敖汉细毛羊毛囊FGF10、FGF18和FGFR3基因差异表达的研究

本研究旨在解析FGF家族及其受体基因在细毛羊不同部位皮肤、不同时间mRNA和蛋白的表达及与细毛羊毛囊生长发育的关系,为揭示毛囊生长发育的分子机制奠定理论基础。首先通过基因芯片技术,筛选敖汉细毛羊毛囊发育的差异表达基因,并通过qRT-PCR对基因芯片结果的准确性进行验证。之后对得到的差异表达基因作进一步分析,可知FGFs家族在颈部和腹部,羊毛毛囊的生长旺盛期和缓慢期之间的mRNA表达量存在差异的有FGF10、FGF18和FGFR3基因。最后通过二维凝胶电泳(2-DE)和质谱技术(MS),对毛囊发育的差异表达蛋白进行筛选,得出FGFs家族蛋白质在颈部和腹部、羊毛毛囊的生长期和缓慢期之间仍存在差异表达的有FGF10、FGF18和FGFR3蛋白。结果显示,FGF10mRNA在腹部表达量高于颈部,推测可能对毛囊的发育具有负调控作用;其蛋白表达量颈部均高于腹部,推测可能促进毛囊生长发育。FGF18在腹部其mRNA表达量旺盛期高于缓慢期,推测其可能维持此处毛囊的不活跃状态;其蛋白在颈部表达量均低于腹部,推测可能对毛囊的生长具有抑制作用。FGFR3mRNA和蛋白表达水平无统一趋势,可能与毛囊的生长发育存在较复杂的关系。综合以上,FGF10、FGF18和FGFR3mRNA和蛋白水平在毛囊生长发育的不同部位和不同时期存在差异表达,这提示它们可能与毛囊的生长发育具有一定的关系,并在不同水平发挥调控作用。研究结果为解析FGFs家族成员调控毛囊生长发育的分子机制奠定理论基础,为进一步加快细毛羊育种提供重要候选基因。     

不同杂交组合肉羊肌肉组织中MyoD基因mRNA表达的研究

生肌决定因子(MyoD)是脊椎动物胚胎期肌肉发育的主导调控基因之一。为了研究MyoD基因mRNA在不同杂交品种肉羊之间的表达差异,试验选取杜泊羊与东北细毛羊杂交(杜东组),小尾寒羊与东北细毛羊杂交(小东组)的两组杂交品种羊各3只,采用实时荧光定量PCR技术,检测MyoD基因的表达量。结果表明:MyoD在各组羊胸肌、后腿肌、背最长肌中均有表达,且在不同杂交组合的同一肌肉组织中表达量差异显著(P0.05);MyoD基因在杜东组中胸肌的相对表达量为小东组的1.96倍,杜东组中的后腿肌相对表达量为小东组的6.30倍,杜东组中背最长肌的相对表达量为小东组的1.48倍。     

BMP7基因在细毛羊皮肤毛囊中的表达及与羊毛性状的关系

本研究旨在探讨BMP7基因皮肤毛囊的表达及与羊毛性状的关系,为解析其对羊毛相关性状的调控机理奠定理论基础。实验以敖汉细毛羊为研究材料,分别采集肩部(多毛区)和腹股沟部(少毛区)皮肤组织样。通过基因芯片技术,分析BMP7基因在皮肤不同部位表达量的差异;应用实时荧光定量PCR技术,检测BMP7基因在细毛羊肩部的表达量,并与羊毛性状进行关联分析;应用免疫组化方法,定位BMP7基因在细毛羊毛囊中表达的位置。结果表明:BMP7基因在肩部和腹股沟部均有表达,且腹股沟部表达量较高,差异倍数在2倍以上(P0.05);关联分析显示,BMP7基因的m RNA表达量与羊毛长度呈显著负相关,相关系数为-0.373(P0.05);免疫组化结果显示,BMP7基因在细毛羊皮肤中,主要表达于表皮上皮、皮脂腺和外根鞘细胞中,在毛干细胞中有少量表达。综上,推测在毛干中表达的BMP7基因,可能对羊毛长度的增长具有一定的抑制作用。     

