复方中草药对凡纳滨对虾热应激蛋白70基因表达的影响

为了研究复方中草药对凡纳滨对虾热应激蛋白70基因mRNA表达的影响，试验凡纳滨对虾随机分为2组，第1组喂食基础饵料辅以1％的复方中草药，第2组喂食基础饵料作为对照。采用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）对2组凡纳滨对虾的肝组织进行HSP70基因的mRNA表达检测，并以18SrRNA为内参照进行基因表达水平的半定量分析，结果显示第1组的凡纳滨对虾的肝组织HSP70基因的mRNA的表达显著高于第2组（P〈0．05），说明复方中草药可提高凡纳滨对虾HsP70基因mRNA的表达量。     

对虾白斑综合征病毒（WSSV）囊膜蛋白VP110部分重组表达及其与对虾鳃细胞膜蛋白结合分析

将VP110基因的部分序列克隆到pET-28a载体中构建pET28a-vp110b重组质粒并进行原核表达,获得重组表达的蛋白rVP110-B;用rVP110-B注射凡纳滨对虾Litopenaeus vannamei后,经WSSV感染,实验表明,该蛋白注射使凡纳滨对虾感染WSSV的半数死亡时间比对照组延长了20%。用表达纯化的该重组蛋白制备了兔抗rVP110-B多克隆抗体,该抗体用于凡纳滨对虾鳃细胞膜蛋白与rVP110-B的Far-western分析显示,凡纳滨对虾鳃细胞膜蛋白中除90 kDa左右的血蓝蛋白外,在41.7 kDa存在结合条带,经质谱分析表明这条鳃细胞膜蛋白是肌动蛋白。     

脊尾白虾热休克蛋白HSP90基因的原核表达与鉴定

将脊尾白虾热休克蛋白90基因克隆到原核表达载体pET-30a中,经酶切验证和DNA测序鉴定后,将重组质粒转化表达宿主大肠杆菌Rosetta,优化温度、时间、IPTG和OD600表达条件进行诱导表达,收集菌液,进行SDS-PAGE和质谱检测,并用Quantity one软件分析蛋白表达水平。结果表明,成功构建了含脊尾白虾HSP90基因的重组表达载体pET-30a-HSP90,表达目的蛋白相对分子量为82.7kD,为HSP90蛋白。通过条件优化认为重组菌株Rosetta/pET-30a-HSP90的最佳诱导温度为37℃,最佳IPTG浓度为1.0mmol/L,最佳诱导时机和诱导时间分别为0.58h、7h。     

凡纳滨对虾热休克蛋白90基因cDNA全长克隆及表达分析

为探究咪唑类物质KK-42提高凡纳滨对虾存活率的机理,克隆出HSP90全基因序列,采用real-time PCR法研究该基因的时空表达状况。将体长3.5～5.0cm的凡纳滨对虾幼虾随机分成2组,分别用1.95×10-4 mol/L的KK-42溶液和不含KK-42的溶液浸泡1min后,在相同条件下常规饲养。试验结果显示,凡纳滨对虾HSP90开放阅读框为2160bp,编码720个氨基酸,包含HSP90家族的保守序列。HSP90在凡纳滨对虾脑、肌肉、眼柄和肝胰腺中均有表达,其中肝胰腺中的表达水平较高。KK-42处理后,肝胰腺中HSP90mRNA水平升高69.1%以上(P0.05),其中第2d和3d,mRNA含量分别升高了505.5%和481.7%(P0.01)。结果表明,KK-42能诱导凡纳滨对虾肝胰腺HSP90的表达,这可能是KK-42提高凡纳滨对虾存活率的机制之一。     

近江牡蛎热休克蛋白 70 基因的原核表达研究

近江牡蛎(Crassostrea hongkongensis)热休克蛋白70(HSP70)家族成员是重要的抗逆和潜在污染预警分子。本研究将近江牡蛎HSP70基因cDNA连接到原核表达载体pQE30中,构建近江牡蛎HSP70的重组表达质粒pQE30/HSP70。该重组质粒经酶切和测序鉴定后,转入表达宿主大肠杆菌M15进行诱导表达,经SDS-PAGE电泳和Westernblot分析表明,确实获得了重组蛋白的表达。分别在25℃、30℃和37℃下,经0.2mmol/LIPTG诱导融合蛋白表达,其中,在25℃下,诱导的融合蛋白表达量最高,表明该温度为恰当诱导温度;在25℃下,分别诱导重组蛋白表达2h、4h、6h、8h、12h和16h,其中诱导12h的蛋白表达量最高;大部分融合蛋白以可溶形式存在于大肠杆菌M15中;表达的重组融合蛋白分子量约69kD,并能与鼠源抗6伊His的单克隆抗体特异性结合,表明通过原核表达获得了近江牡蛎HSP70蛋白。实验表明,在25℃下,经0.2mmol/LIPTG诱导表达12h,可获得大量可溶近江牡蛎HSP70蛋白。     

