猪传染性胃肠炎病毒核衣壳蛋白的表达及在ELISA中的初步应用

重组质粒PET-N转化大肠杆菌（Escherichia coli） BL21菌株,在1.0 mmol/L IPTG和37℃条件下诱导,外源基因获得高效表达。Western blot检测证明,表达产物具有良好的反应原性。以纯化的蛋白为抗原建立了检测猪传染性胃肠炎抗体的间接ELISA方法,确定抗原最佳包被浓度为15 μg/mL,抗体稀释度1∶40,最适封闭液为5% FBS,血清反应时间为90 min,酶标二抗HRP SPA的工作浓度为1∶5 000,反应时间为60 min,底物在室温显色时间为10 min,待检血清阳性标准定为光密度OD450≥0.35。与 Svanova TGEV/PRCV 抗体诊断试剂盒比较,此方法的特异性、敏感性和符合率分别为93.8%、93.5%和93.5%。     

检测多杀性巴氏杆菌毒素抗体的单抗竞争ELISA方法的建立

本研究以纯化的多杀性巴氏杆菌毒素基因片段的原核表达产物作为抗原免疫小鼠制备单抗,并利用表达蛋白和多杀性巴氏杆菌毒素单抗酶结合物建立了竞争ELISA方法检测多杀性巴氏杆菌毒素抗体。经过研究确定抗原包被浓度为223ng／mL,待检血清最佳稀释度为1：2,酶标单抗工作浓度为1：3200,血清抑制率大于50%为阳性。应用单抗竞争ELISA和细胞毒性中和试验同时对82份血清进行猪多杀性巴氏杆菌毒素抗体检测,竞争ELISA的检出率为40.2％,细胞毒性中和试验检出率为36.6％,两者符合率达91.5％。试验结果表明,该ELISA方法特异性强,敏感性高,稳定性和重复性好,操作简便。本方法的建立在实验室诊断的标准化、猪群萎缩性鼻炎疫苗免疫效果的评价及流行病学调查方面具有应用价值。     

猪水肿毒素A亚基基因表达产物的生物学特性及抗体检测ELISA方法的建立

根据TMpred生物学软件对SLT-ⅡeA亚基的蛋白质结构分析结果,表达了猪水肿毒素(SLT-Ⅱe)A亚基。SDS-PAGE和Western blot分析表明,表达产物以可溶形式存在,易于纯化且具有良好免疫学活性。生物学毒性试验表明,表达产物不能致死小白鼠,也不具有Vero细胞毒性。体外细胞毒性中和试验表明,表达产物的兔抗血清能中和天然SLT-Ⅱe(中和度90.4℅)。在小鼠免疫保护力试验中,表达产物作为免疫原不能提供任何保护力。以表达产物为抗原建立检测SLT-Ⅱe抗体的间接ELISA方法,结果该方法对猪萎缩性鼻炎等9种常见细菌性疾病阳性血清的检测均为阴性,能特异性检测到人工感染猪水肿毒素8d仔猪的血清抗体IgG,对临床送检的1083份猪血清的检测阳性率为20.9℅。     

赤羽病病毒囊膜糖蛋白G1基因的截短表达、纯化及间接ELISA诊断方法的建立

为获得赤羽病病毒（Akabane Virus, AKAV）囊膜糖蛋白重组抗原作诊断应用研究,通过软件分析AKAV OBE-1株的囊膜糖蛋白G1的氨基酸序列,筛选出抗原性较好的基因片段G1-2作为目的片段,经RT-PCR扩增后,插入pMD18-T载体。经测序鉴定正确后,将该片段定向亚克隆于pET-28a (+)表达载体中,转化至BL21 (DE3)感受态细胞中进行诱导表达。经SDS-PAGE和Western-blot分析,诱导表达产物以包涵体的形式存在,大小约为40ku,且具有免疫学活性。亲和纯化后的融合蛋白浓度为2mg/ml,纯度为92.6%。以该融合蛋白作为诊断抗原,建立了间接ELISA诊断方法。确定的抗原包被浓度为20g/ml,血清最佳稀释度为1:200。交叉试验表明该方法对牛常见的6种疾病阳性血清无交叉反应。应用该方法对病毒微量中和试验检测过的云南（77份）和内蒙（70份）牛血清样品进行了检测。以中和试验为参照,通过统计学处理,得出两地临界值分别为0.493和0.488,本方法的特异性为73%和86.9%,二者的符和率分别为80%和85.9%。     

