阪崎克罗诺杆菌中转座子拷贝数实时定量PCR检测方法的建立

[目的]建立检测阪崎克罗诺杆菌中转座子拷贝数的实时定量PCR方法。[方法]以单拷贝持家基因atpD作为内参基因,建立同时含有单拷贝持家基因atpD和EZ-TN5转座子的重组质粒;建立atpD基因与EZ-TN5转座子实时定量检测的标准曲线,并利用所建立的标准曲线,对3株阪崎肠杆菌突变株中atpD基因和EZ-TN5转座子的拷贝数进行检测,并计算其比值。[结果]atpD基因与EZ-TN5转座子实时定量检测标准曲线的相关系数分别为0.999和0.998;3株突变株中atpD基因和EZ-TN5转座子拷贝数比值分别为0.98、1.17与0.91,证明突变株中转座子为单拷贝。[结论]该研究所建立的实时定量PCR方法实用性强,可替代Southern杂交用于不同细菌中EZ-TN5转座子拷贝数的检测。     

凡纳滨对虾原肌球蛋白基因表达模式与重组表达

根据相近物种的同类基因设计引物，从凡纳滨对虾Litopenaeus vannamei肌肉组织中克隆获得原肌球蛋白基因（TPMS），长度为901bp，其中包含长度为852bp的完整开放阅读框，编码原肌球蛋白分子量为32．8kDa；RT—PCR结果显示，原肌球蛋白在心、肝胰腺、胃、鳃、肠和肌肉组织中均有表达，在肌肉中表达量最高，在鳃中表达量最低；将原肌球蛋白基因构建原核重组表达载体TPMS—pET30a，转化受体菌株BL21（DE3）并利用IPTG诱导后能够大量表达，蛋白分子量为38．2kDa；经优化，IPTG的最适诱导浓度为0．05mmol／L，最适诱导时间为4h；经过亲和纯化后，能够得到纯度90％以上的重组表达蛋白。     

金黄色葡萄球菌表面蛋白SdrD的原核表达及抗体制备

根据金黄色葡萄球菌表面蛋白SdrD基因序列设计特异性引物,以金黄色葡萄球菌标准菌株基因组为模板进行PCR扩增,获得了大小为2 043bp的基因片段。将基因片段连接至表达载体pET26b,转入大肠埃希菌BL21(DE3)中用IPTG诱导表达。SDS-PAGE结果表明,SdrD基因获得了较好的表达,重组蛋白的分子质量约为99ku。利用免疫亲和层析对目标蛋白进行纯化,获得了纯度较高的目标蛋白。用该蛋白免疫新西兰白兔制备了多克隆抗体,抗体效价达到1∶23 000,为金黄色葡萄球菌基因工程疫苗的开发与性能评价,以及该致病菌免疫检测技术的开发奠定了基础。     

全日制专业学位研究生创新实践基地建设的研究与思考

针对专业学位研究生实践训练不足的突出问题,从实践训练内容选择、实训体系建设和实践基地导师队伍建设3个方面开展创新实践基地建设,形成较为完善的实践基地运行保障体系,为显著提高专业学位研究生实践能力的培养水平、向社会和企业输送高水平实践型创新人才提供了良好的平台。     

棉铃虫组织蛋白酶B酶原在大肠杆菌中的表达及纯化

用合成的基因特异性引物通过RT-PCR扩增，获得棉铃虫(Helicoverpa armigera)组织蛋白酶B基因(HCB)，将基因克隆到pGEX-4T-1载体，在大肠杆菌(Escherichia coli)DH5α内进行扩增，经过PCR筛选获得阳性克隆并提取质粒和测序验证后，再转化大肠杆菌BL21进行诱导表达。表达产物为组织蛋白酶B-谷胱甘肽S转移酶的融合蛋白，分子量在63kD左右。表达产物形成了包涵体，经过对包涵体变性和复性处理，得到了可溶性的融合蛋白，可被Glutathione Sepharose 4B柱亲和纯化，用凝血酶裂解融合蛋白后，经SDS-PAGE分离到37kD左右的棉铃虫组织蛋白酶B酶原。N-末端氨基酸测序鉴定表达产物为棉铃虫组织蛋白酶B。     

富含中链甘油三酯油脂的热稳定性研究

以富含中链甘油三酯油脂和调和油为原料,对加热过程中的稳定性进行评价。在烹调高温(180℃)条件下,连续加热1h、3h检测酸值、过氧化值、羰基值的变化。结果表明:在高温加热过程中,食用油脂的酸值,过氧化物值、羰基值随着加热时间的延长而升高,中链甘油三酯的酸值低于调和油,过氧化值、羰基值均高于调和油。中链甘油三酯热氧化稳定性与调和油相比容易发生氧化、劣败。     

无乳链球菌表面蛋白Rib基因克隆与重组表达

无乳链球菌是引起奶牛乳房炎的常见病原微生物之一,其表面蛋白作为一种高免疫原性的生物大分子,具有较高的种内特异性,是理想的候选疫苗与免疫检测靶标。本研究通过对无乳链球菌高免疫原性表面蛋白Rib的重组表达与抗体制备,为后期无乳链球菌的疫苗研制与检测奠定了良好的基础。首先提取了无乳链球菌基因组DNA,从中成功扩增出长度为452bp的编码表面蛋白Rib N端的基因片段。将这一片段连入重组表达载体pET-26b,转化受体菌株BL21(DE3)后利用IPTG进行诱导,结果表达了分子质量约为18ku的外源蛋白。在低温表达条件下,对IPTG诱导浓度进行优化,结果表明,IPTG的最适诱导浓度为0.05mmol/L。将诱导后的菌体进行超声波破碎并进行SDS-PAGE检测,结果显示重组蛋白以包涵体形式存在,对其进行变性、复性处理,利用亲和凝胶纯化后获得了纯度较高的重组蛋白。将重组蛋白免疫新西兰兔制备多克隆抗体,经检测抗体效价达到1∶480 000。