不同品系罗非鱼抗无乳链球菌病性能的评估

[目的]为罗非鱼的养殖提供技术参考.[方法]对吉富罗非鱼P0代和抗病选育P2代、奥尼罗非鱼、尼罗罗非鱼及奥利亚罗非鱼进行人工感染无乳链球菌,评估不同品系罗非鱼的抗无乳链球菌病性能.[结果]从感染死亡率来看,奥尼罗非鱼的抗病性能优于其他品系,各组的感染死亡率大小依次为吉富罗非鱼P0代＞尼罗罗非鱼＞奥利亚罗非鱼＞吉富罗非鱼抗病P2代＞奥尼罗非鱼.其中,吉富罗非鱼抗病P2代的死亡率比Pn代降低45.3％,与奥尼鱼的死亡率相近.从死亡历时来看,吉富罗非鱼抗病选育P2代在感染后48 h才出现死亡,而其他组均在感染后24 h内出现死亡.[结论]通过针对性选育能有效提高吉富罗非鱼的抗病性能,同时也为在罗非鱼苗种投放时品种的选择提供参考依据.     

罗非鱼源Ia和Ib血清型无乳链球菌可溶性蛋白差异分析

前期研究表明,罗非鱼Oreochromis niloticus Ia和Ib血清型无乳链球菌Streptococcus agalactiae疫苗之间缺乏交叉保护力,为了从蛋白分子水平探讨其免疫原性差异的原因,在提取罗非鱼Ia和Ib血清型无乳链球菌可溶性蛋白后应用二维差异凝胶电泳(two dimension-Difference Gel Electrophoresis,2D-DIGE)分析其表达差异蛋白点,应用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)鉴定这些差异蛋白,并使用DAVID生物学数据库预测经鉴定后获得的蛋白功能。结果表明:在2D-DIGE电泳上,Ia和Ib两种不同血清型无乳链球菌具有167个表达差异蛋白点,对这些蛋白点进行质谱分析获得32种蛋白,这些蛋白主要与氧化还原反应、代谢与能量前体物产生、糖代谢反应等生物学过程有关,主要参与糖解和糖异生作用、丙酮酸代谢与脂肪酸生物合成等通路;对蛋白功能的预测表明,GAPGH、半胱氨酸合成酶和锰依赖性锰超氧化物歧化酶的功能与免疫和疫苗研发相关。本研究首次证实,罗非鱼Ia和Ib血清型无乳链球菌存在较多的表达差异蛋白,部分表达差异蛋白的功能与免疫和疫苗研发相关,这可能与链球菌免疫原性有直接关系,但需要进一步地研究和证实。     

无乳链球菌感染吉富品系尼罗罗非鱼的病理学研究

[目的]确定无乳链球菌侵染吉富品系尼罗罗非鱼的途径及靶器官,为罗非鱼抗病育种及无乳链球菌病疫苗的研发提供理论依据.[方法]分别采用腹腔注射、经口灌胃及体外浸泡3种方式对吉富品系尼罗罗非鱼进行无乳链球菌感染,然后采集感染罗非鱼的鳃、脾脏、肝脏和小肠组织进行病理形态学观察,并利用家兔抗无乳链球菌血清进行免疫组织化学定位,明确不同感染途径下无乳链球菌在鱼体内各组织中的分布规律及其浸染的靶器官.[结果]3种人工感染方式均能促使吉富品系尼罗罗非鱼感染无乳链球菌,其中,腹腔注射和经口灌胃在感染2h后即出现病理变化,而体外浸泡感染方式出现病理变化的时间约在感染5h后,且病变程度较腹腔注射和经口灌胃的感染方式轻.免疫组织化学定位发现,腹腔注射组吉富品系尼罗罗非鱼的病原菌信号出现顺序为脾脏→肝脏和鳃→小肠,经口灌胃组的病原菌信号出现顺序为小肠→鳃和脾脏→肝脏,体外浸泡组的病原菌信号出现顺序为鳃→脾脏→肝脏和小肠.[结论]采用腹腔注射、经口灌胃及体外浸泡3种方式均能促使吉富品系尼罗罗非鱼感染无乳链球菌,其对应的病原菌信号分别优先在脾脏、肠道和鳃组织出现.因此,自然养殖条件下防止养殖水体和食源被无乳链球菌污染是防控罗非鱼无乳链球菌病暴发的有效措施.     