基于M蛋白检测犬瘟热抗体ELISA方法的建立

犬瘟热病毒(Canine disremper virus,CDV)是导致犬科等多种属动物发热、腹泻、幼仔死亡等症状的传染病病原体,建立针对CDV的快速灵敏的诊断方法对于该病的防治具有重要意义。本研究利用RT-PCR方法扩增得到CDV-M基因,构建原核重组表达载体p ET-28(a)-CDV-M,并在大肠杆菌(Escherichia coli)中实现了该蛋白的表达和纯化,Western blot验证重组蛋白的抗原性,用纯化的重组蛋白his-CDV-M作为抗原包被酶标板,ELISA方阵实验确定该重组蛋白的包被浓度,建立了检测临床犬血清样品的CDV-M蛋白抗体的间接ELISA方法,比较本实验方法与其他试剂盒之间的特异性和灵敏性。结果表明重组蛋白his-CDVM得到较好表达,纯化后蛋白浓度为2.840 mg/m L。Western blot结果表明重组抗原能与犬瘟热阳性血清进行反应。方阵实验确定抗原最佳工作浓度为8.88μg/m L,抗体最佳稀释度为1∶160,应用本方法检测223份犬血清样品,与进口CDV诊断试剂盒检测结果符合率为96%。本研究建立的基于M蛋白的犬瘟热病毒抗体检测方法具有较高的特异性和灵敏性,为犬瘟热病毒的诊断及M蛋白的功能研究提供了工具。     

鸡传染性支气管炎病毒S1基因在大肠杆菌中的表达及其抗原性的初步鉴定

利用基因重组技术将鸡传染性支气管炎病毒（IBV）S1基因分段（A和B段）克隆到pGEX—6p-1载体中，用IPTG诱导表达。SDS-PAGE电泳结果显示有明显的融合蛋白表达条带。通过IBV特异性抗体的Western blot检测，两段表达产物均能与抗体发生特异性反应，证明表达产物具有部分抗原性。用Glutathione Sepharose 4B纯化出A段和B段的GST融合蛋白。将纯化得到的融合蛋白免疫家兔。连续免疫3次，将得到的抗体与200 TOCID50（气管环半数感染）/0．1mL病毒工作液在37℃温育1h进行TOC试验。经计算A段抗体的50%血清中和终点为1：18，而B段抗体的50％血清中和终点为1：53，表明这两段的表达产物具有较好的免疫原性，B段表达产物更具有良好的抗原性，适合作为免疫抗原和诊断抗原，具有一定的临床应用价值。     

猪圆环病毒2型ORF2基因片段的原核表达及间接ELISA诊断方法的初步建立

根据猪圆环病毒2型（PCV2）LC株序列,设计合成3对引物,通过PCR扩增PCV2的3个不同ORF2基因片段,分别将其克隆到pET-32a载体中,将重组表达质粒转化大肠杆菌BL21,表达并纯化了重组蛋白。Western-blot分析表明,重组蛋白可以与PCV2阳性血清反应,表明该蛋白具有良好的抗原性。以纯化的重组蛋白初步建立了间接酶联免疫吸附实验（ELISA）方法,经方阵滴定确定最佳包被浓度为0．24μg／mL,血清最佳的稀释度为1：40。     

