不同罗非鱼品系感染无乳链球菌后对血液和肝胰腺生化指标的影响

为探究无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)感染后对罗非鱼的血液和肝胰腺生化指标的影响，本研究以吉富罗非鱼(Oreochromis niloticus)抗病选育系F5代、奥尼罗非鱼(Oreochromis aureus × O. niloticus)、吉富罗非鱼“百桂”品系为对象，通过人工腹腔注射感染无乳链球菌，检测感染后不同时期肝胰腺和血液中的酸性磷酸酶(ACP)、碱性磷酸酶(AKP)、过氧化氢酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)、总抗氧化能力(T-AOC)和溶菌酶(LZM)活性的变化。结果显示，奥尼罗非鱼、吉富罗非鱼抗病选育系F5代和吉富罗非鱼“百桂”品系的平均死亡率分别为55.4%、60.5%和78.6%，表明奥尼罗非鱼抗感染能力最强；3个品系感染无乳链球菌后，肝胰腺组织中的ACP、AKP、SOD和T-AOC酶活力均呈先升高后下降的趋势，其中，在感染后24 h，奥尼罗非鱼的AKP和CAT酶活力显著高于吉富罗非鱼抗病选育系F5代和吉富罗非鱼“百桂”品系；而感染后24 h，血清中ACP、AKP、LZM、CAT和T-AOC酶均显著升高，而SOD酶则下降，其中，奥尼罗非鱼的ACP、AKP、CAT和T-AOC酶活性明显高于吉富罗非鱼抗病选育系F5代和吉富罗非鱼”百桂”品系。综合比较6种酶在感染后不同时期的活性变化及3个品系的感染存活率，筛选出AKP和CAT作为评估罗非鱼抗无乳链球菌感染能力强弱的指标。     

吉富罗非鱼组蛋白酶B基因克隆及无乳链球菌感染后的表达分析

【目的】探究组蛋白酶B基因（CtsB）在吉富罗非鱼感染无乳链球菌前后的表达差异,为深入研究罗非鱼抗无乳链球菌感染的免疫应答机制及后续通过SNP分子标记/基因组编辑技术快速获得吉富罗非鱼抗病新品种提供科学依据。【方法】通过RACE克隆罗非鱼CtsB基因cDNA全长序列,使用SMART、 Splign、 MEGA v6.0、 BoxShade及MegAlign等在线软件进行生物信息学及系统进化分析,并以实时荧光定量PCR检测吉富罗非鱼CtsB基因组织表达谱及无乳链球菌感染后CtsB基因的表达变化规律。【结果】吉富罗非鱼CtsB基因cDNA序列全长1746 bp,包括161 bp的5'端非编码区（5'-UTR）、 592 bp的3'端非编码区（3'-UTR）及993 bp的开放阅读框（ORF）,共编码331个氨基酸残基。基于CtsB氨基酸序列相似性构建的系统发育进化树显示,吉富罗非鱼与奥利亚罗非鱼的亲缘关系最近,而与鲤鱼、大菱鲆、牙鲆、半滑舌鳎等物种相距较远。CtsB基因在吉富罗非鱼的肝脏、脾脏、鳃、前肾、脑、肠道、皮肤和肌肉等组织中均有表达,且以鳃组织中的相对表达量最高,是其他器官组织的2.0~3.0倍。吉富罗非鱼抗病家系和易感家系感染无乳链球菌后, CtsB基因在脾脏和肾脏中的相对表达量均显著上调 （P<0.05）,并于感染后50 h达峰值,且抗病家系的上调表达幅度大于易感家系。【结论】 CtsB基因在鱼类的进化过程中具有高度保守性,但在不同物种中的表达模式存在明显差异。CtsB基因是吉富罗非鱼的重要免疫因子,在抵御无乳链球菌入侵过程中发挥着重要的免疫作用,可作为罗非鱼抗病育种的SNP分子标记给予开发利用。     