凡纳滨对虾原肌球蛋白基因表达模式与重组表达

根据相近物种的同类基因设计引物,从凡纳滨对虾Litopenaeus vannamei肌肉组织中克隆获得原肌球蛋白基因（TPMS）,长度为901bp,其中包含长度为852bp的完整开放阅读框,编码原肌球蛋白分子量为32．8kDa;RT—PCR结果显示,原肌球蛋白在心、肝胰腺、胃、鳃、肠和肌肉组织中均有表达,在肌肉中表达量最高,在鳃中表达量最低;将原肌球蛋白基因构建原核重组表达载体TPMS—pET30a,转化受体菌株BL21（DE3）并利用IPTG诱导后能够大量表达,蛋白分子量为38．2kDa;经优化,IPTG的最适诱导浓度为0．05mmol／L,最适诱导时间为4h;经过亲和纯化后,能够得到纯度90％以上的重组表达蛋白。     

凡纳滨对虾急性肝胰腺坏死病致病菌的分离鉴定、药敏特性及其组织病理学观察

为查明上海市奉贤区某对虾养殖场疑似患急性肝胰腺坏死病的凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei）的病原菌，本研究从患病凡纳滨对虾肝胰腺组织分离纯化到1株优势菌FHBX-1,并通过人工回归感染试验确定其致病性，利用VITEK-2全自动微生物鉴定仪和16S rRNA、热休克蛋白HSP60基因序列分析进行综合鉴定，并检测其毒力基因。同时采用K-B纸片扩散法检测病原菌的药物敏感性并通过石蜡切片观察患病凡纳滨对虾肝胰腺组织的病理特征。结果显示：菌株FHBX-1经生理生化特征测定、16S rRNA和热休克蛋白HSP60基因序列分析，综合鉴定为副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）,且携带了急性肝胰腺坏死病相关的毒力基因pirA^VP、pirB^VP,未携带副溶血弧菌临床主要毒力基因耐热直接溶血毒素tdh和相对耐热直接溶血毒素trh基因。人工回归感染试验结果显示，凡纳滨对虾在菌液浓度为1.0×10⁶ CFU/mL浸泡感染试验组，7 d内累计死亡率为80%,患病凡纳滨对虾具有肝胰腺颜色变白、萎缩变小，胃肠变...     

凡纳滨对虾泛素交联酶E2基因的克隆及表达分析

首先在凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)转录组测序的基础上, 应用RT-PCR方法获得了凡纳滨对虾泛素交联酶E2 (UE2)基因的开放阅读框序列。该序列长为447 bp, 编码148个氨基酸, 理论相对分子量为16.84 kD, 等电点为4.90。同源性比对和系统进化分析显示, 不同物种的UE2基因具有较高的同源性, 其中凡纳滨对虾与中国明对虾(Fenneropenaeus chinensis)的同源性最高并聚为一支。半定量RT-PCR分析表明, UE2基因在所检测的组织中均有表达; 实时定量PCR分析表明, UE2基因在肝胰腺和肠中的表达量最高, 在心脏、鳃、胃和肌肉组织中的表达量略低, 在血淋巴中的表达量最低。原核表达分析结果显示, PCR®T7/NT-Topo TA-UE2表达载体在1.0 mmol/L IPTG、37℃诱导3 h条件下可获得纯度较高的分子量约17 kD的蛋白。利用亲和层析的方法将蛋白进行纯化用以制备抗体。研究结果将为深入研究UE2基因在对虾白斑综合症病毒侵染过程中的作用机制奠定基础。     

中国对虾Rab7全长cDNA的克隆及原核表达

本研究采用RACE方法克隆了中国对虾Fenneropenaeus chinensis Rab 7基因(crab7)全长cDNA (GenBank∶JF742050).生物信息学分析显示,fcrab7的开放阅读框615bp,编码205个氨基酸,分子量23.2kD.FcRab7的氨基酸序列具有Rab蛋白家族的共同特征,与凡纳滨对虾和斑节对虾同源蛋白的同源性为100％.构建重组表达载体pBAD/ gⅢA-crab7转化到大肠杆菌E.coli进行诱导表达,诱导产物经SDS-PAGE检测和Western blot验证.本研究结果为进一步研究WSSV与FcRab7的相互作用提供了基础.     