口蹄疫病毒非结构蛋白3AB基因的可溶性表达与生物活性分析

通过设计特异性引物扩增得到完整的口蹄疫病毒（FMDV）非结构蛋白（NSP）3AB基因,定向克隆到表达载体pET-30a中,获得了重组质粒pET-3AB,并转化大肠埃希氏菌BL21(DE3),重组菌分别在37℃和28℃条件下诱导表达,表达产物经SDS-PAGE电泳鉴定,观察到37℃培养条件下目的蛋白形成包涵体,在28℃条件下培养目的蛋白以可溶性的形式表达。Western blotting分析表明,表达的目的蛋白能与FMDV感染牛血清发生特异性反应。以纯化的3AB蛋白作为抗原,采用间接ELISA模式检测了部分FMDV感染动物血清和健康动物血清,证明表达蛋白与FMDV感染血清有很好的反应而与健康动物血清无反应。该项研究为建立以3AB为抗原的FMDV NSP抗体检测ELISA方法奠定了基础。     

吉富罗非鱼AFLP反应体系的建立与优化

本文以我国水产养殖主导品种吉富罗非鱼(farmed tilapia)为研究材料,进行扩增片段长度多态性(AFLP)反应体系的研究,初步建立了一套适合罗非鱼的AFLP反应体系。对体系中关键环节的优化结果如下:基因组DNA要求无降解和RNA污染,OD260/OD280比值在1.8~2.0之间;基因组DNA EcoRⅠ/MseⅠ37℃双酶切6h、20℃连接20h,连接产物10倍稀释,PCR预扩增产物稀释45倍作为选择性扩增的模板,选择性扩增产物经6%变性丙烯酰胺凝胶电泳检测可获得条带清晰、背景干扰小的图像。该体系的构建为今后进行罗非鱼群体遗传多样性分析、种质鉴定、重要经济性状分子标记的开发及遗传连锁图谱构建等方面研究提供了参考。     

ABC-ELISA法检测犊弓首蛔虫IgG抗体实验研究

首次以动物为模型,应用 ABC-ELISA 法对家兔血清中犊弓首蛔虫 IgG 抗体进行了测试研究。实验中对犊弓首蛔虫的成虫体壁抗原、体腔液抗原、生殖器官抗原、虫卵抗原、幼虫抗原进行了比较研究,结果显示:幼虫抗原对血清检测的 P/N 值及对被检血清的检出率最高,而检测对照组血清未出现假阳性反应.由此表明,幼虫抗原是最敏感和特异的抗原.在检测方法上,ABC-ELISA 法对被检血清的检出率为96.62%。常规 ELISA 法和 IHA 法的检出率分别为90%和56.67%。3种方法检测对照组血清未出现假阳性反应;在抗体检测滴度上,ABC-ELISA 法比常规 ELISA 法高1～4倍,比 IHA 法高4～128倍.经统计处理,ABC-ELISA 法比常规 ELISA 法敏感1.21倍,比 IHA 法敏感33.76倍.在特异性实验中,用 ABC-ELISA 法检测家兔血清中犊弓首蛔虫 IgG 抗体,与实验家兔乳突类圆线虫和肝片吸虫阳性血清均未出现交叉反应,表明该法检测犊弓首蛔虫抗体特异性良好.另外,对4份血清多次重复检测结果,批内重复和批间试验 OD 值变异系数不超过10%,表明该法稳定性良好.实验结果表明,ABC-ELISA 法具有敏感性高,特异性强,并有较好的稳定性,可用于犊弓首蛔虫抗体的检测,故该法的建立无疑具有理论和实践意义.     