无乳链球菌不同途径感染吉富罗非鱼后病原菌在体内的分布规律研究

为探讨无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)感染罗非鱼(Oreochromis spp)的致病途径。采用腹腔注射、灌胃和浸泡三种方式对吉富罗非鱼进行无乳链球菌(HN016菌株)胁迫感染,利用平板活菌计数法统计三种方式感染后病原菌在体内组织的分布。注射和灌胃两种方式感染后均出现典型的链球菌感染发病症状,其中注射组在感染24 h后出现死亡高峰,死亡率为92.5%;灌胃组感染48 h后出现死亡高峰,死亡率为90%;而浸泡组,感染后均没有出现明显的发病症状,也没有出现死鱼。注射组和灌胃组在感染后2 h,其脾脏、肝脏、前肾、胃、腮、皮肤和肌肉组织中均可分离出病原菌,5 h后在脑组织中均可分离出病原菌,8 h后各组织分离出的病原菌数达到峰值;而浸泡组在感染8 h后才从各组织中分离出病原菌,且它们的数量均低于同时期的注射组和灌胃组。注射和灌胃两种方式可使吉富罗非鱼快速感染无乳链球菌而发病,而浸泡方式感染后病原菌虽可以侵入机体,但不表现出症状。由此,我们推测在自然条件下养殖的罗非鱼是通过口腔采食携带无乳,链球菌的食物而被感染。     

不同浓度药物与不同天数鱼苗对吉富罗非鱼雌性诱导效果的影响

[目的]研究不同浓度药物（苯甲酸雌二醇）与鱼苗天数对吉富罗非鱼雌性诱导效果的影响。[方法]将苯甲酸雌二醇设置6个浓度0、80、90、100、110、120μg/g,分别对卵黄囊刚吸收完的第0天、第5天、第10天吉富罗非鱼苗进行雌性诱导1个月,再饲养至体长16cm时,统计雌性率。[结果]不同天数鱼苗,在6个浓度药物作用下,组内雌性诱导效果均差异极显著（P〈0.01）。其中第0天鱼苗以120μg/g浓度药物,诱导效果最好,平均雌性率67.24%;第5天、第10天鱼苗分别以100、90μg/g浓度药物,诱导效果最好,平均雌性率为56.58%、24.83%。相同药物浓度下,第0天、第5天、第10天鱼苗间,雌性诱导效果差异极显著（P〈0.01）,其中以第0天诱导率最高。[结论]对第0天吉富罗非鱼苗,以浓度为120的药物进行雌性诱导,效果最好。     

3个罗非鱼种群对4种病原菌的抗病力差异比较

[目的]比较吉富罗非鱼F5代(以下简称吉富F5代)、吉富罗非鱼F0代(以下简称吉富F0代)及奥尼罗非鱼对4种病原菌的抗病力差异,为罗非鱼苗种推广养殖提供参考依据.[方法]检测吉富F5代无乳链球菌(Ia和Ib血清型)、海豚链球菌和嗜水气单胞菌对吉富F5代的半致死浓度(LC50),并对3个罗非鱼种群进行人工腹腔注射感染4种病原菌,根据感染后的累计死亡率评估其抗病力差异.[结果]无乳链球菌Ia血清型对吉富F5代的LC50为2.14×105 CFU/mL,无链球菌Ib血清型对吉富F5代的LC50为2.14×106 CFU/mL,海豚链球菌对吉富F5代的LC50为2.14×107 CFU/mL,嗜水气单胞菌对吉富F5代的LC50为5.62×107 CFU/mL.3个罗非鱼种群感染病原菌后连续观察168 h发现,感染无乳链球菌Ia血清型菌株(HN016)的累计死亡率排序为吉富F0代>吉富F5代>奥尼罗非鱼;感染无乳链球菌Ib血清型菌株(GX26)的累计死亡率排序为吉富F0代>吉富F5代>奥尼罗非鱼;感染海豚链球菌菌株(GX05)的累计死亡率排序为吉富F0代>奥尼罗非鱼>吉富F5代;感染嗜水气单胞菌菌株(GX03)的累计死亡率排序为吉富F0代>吉富F5代>奥尼罗非鱼.方差分析结果显示,吉富F5代感染HN016、GX26、GX05和GX03后的累计死亡率均显著低于吉富F0代(P<0.05),与奥尼罗非鱼差异不显著(P>0.05).[结论]经过连续5代选育后,吉富罗非鱼对无乳链球菌(Ia和Ib血清型)、海豚链球菌及嗜水气单胞菌的抗感染能力均得到显著提高,并已接近奥尼罗非鱼的抗病水平.     

