间,平均插入片段长度约1.1kb,重组效率接近100%.结果表明,东北梅花鹿鹿茸尖端组织的全长cDNA文库已构建成功.     

天山雪莲叶片全长cDNA文库的构建

以天山雪莲(Saussurea involucrataKar.et Kir)幼嫩叶片为研究材料,利用CreatorTMSMARTTMcD-NA Library Construction技术构建了天山雪莲叶片全长cDNA文库,原始文库滴度达3.93×105cfu/mL,文库插入片段多在1 000 bp左右。随机挑取10个克隆进行测序,通过生物信息学初步分析表明,100%为全长cDNA,大部分可以在GenBank中找到同源序列。天山雪莲叶片全长cDNA文库的构建为雪莲基因资源保存和植物抗寒机理的研究奠定了基础。     

策略构建小黑杨茎形成层全长cDNA文库

为了研究小黑杨木材形成过程中的关键基因,以2年生小黑杨茎形成层组织为试验材料提取RNA,采用SMART (RNA 转录过程中的5′末端转换机制) 技术合成cDNA第一链,通过LD-PCR合成双链cDNA。利用SfiⅠ限制性酶酶切后将其连接到质粒载体pDNR-LIB上,采用电穿孔法将重组质粒转化到大肠杆菌感受态细胞DH5α中,构建全长cDNA文库。文库质量鉴定表明:原始文库滴度为2.18×106 pfu/mL,扩增后的文库滴度为5.46×109 pfu/mL,重组率为96%。插入片段长度在0.5～2.0 kb之间,平均长度为1.12 kb,表明构建的小黑杨茎形成层cDNA文库较为理想。      

水滴伪康纤虫全长cDNA文库的构建及EST分析

水滴伪康纤虫为海水养殖鱼类的重要危害性寄生虫。采用SMART技术构建营养期水滴伪康纤虫全长cDNA文库,初始文库滴度3.3×106pfu·mL~(-1),文库容量约为1.5×107 pfu,重组率97%。随机挑取24个克隆,经PCR检测插入的片段长度在0.3~2.0kb,平均长度500bp。挑选文库中的1 200个克隆进行表达序列标签测序,得到1 032条高质量的EST,与NCBI数据库进行比对后,获得292个同源基因,其中包含190条单拷贝EST和102个重叠群,冗余度为71.7%。有215条EST在Tetrahymena thermophila,Paramecium tetraurelia,Ichthyophthirius multifiliis,Cryptocaryon irritans,Oxytricha trifallax等自由生活及寄生种类的纤毛虫的基因组中比对到同源基因,其中有134条EST具有功能注释,其余为未知功能的假定蛋白基因。水滴伪康纤虫cDNA文库的构建及EST测序的完成,为进一步发现和研究水滴伪康纤虫的功能基因奠定了基础。