青海省耕地资源开发利用分析及对策研究

分析论述了青海省耕地资源开发利用的现状、特点和问题。在此基础上,提出了对青海省耕地资源进行研究的框架体系和思路,同时基于GIS/RS技术设计了相关的技术路线。最后依据所做设计对青海省耕地资源开发利用做了初步分析,并进行了相关的对策研究分析。     

氟对小鼠生精细胞凋亡的影响及锌的保护作用

为观察氟对成年雄性小鼠生精细胞凋亡的影响及锌的保护作用,通过腹腔注射氟化钠建立氟中毒动物模型及锌保护实验。采用石蜡切片、苏木精-伊红染色(HE染色)、末端原位标记(TUNEL)及琼脂糖凝胶电泳的方法检测小鼠生精细胞的凋亡情况。结果显示:(1)氟感染组无论是低剂量组(NaF10 mg/kg)或是高剂量组(NaF 20 mg/kg)生精细胞都发生了明显的凋亡。生精细胞凋亡主要发生在精母细胞和精原细胞,凋亡指数与对照组差异极显著(P<0.05)。(2)无论是高剂量锌(ZnSO430 mg/kg)和低剂量锌(ZnSO415 mg/kg)都可以使凋亡指数明显降低,高剂量锌组的凋亡指数与对照组差异不显著(P>0.05)。     

烘焙对生物质热解产物特性的影响

烘焙可有效地降低生物质中的水分和氧,对其热解过程有显著的影响。该文主要研究了烘焙温度（200,230,260,290℃）对生物质热解过程及产物特性的影响行为及影响机制;研究发现烘焙能改善热解产物的品质,随着烘焙温度的升高,热解合成气中CO含量由48%逐渐减少到34%,CH4和H2增加,其中H2含量最大增加了77.4%,而液体产物中,乙酸和水分含量逐渐减小,水分含量最大减少了42.8%,而酚类产物的含量明显增加,有利于生物油品质的提高。该研究为烘焙技术的发展和生物质高效热化学转化提供科学参考。     

Towards bioremediation of toxic unresolved complex mixtures of hydrocarbons: identification of bacteria capable of rapid degradation of alkyltetralins

Background, aim and scope  Unresolved complex mixtures (UCMs) of aromatic hydrocarbons are widespread, but often overlooked, environmental contaminants. Since UCMs are generally rather resistant to bacterial degradation, bioremediation of UCM-contaminated sites by bacteria is a challenging goal. Branched chain alkyltetralins are amongst the individual classes of components of aromatic UCMs which have been identified in hydrocarbon-contaminated sediments and a number of synthetic alkyltetralins have proved toxic in laboratory studies. Thus, alkyltetralins should perhaps be amongst the targets for UCM bioremediation strategies. The slow degradation of several alkyltetralins by a microbial consortium has been reported previously; however, the bacteria involved remain unidentified and no single strain capable of alkyltetralin biodegradation has been isolated. The present project therefore aimed to enrich and identify bacterial consortia and single strains of bacteria from a naturally hydrocarbon-contaminated site (Whitley Bay, UK), which were capable of the degradation of two synthetic alkyltetralins (6-cyclohexyltetralin (CHT) and 1-(3’-methylbutyl)-7-cyclohexyltetralin (MBCHT)). Materials and methods  Bacteria were enriched from sediment collected from Whitley Bay, UK by culturing with CHT and MBCHT for a period of 4 months. Biodegradation experiments were then established and degradation of model compounds monitored by gas chromatography–mass spectrometry. Internal standards allowed the generation of quantitative data. 16S rRNA gene clone libraries were constructed from individual enrichments to allow assessment of microbial community structure. Selective media containing MBCHT were used to isolate single bacterial strains. These strains were then tested in liquid culture for their ability to degrade MBCHT. Results  The consortia obtained through enrichment culture were able to degrade 87% of CHT and 76% of MBCHT after only 46 days compared with abiotic controls. The 16S ribosomal RNA gene clone libraries of these bacteria were dominated by sequences of Rhodococcus spp. Using selective media, a strain of Rhodococcus was then isolated that was also able to biodegrade 63% of MBCHT in only 21 days. Discussion  The present report describes the isolation of a single bacterial strain able to degrade the resistant MBCHT. Although significant losses of MBCHT were observed, putative metabolites were not detectable. Rhodococcus sp. have been reported previously to be able to biodegrade a range of hydrocarbon compounds. Recommendations and perspectives  Due to their environmental persistence and toxicity, aromatic UCMs require bioremediation. The culturing and identification of such bacteria capable of rapid degradation of alkyltetralins may be an important step toward the development of bioremediation strategies for sites contaminated with toxic UCMs.     