凡纳滨对虾C-型凝集素基因原核表达与免疫作用的研究

本文利用原核表达系统对凡纳滨对虾C-型凝集素基因的开放阅读框进行了重组表达,并通过纯化分离获得重组目的蛋白,采用血细胞悬浮培养的方法,研究了重组C-型凝集素对凡纳滨对虾血细胞免疫作用的影响。实验梯度设置为：对照组和重组C-型凝集素蛋白（1.0 mg/mL）,分别在0、3、6、9、12、24h取培养的血细胞和培养液进行免疫相关指标的测定。结果表明：重组C-型凝集素经SDS-PAGE分析显示在39KD处有显著诱导条带,与预测的分子量大小基本一致,Western blot分析可以与anti-His抗体特异性结合,从而证明C-型凝集素重组蛋白在大肠杆菌中成功表达。重组C-型凝集素对大肠杆菌具有明显的凝集作用,对凡纳滨对虾血细胞数量、存活率和吞噬率影响显著（P<0.05）;培养基酚氧化酶活力在培养3-12h内呈峰值变化,于9h时达到最大值（P<0.05）。研究表明,C-型凝集素不仅具有凝集作用,而且还能激活酚氧化酶原系统,具有重要的免疫防御作用。     

温度突变对凡纳滨对虾己糖激酶和丙酮酸激酶活力以及热休克蛋白表达的影响

研究了水温从17℃突变为27℃对凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)稚虾己糖激酶(HK)和丙酮酸激酶(PK)活力及热休克蛋白(HsP70)表达的影响.主要结果如下:(1)温度突变后,凡纳滨对虾肝胰脏中己糖激酶活力逐渐增大,温度突变后3h达到最高,是温度突变前的2.54倍(P＜0.05).随后,对虾己糖激酶的活力逐渐下降,72h酶活力基本恢复到温度突变前的水平.(2)温度突变后1h,凡纳滨对虾丙酮酸激酶的活力降到最低,随后逐渐增大;6h达到最高,随后对虾丙酮酸激酶的活力逐渐下降并在72h恢复到温度突变前的水平.(3)温度突变0.5h后,凡纳滨对虾肌肉中HSP70的表达量迅速升高,1h达到最高,与温度突变前差异显著(P＜0.05),随后下降到比温度突变前稍高的水平并趋于稳定.实验结果表明,温度突然升高后,己糖激酶活力升高,随后恢复到起始水平;糖酵解过程先受到抑制,之后得以恢复;温度突变可导致凡纳滨对虾对环境的抗逆性提高.     

热应激对剑尾鱼HSP70家族两成员基因表达的影响

采用RT-PCR方法扩增实验动物剑尾鱼（Xiphopohorus helleri）纯系RR-B的HSP70家族两个成员的eDNA片段，并将其克隆到PMD18-T载体中测序，将测序结果与GenBank中的核苷酸序列和推导的氨基酸序列进行同源性比较。同时利用RT-PCR半定量方法研究热应激时两个成员在剑尾鱼组织中的表达。通过克隆获得了剑尾鱼的HSP70家族两个新成员的cDNA片段，两序列均包含HSP70家族的特征性签名序列和热休克蛋白的定位序列；通过对克隆片段与已发表的青锵（Oryzias latipes）等鱼类HSP70的核苷酸序列和其编码的氨基酸序列同源性比较，发现核苷酸序列同源性较高，成员一和成员二分别为85％-89％和82％-99％；氨基酸序列同源性更高，成员一和成员二分别为97％-99％和93％-99％。一般条件下，两成员在剑尾鱼肝脏、脾脏、肾脏和心脏中不表达，但热应激能刺激成员一在剑尾鱼脾脏中表达，成员二在肝脏、脾脏、肾脏和心脏中强烈表达，并可能在参与热应激保护方面起更大作用。     