四个尼罗罗非鱼引进种群的形态差异分析

采用聚类分析、主成分分析和判别分析3种多元分析方法,对4个尼罗罗非鱼引进种群的7项比例形态性状参数进行比较研究。聚类分析结果显示,来源地为菲律宾的群体C和群体D的形态最接近,与埃及群体B、泰国群体A趋异程度较大。主成分分析构建了3个主成分,其贡献率主成分1为27.838%,主成分2为18.773%,主成分3为14.917%,累计贡献率为61.529%。采用判别分析的方法建立了4个种群的判别函数,判别准确率P1为50.0%～80.0%,判别准确率P2为61.5%～78.6%,综合判别率达66.7%。3种多元分析结果说明,4个尼罗罗非鱼群体在形态上存在一定程度的差异,且集中表现在全长、体长、头长、体高和尾柄高这5个形态性状上。分析结果显示4个尼罗罗非鱼引进种群在形态上存在一定程度的差异。     

吉富罗非鱼抗病品系F_5代抗病性能和生长性能的评估

为评估吉富罗非鱼(GIFT Oreochromis niloticus)抗病F5代的选育效果,以F0代群体和奥尼罗非鱼(Oreochromis aureus×O.niloticus)作为对照组,对F_5代42个家系的抗病性能及生长性能进行评估。对42个家系进行人工腹腔注射感染无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)后,分别有36个和22个家系的感染成活率比F0代和奥尼罗非鱼高,各家系的抗病育种值为–0.158~0.086;生长性能测定发现,42个家系中有27个家系的绝对增长率大于F_0代;感染成活率与体质量之间的遗传相关系数为–0.033。综合分析各个家系的感染成活率、抗病育种值和绝对增长率,筛选出抗病力强且生长速度快的家系7个(2~#、3~#、4~#、6~#、28~#、31~#和35~#),可作为F6代选育和苗种扩繁的亲本。结果表明,经过5个世代的针对性选育,吉富罗非鱼的抗病性能和生长性能均得到了明显改善,选育效果显著。     

吉富罗非鱼抗病选育品系的养殖效果评估

[目的]为进一步推广吉富罗非鱼抗病苗种提供参考。[方法]选择P2代高抗病家系与未选育的P0代鱼苗,在南宁市三塘镇及坛洛镇进行池塘示范养殖,测定其生长性能和抗病性能,评估吉富罗非鱼抗链球菌病品系的选育效果。[结果]在生长性能方面,2个养殖点的试验组和对照组生长速度差异不明显,但试验组的变异系数低于对照组;在抗病性能方面,2个试验组的养殖死亡率均在1%左右,而对照组的死亡率在10%左右;在养殖效益方面,2个试验组的养殖效益均高于对照组。[结论]经过2个世代选育吉富罗非鱼的抗病性能得到了较大提高,而生长性能也没有衰退。     

吉富罗非鱼AFLP反应体系的建立与优化

本文以我国水产养殖主导品种吉富罗非鱼(farmed tilapia)为研究材料,进行扩增片段长度多态性(AFLP)反应体系的研究,初步建立了一套适合罗非鱼的AFLP反应体系。对体系中关键环节的优化结果如下:基因组DNA要求无降解和RNA污染,OD260/OD280比值在1.8~2.0之间;基因组DNA EcoRⅠ/MseⅠ37℃双酶切6h、20℃连接20h,连接产物10倍稀释,PCR预扩增产物稀释45倍作为选择性扩增的模板,选择性扩增产物经6%变性丙烯酰胺凝胶电泳检测可获得条带清晰、背景干扰小的图像。该体系的构建为今后进行罗非鱼群体遗传多样性分析、种质鉴定、重要经济性状分子标记的开发及遗传连锁图谱构建等方面研究提供了参考。     

温度诱导及药物处理对吉富罗非鱼雄性率及生长发育的影响

以吉富罗非鱼GIFT Oreochromis niloticus同一个家系卵黄囊期鱼苗为研究对象,对比36℃水温诱导与浓度为0.6μg/g(饵料)甲基睾酮投喂对其雄性率及生长发育的影响。结果表明:36℃水温持续诱导10d的平均雄性率为(95.0±1.5)%,而30℃下投喂甲基睾酮10 d的平均雄性率仅为(73.0±2.4)%,投喂20 d后达到(96.0±1.3)%,36℃水温诱导+甲基睾酮投喂10 d的平均雄性率为(95.8±1.8)%,对照组仅为(56.0±2.1)%;后期的生长发育显示,36℃水温诱导+甲基睾酮投喂10 d组的生长速度最快,平均日增重达到了5.42 g/d,显著优于其他组(P0.05);性腺组织切片观察显示,经过36℃水温诱导后的雌鱼大部分具有两性特征,无法正常排卵。研究表明,36℃水温诱导10 d能显著提高吉富罗非鱼仔鱼的雄性率,其效果已接近甲基睾酮处理20 d的效果,研究结果将有望应用于吉富罗非鱼苗种生产。