食用仙人掌萎蔫气象条件分析

塑料大棚内种植的食用仙人掌在土壤墒情较好时也有萎蔫现象发生，通过试验观测和对仙人掌生理习性的分析，发现阴雨过后天气突然放晴温度急剧上升易使仙人掌发生萎蔫现象，并提出了田间管理的应对措施。     

三门峡水库库岸坍塌成因分析与防治措施研究

三门峡水库自1960年9月蓄水运行以来,库岸坍塌现象频繁发生,平均每年塌岸0.5～0.7亿m3.指出了造成库岸坍塌的原因主要是地质环境的影响以及水力条件的变化;不同的地形、地貌、地质结构和岩性特征,表现了不同的塌岸强度,其中黄土塬区为极强塌岸段,黄河Ⅱ级阶地为强烈塌岸段,黄河Ⅰ级阶地为中等强烈塌岸段;分析了引起库岸坍塌的主要水力条件有大气降水、地表水和地下水,并且不同水力条件及其变化特征,对库岸坍塌影响的方式和程度也不同;最后给出了防治库岸坍塌应采用标本兼治的原则,治标是指对塌岸进行必要的加固、支挡、衬砌等;治本就是根据引起塌岸的原因以及不同地质环境条件下的塌岸特征和水力条件,因地制宜,因害设防,从根本上进行综合治理.     

荔枝种子结构的扫描电镜观察

荔枝种子从果实中剥离出来后, 即使在室内条件下, 也极易失水干缩, 潮湿环境中又易发霉而腐烂。扫描电镜观察表明: 种皮上布满纹孔, 水分散失面积很大; 种脐部为疏松的海绵组织, 且营养丰富。据此, 生产上应对种子彻底清洗, 并保存于适当湿度的环境中, 以提高其发芽率。     

稀释介质种类对豆乳蛋白胶体粒子zeta电位测定效果的影响

蛋白粒子zeta电位是衡量豆乳体系稳定性的一个重要指标,而在电位分析前常采用稀释介质对豆乳进行预处理。为了确保zeta电位测定的准确性和科学性,必须选择合适的稀释介质。因此,该研究采用去离子水、豆乳超滤液两种稀释介质分别对豆乳进行稀释,并比较了这2种稀释介质对zeta电位、粒径分布、pH值以及电导率的影响。结果表明,若以去离子水为稀释介质,zeta电位的绝对值会随着稀释倍数的升高而显著增加（*P<0.05）,这主要是由于豆乳蛋白胶体粒子发生解聚导致粒径减小,而pH值的升高和电导率的降低则说明豆乳的离子强度显著降低。相比之下,选用豆乳超滤液稀释豆乳时,体系的 zeta 电位、粒径分布、pH值以及电导率都未随稀释倍数的增加而改变（*P>0.05）,说明此法能够较好地维持豆乳蛋白粒子的荷电稳定性。由此可知,豆乳超滤液可做为豆乳zeta电位测定的理想稀释介质。     

物联网安全及解决措施

物联网是一个集信息通信、数据交换、传感器技术与软件工程于一体的综合性产业,探讨和分析了物联网的结构体系与发展中遇到的安全问题。     

大豆连作障碍的研究进展

从生物学、微生物学和植物营养生理学的角度及诸多障碍因子等方面,综合评述和分析了国内外大豆连作研究的现状,阐述了目前国内外学者提出的各种应对连作问题的策略和技术措施,提出大豆连作障碍研究仍有待解决的问题和研究方向。