团头鲂 HSP70 cDNA 的克隆、序列分析以及热应激对其 mRNA 表达的影响

采用RT-PCR和cDNA末端快速扩增法(RACE)分离、克隆出团头鲂(Megalobrama amblycephala)肝脏热休克蛋白70(HSP70)基因全长cDNA序列,共2 224 bp,包括135 bp5'非翻译区、1 932 bp阅读框以及157 bp 3'非翻泽区[不包括Poly(A)].阅读框共编码643个氨基酸,分子量计算值为70.53 kD,理论等电点为5.25.该HSP70基因在翻译区不含内含子,符合诱导型HSP70的特征.团头鲂HSP70氨基酸序列中含有HSP70家族的3个签名序列以及细胞质特异性调控基序EEVD等.同源性分析表明,团头鲂HSP70氨基酸序列与斑马鱼等脊椎动物的相似性高达84.0%以上,与无脊椎动物果蝇的相似性也高达73.4%.生物信息学分析显示,团头鲂HSPTO基因所编码的蛋白质以亲水性区域为主,具有丰富的B细胞抗原位点,无信号肽,无跨膜区域,为非分泌型蛋白;同时还含有众多的蛋白激酶C磷酸化位点、N-肉豆蔻酰化位点、酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点和N-糖基化位点,推测其可能在细胞信号转导与调控中发挥重要作用.该蛋白含有2个部分重叠的双向核定位序列,二级结构以α-螺旋和无规卷曲为主,空间结构包括N端ATPase功能域和C端多肽结合功能域.应用实时定量PCR研究高温(34℃)应激对团头鲂HSP70 mRNA表达的影响.结果表明,在热应激过程巾肝脏HSP70 mRNA水平呈先升高后下降的变化趋势,说明该基因的表达受热应激调控,本实验克隆的序列为诱导型HSP70 cDNA.     

脊尾白虾热休克蛋白HSP70基因的克隆及其表达分析

克隆了脊尾白虾热休克蛋白基因全长cDNA,并进行了序列分析。该基因由2 250 bp的碱基组成,开放阅读框长1 959 bp,编码由652个氨基酸组成的蛋白,基因两翼分别存在83 bp(5′端)和208 bp(3′端)的非翻译区,将该基因命名为Ec-HSP70。与其它物种HSP70s氨基酸序列进行同源性比较发现,与甲壳动物的同源性都在90%以上,表明该蛋白属于热休克蛋白HSP70家族。聚类分析表明,脊尾白虾热休克蛋白氨基酸序列与中国明对虾和凡纳滨对虾紧密聚为一支,之后聚类顺序依次为斑节对虾、日本囊对虾、刀额新对虾等。通过荧光定量RT-PCR对该基因在肝胰腺、肌肉的表达分析表明,温度、pH和氨氮胁迫都可以引起该基因的高表达,而且肝胰腺中的高表达时间相对肌肉中出现的较早。试验结果表明,温度、pH和氨氮胁迫对脊尾白虾HSP70基因表达有一定的诱导效果,但胁迫的时间过长则抑制其表达,肝胰腺对胁迫比肌肉较敏感。     

Induced thermotolerance and expression of heat shock protein 70 in sea cucumber <Emphasis Type="Italic">Apostichopus japonicus</Emphasis>

ABSTRACT:   Thermal limits, induced thermotolerance and the expression of heat shock protein 70 (Hsp70) in an echinoderm Apostichopus japonicus were studied. The sublethal and lethal temperatures for the juveniles were 30 and 34°C, respectively; a previous sublethal heat shock exposure (30°C, 2 h) could increase the survival rates of the sea cucumbers when they were exposed to 34°C. This induced thermotolerance could last for at least 2 days. Levels of Hsp70 increased substantially after sublethal heat shock exposure and linearly decreased with time. This result indicated that a close relationship existed between the induction of thermotolerance and the levels of Hsp70 in A. japonicus.     

Analysis of Stress-Induced Gene Expression in Trout Red Blood cells following Tributyltinchloride Exposure

Submicromolar concentrations of tributyltinchloride (TBTC), an organotin compound, is able to impair mitochondrial activity in trout erythrocytes, as detected by ultrastructural transmission electron microscopy investigations and exhibits pro apoptotic activity in a variety of cells including nucleated red blood cells. Here we show that TBTC is able to induce the expression of hsp70 in rainbow trout (Onchorynchus mykiss) erythrocytes in a time- and dose-dependent manner. This induction was demonstrated by quantification of the relative abundance of mRNA, and the synthesis of hsp70 was detected by means of an immunological test. This study could provide a practical assay of environmental stress at sublethal toxicant concentrations.     