4种微生物DNA对罗非鱼抗海豚链球菌感染的初步研究

将4种微生物基因组DNA腹腔注射罗非鱼(Oreochromis niloticus),48 h后腹腔注射海豚链球菌,在攻毒后24和48 h采血,通过测定血清溶菌酶(LSZ)、超氧化物歧化酶(SOD)和碱性磷酸酶(AKP)活性的变化,以及血液中病原菌感染量和死亡率,探讨注射4种微生物DNA对罗非鱼抗海豚链球菌感染的作用.结果显示,注射大肠杆菌DNA的实验组,LSZ、AKP和SOD均无明显变化(P＞0.05),表现为先略低于对照组后升至正常水平;而注射鮰爱德华氏菌DNA、毕赤酵母DNA和生理盐水的实验鱼,LSZ和AKP表现出明显变化(P＜0.05),LSZ变化趋势为先增加后降低,而AKP变化趋势则不同.注射感染后除对照组外,其他处理组均有不同程度的细菌感染,其中24h大肠杆菌组感染量显著低于生理盐水组(P＜0.05),而48 h各试验组的细菌感染量均显著低于生理盐水组(P＜0.05),尤其以大肠杆菌组和嗜水气单胞菌组最低,且其死亡率也最低,表明注射一定量的大肠杆菌基因DNA和嗜水气单胞菌基因DNA能增强罗非鱼抗海豚链球菌感染能力.     

4个品系罗非鱼生长性能的比较

为评估不同品系罗非鱼的生长性能,对吉富罗非鱼抗病F_4代、未选育的F_0代、"百桂品系"吉富罗非鱼和奥尼罗非鱼进行同塘混养,比较4个品系的生长速度和养殖存活率的差异。结果显示,4个品系的平均生长速度、绝对增质量率和肥满度均为F_4代百桂F_0代奥尼;平均特定增质量率依次为F_0代奥尼百桂F_4代;且F_4代平均体质量的变异系数最小;养殖成活率为奥尼F_4代F_0代百桂,且奥尼与其他品系存在显著性差异(P0.05);遗传相关性统计发现F_0代和奥尼以体质量与体长的相关系数最高,F_4代和"百桂品系"以体质量与体高的相关系数最高,均达到了极显著水平(P0.01)。以上结果表明,经过选育吉富罗非鱼抗病F_4代的生长性能和养殖成活率均得到了明显的提高,可以进行大规模推广养殖。     

全雌吉富罗非鱼家系选育及其生长性能分析

[目的]建立XX型全雌吉富罗非鱼家系,为今后进行全雄吉富罗非鱼规模化制种提供优质母本,进而为罗非鱼性别控制及育种研究提供基础材料.[方法]通过给仔鱼连续15 d投喂60 mg/kg的甲基睾丸酮(MT)诱导获得表型全雄吉富罗非鱼,经测交筛选获得伪雄吉富罗非鱼(:XX),与常规雌性吉富罗非鱼(:XX)交配繁育全雌罗非鱼家系,经过3个世代选育获得全雌和伪雄吉富罗非鱼.根据吉富罗非鱼生殖孔外观结构差异进行性别鉴定;测量150日龄时各吉富罗非鱼家系的体长和体重,并计算罗非鱼肥满度.[结果]MT诱导吉富罗非鱼的雄性率达100.0%;吉富罗非鱼选育家系F1~F3代的平均雌性率分别为80.3%、92.4%和99.9%,分别获得5、5和6个全雌家系,其中F3代仅有1个非全雌家系(雌性率为99.4%).吉富罗非鱼选育家系F1~F3代150日龄雄性罗非鱼的平均体重分别为815.4、857.9和930.1 g,较对照组提高8.73%、14.62%和21.31%,其中F2和F3代的体重显著高于对照组(P<0.05,下同);3个世代雄性罗非鱼平均体长分别为25.63、25.48和26.22 cm,较对照组提高3.51%、2.87%和4.42%,F3代的体长显著高于对照组.吉富罗非鱼选育家系F1~F3代150日龄雌性罗非鱼的平均体重分别为733.9、745.0和789.8 g,较对照组显著提高12.13%、16.48%和24.99%;平均体长分别为24.57、24.35和24.79 cm,较对照组提高3.93%、3.13%和4.07%,其中F1代的体长显著高于对照组.经过3个世代选育,吉富罗非鱼的生长性能得到大幅提升,F3代吉富罗非鱼选育家系的平均体重提高22.97%,保种家系的平均体重提高28.62%,且肥满度也得到明显提高.[结论]通过MT诱导处理可批量生产伪雄吉富罗非鱼,实现全雌吉富罗非鱼的规模化制种,经过3个世代选育,获得的伪雄和全雌吉富罗非鱼生长性能显著提高,更适于吉富罗非鱼育种及性别相关研究.     