菲在厚壳贻贝体内的富集与释放及其对HSP70 mRNA表达的影响

以厚壳贻贝(Mytilus coruscus)为研究对象,开展不同暴露浓度(4、20和100 µg/L)菲(phenanthrene, PHE)的富集(10 d)和释放(5 d)实验,分别利用高效液相色谱法和荧光定量qPCR法分析了厚壳贻贝内脏团、外套膜、闭壳肌对PHE的富集和释放实验及HSP70 mRNA表达量的变化。结果显示,在10 d的富集阶段,厚壳贻贝3个组织对PHE的富集能力大小表现为内脏团>外套膜>闭壳肌;3个组织对PHE的富集含量随时间的增加而增加,同时,也随暴露浓度的增加而增加;在释放实验阶段,厚壳贻贝3个组织中PHE含量在释放前期迅速下降,但在15 d时,3个组织中PHE残留量仍均高于对照组;PHE对厚壳贻贝体内HSP70 mRNA诱导表达具有组织特异性,其中外套膜中HSP70 mRNA表达量最高。研究结果可为PHE在贝类体内的富集动力学及致毒机制研究提供参考依据。     

Gln对中华鳖免疫应激后肝脏.脾脏及肠道HSP70表达的影响

本试验通过研究谷氨酰胺/脂多糖（Gln/LPS）对中华鳖肝脏、脾脏和肠道组织热应激蛋白HSP70表达的影响,考察Gln对中华鳖免疫应激的保护作用与其诱导组织HSP70表达的关系。试验选择体重接近的健康中华鳖24只,随机分为4组,分别腹腔注射0.7%Nacl、500 ugLPS/kgBW、100 mgGln/kgBW和500 ugLPS+100 mgGln/kgBW。采用免疫组化法检测中华鳖肝脏、肠道和脾脏中HSP70的表达,放射免疫法测定血浆皮质醇（COR）含量。结果表明：腹腔注射500 μgLPS/kgBW显著增强了中华鳖肝脏和脾脏组织HSP70的表达（P<0.05）,而补充100 mgGln/kg BW抑制了中华鳖肠道、肝脏和脾脏组织HSP70的表达。推测Gln对免疫应激中华鳖的保护作用与其诱导机体组织HSP70的表达无关。     

The 70-kDa Heat-shock Protein as a Potential Biomarker of Quality of the Parapenaeus longirostris Shrimp Flesh

The deep-water rose shrimp, Parapenaeus longirostris, is a target species of the Mediterranean fisheries mostly caught by trawlers offshore, processed, and frozen on board. The effects of thawing on shrimp muscle exudate collected at 0, 1, 2, 3 days after thawing were investigated. In total, 70-kDa heat-shock protein (Hsp70), alpha (α)-enolase, and manganese superoxide dismutase (Mn-SOD) were selected as metabolic and stress-related proteins and analyzed by immunoblotting on exudates. Data were compared for the amount of exudates collected and the pH values. Among the investigated proteins, only the Hsp70 levels showed a decrease related to the post-thawing period and correlated with both the significant increase of the exudate amount and the pH values. These data strongly suggest the potential use of Hsp70 as an early predictive biomarker for quality of the P. longirostris shrimp after thawing.     

Heat shock protein 70 expression in different tissues of Cirrhinus mrigala (Ham.) following heat stress

Members of heat shock protein 70 (HSP70) are highly conserved proteins of about 70 kDa and play important roles in protein folding. Levels of these proteins increase when cells are under stress. Environmental temperature influences both the basal and induced levels of HSPs. However, studies on HSPs in fishes from a tropical country such as India are lacking. In the present study, Indian major carp (IMC) Cirrhinus mrigala (Ham.) acclimatized at 25±2°C had high levels of HSP70, viz., 1.2–1.3 ng μg^?1 total protein in kidney and gill and 4.2–5.3 ng μg^?1 total protein in liver and brain tissues, indicating the presence of biochemically significant levels of stress. However, maintenance of acclimatized fish at 17°C for up to 48 h did not lead to a significant decrease in stress protein levels. A heat shock at 37°C for up to 48 h resulted in only two to threefold increase in HSP70 levels in these organs. Although the increase in HSP70 levels was apparent from the first hour of heat stress in all these tissues, the increase was significant from the second hour in the brain, the sixth hour in liver and kidney and the 20th hour in the gills.