三黄连合剂对罗非鱼人工感染海豚链球菌病的预防效果

[目的]探讨三黄连合剂对由海豚链球菌感染罗非鱼发病的预防效果,为罗非鱼链球菌病的免疫防治提供参考依据.[方法]分别以含30、60、120 mL/kg三黄连合剂的饵料投喂吉富罗非鱼,连续投喂7d,给药后第8d进行人工感染海豚链球菌,感染后第7d测定脾脏指数,同时于感染后0、12、24 h和7d采集血清样本,检测超氧化物歧化酶(SOD)、溶菌酶(LSZ)、碱性磷酸酶(AKP)、血清补体C3、IgM抗体水平等免疫学指标.[结果]三黄连合剂连续给药7d对吉富罗非鱼血清免疫指标均有一定影响,可显著提高吉富罗非鱼血清SOD活性(P＜0.05,下同).人工感染海豚链球菌后第7d,3个三黄连合剂处理组的罗非鱼脾脏指数较感染不给药组明显升高;在免疫指标方面,高剂量组(120mL/kg)罗非鱼的血清SOD活性、AKP活性、LSZ活性、补体C3活性、IgM抗体水平均显著或极显著(P＜0.01)高于感染不给药组.[结论]三黄连合剂可减轻因海豚链球菌感染而造成的免疫抑制,保护机体免疫系统,提升免疫力,对罗非鱼感染海豚链球菌有良好的预防效果.     

吉富罗非鱼组蛋白酶B基因克隆及无乳链球菌感染后的表达分析

【目的】探究组蛋白酶B基因（CtsB）在吉富罗非鱼感染无乳链球菌前后的表达差异,为深入研究罗非鱼抗无乳链球菌感染的免疫应答机制及后续通过SNP分子标记/基因组编辑技术快速获得吉富罗非鱼抗病新品种提供科学依据。【方法】通过RACE克隆罗非鱼CtsB基因cDNA全长序列,使用SMART、 Splign、 MEGA v6.0、 BoxShade及MegAlign等在线软件进行生物信息学及系统进化分析,并以实时荧光定量PCR检测吉富罗非鱼CtsB基因组织表达谱及无乳链球菌感染后CtsB基因的表达变化规律。【结果】吉富罗非鱼CtsB基因cDNA序列全长1746 bp,包括161 bp的5'端非编码区（5'-UTR）、 592 bp的3'端非编码区（3'-UTR）及993 bp的开放阅读框（ORF）,共编码331个氨基酸残基。基于CtsB氨基酸序列相似性构建的系统发育进化树显示,吉富罗非鱼与奥利亚罗非鱼的亲缘关系最近,而与鲤鱼、大菱鲆、牙鲆、半滑舌鳎等物种相距较远。CtsB基因在吉富罗非鱼的肝脏、脾脏、鳃、前肾、脑、肠道、皮肤和肌肉等组织中均有表达,且以鳃组织中的相对表达量最高,是其他器官组织的2.0~3.0倍。吉富罗非鱼抗病家系和易感家系感染无乳链球菌后, CtsB基因在脾脏和肾脏中的相对表达量均显著上调 （P<0.05）,并于感染后50 h达峰值,且抗病家系的上调表达幅度大于易感家系。【结论】 CtsB基因在鱼类的进化过程中具有高度保守性,但在不同物种中的表达模式存在明显差异。CtsB基因是吉富罗非鱼的重要免疫因子,在抵御无乳链球菌入侵过程中发挥着重要的免疫作用,可作为罗非鱼抗病育种的SNP分子标记给予开发利用。     

无乳链球菌感染方式对罗非鱼血常规和抗体消长规律的影响

【目的】明确表皮损伤或某种原因造成的炎症是否是罗非鱼无乳链球菌病暴发的重要诱因，为罗非鱼养殖业疫情预警及无乳链球菌疫苗研制提供参考依据。【方法】将180尾体质量约40 g的吉富罗非鱼随机分为健康组、皮肤创伤组和肠炎组，通过浸泡方式感染无乳链球菌（1.5×106 CFU/mL），分别设3个对应的空白对照组（不感染无乳链球菌）。无乳链球菌感染前及感染后24、48、72、96、120、144和168 h等8个时段，分别每组随机挑选15尾罗非鱼采血，将血液涂片后以吉姆萨染色，观察细胞形态并统计外周血白细胞、中性粒细胞、单核细胞和淋巴细胞数量，同时记录罗非鱼死亡数量。每周以ELISA测定1次罗非鱼血清IgM抗体水平，持续10周。【结果】与健康组罗非鱼相比，皮肤创伤组和肠炎组罗非鱼死亡时间提前，存活率显著降低（P<0.05，下同）。3种感染方式的罗非鱼外周血白细胞、中性粒细胞和淋巴细胞数量在感染初期均呈明显的上升趋势，至感染后168 h皮肤创伤组和肠炎组罗非鱼显著高于健康组罗非鱼（P<0.01，下同），说明无乳链球菌感皮肤创伤或患有肠炎的罗非鱼相对于健康鱼能引起更强烈的免疫反应；皮肤创伤组罗非鱼的外周血单核细胞数量在感染后72~168 h均极显著高于健康组罗非鱼，而肠炎组罗非鱼只在感染后24 h极显著高于健康组罗非鱼。相对于健康组和皮肤创伤组罗非鱼，肠炎组罗非鱼血清抗体水平上升时间更早，持续高水平时间更长；健康组和皮肤创伤组的罗非鱼血清特异性抗体出现时间相近，但皮肤创伤组罗非鱼抗体维持高水平的时间更长。【结论】罗非鱼在无乳链球菌感染前后并发机械性或免疫性病理损伤及炎症，会导致感染死亡率升高，即感染无乳链球菌后会加重因转池、运输、寄生虫感染等造成鱼体表皮受损，或饲料霉变等原因造成的肠炎，进而导致罗非鱼死亡率上升。血常规和抗体水平的消长规律能反映罗非鱼无乳链球菌的感染情况，其中，外周血白细胞数量变化可作为判断罗非鱼感染无乳链球菌后病理损伤和免疫应答的参考指标。     

淡水石斑鱼与3种罗非鱼肌肉营养成分的分析比较

[目的]评估淡水石斑鱼的营养价值,为其生产加工和品质改良提供科学依据,从而推进淡水石斑鱼产业的可持续发展.[方法]选取淡水石斑鱼及3种罗非鱼(奥尼罗非鱼、吉富罗非鱼和红罗非鱼)为研究对象,通过肌肉营养成分分析比较,评价淡水石斑鱼肌肉的营养价值.[结果]淡水石斑鱼肌肉的粗蛋白含量为19.57g/100g,与吉富罗非鱼相近,显著高于红罗非鱼(P<0.05,下同);其粗脂肪含量显著高于3种供试罗非鱼,具体排序为:淡水石斑鱼>吉富罗非鱼>奥尼罗非鱼>红罗非鱼.从淡水石斑鱼和3种供试罗非鱼的肌肉中均可检测出17种氨基酸,其中含有人体必需氨基酸(EAA)7种;在氨基酸组成上,4种供试鱼肌肉中含量最高的是谷氨酸(Glu),最低的是半胱氨酸(Cys);淡水石斑鱼的必需氨基酸总量(ΣEAA)与红罗非鱼相当,显著低于奥尼罗非鱼和吉富罗非鱼;对应的必需氨基酸指数(EAAI)分别为淡水石斑鱼82.56,奥尼罗非鱼82.00,吉富罗非鱼84.00,红罗非鱼85.10.除淡水石斑鱼肌肉中的亚麻酸含量显著高于奥尼罗非鱼外,硬脂酸、软脂酸、油酸和亚油酸含量均显著低于3种供试罗非鱼.4种供试鱼肌肉中富含常量元素和微量元素,以钾(K)元素含量最高,其次是磷(P)元素,铜(Cu)元素含量最低.[结论]淡水石斑鱼属于高蛋白低脂肪的优质淡水鱼,其组成氨基酸种类齐全,配比合适,脂肪酸中亚麻酸含量较高,常量及微量元素种类丰富,属于较优质的食物蛋白源.