BMPR1B基因在细毛羊皮肤毛囊中的表达及与羊毛性状关系的研究

本研究旨在探讨BMPR1B基因在皮肤毛囊的表达及与羊毛性状的关系,为解析其对羊毛相关性状的调控机理奠定理论基础。以敖汉细毛羊为研究材料,分别采集肩部(多毛区)和腹股沟部(少毛区)皮肤组织样。通过基因芯片技术,分析BMPR1B基因在皮肤不同部位表达量的差异;应用实时荧光定量PCR技术,检测BMPR1B基因在细毛羊肩部的表达量,并与羊毛性状和毛囊密度进行关联性分析;应用免疫组化方法,定位BMPR1B基因在细毛羊毛囊中表达的位置。结果表明:BMPR1B基因在肩部和腹股沟部均有表达,且在肩部表达量较高,差异倍数在2倍以上(P0.05);关联分析显示,BMPR1B基因的m RNA表达量与羊毛细度呈显著正相关,相关系数为0.382(P0.05);免疫组化结果显示,BMPR1B基因在细毛羊皮肤中,主要表达于表皮上皮细胞和内根鞘细胞中。综上,可推测在内根鞘中表达的BMPR1B基因,可能对羊毛细度具有调控作用,这可对细毛羊的育种实践提供理论参考。     

不同品种绵羊背最长肌PRKAG3和LPL基因的表达差异

选取体重接近的鄂尔多斯细毛羊与昭乌达肉羊各5只,屠宰后取背最长肌检测肌内脂肪含量,用荧光实时定量PCR法检测肌肉PRKAG3和LPL基因mRNA表达水平,分析其与肌内脂肪含量的关系.结果表明,鄂尔多斯细毛羊背最长肌IMF含量显著高于昭乌达肉羊(P＜0.01);鄂尔多斯细毛羊LPL基因mRNA的表达量与鄂尔多斯细毛羊的IMF含量呈负相关(-0.44);PRKAG3基因mRNA的表达量与昭乌达肉羊的IMF含量呈负相关(-0.42),但差异均不显著;鄂尔多斯细毛羊和昭乌达肉羊背最长肌PRKAG3基因mRNA的表达量差异不显著,而鄂尔多斯细毛羊LPL基因mRNA的表达量显著高于昭乌达肉羊(P＜0.01).     

FDFT1基因shRNA和过表达载体的构建及在牛胎儿成纤维细胞中的验证

构建了带有绿色荧光标记的法尼基二磷酸法尼基转移酶1(farnesyl-diphosphate farnesyltransferase 1,FDFT1)基因shRNA干扰载体以及过表达载体,将其转染牛胎儿成纤维细胞(bovine fetal fibroblasts,BFF),采用荧光定量PCR和Western blot的方法,检测FDFT1基因mRNA和蛋白的表达水平,在细胞水平验证了shRNA干扰载体的干扰效率和过表达载体的有效性。结果显示:shRNA组FDFT1-Bos-520的FDFT1基因mRNA表达水平降低至shRNA NC组的40.7%(P0.01),蛋白质表达水平降低至shRNA NC组的39.61%(P0.01);而FDFT1基因pBI-CMV3-FDFT1过表达组FDFT1基因mRNA的表达水平为pBI-CMV3空载体组的137.9倍(P0.01),蛋白表达水平升高至空载体组的2.34倍(P0.01)。本试验通过荧光定量PCR和Western blot的检测方法验证了FDFT1基因过表达载体及干扰载体转染BFF后,FDFT1基因表达量的变化,为进一步研究FDFT1基因对胆固醇代谢和脂质代谢的影响和作用机制提供了实验材料及分子依据。     

PCK1基因在延黄牛不同部位脂肪组织和内脏中的表达分析

试验旨在阐明延黄牛PCK1基因在不同脂肪组织与内脏器官的表达水平,探讨PCK1基因表达与脂肪沉积的关系。以延黄牛皮下脂肪和背最长肌及其他内脏器官为材料,采用实时荧光定量PCR和Western blot方法,对PCK1mRNA和蛋白质水平在延黄牛脂肪组织和内脏器官中的分布规律进行分析。实时荧光定量PCR结果表明,PCK1基因在肾脏、皮下脂肪和腹部脂肪中的表达量均显著高于背最长肌和其他内脏器官(P0.05),在肾脏中的表达量显著高于皮下脂肪和腹部脂肪(P0.05),在腹部脂肪中的表达量显著高于皮下脂肪(P0.05);而在背最长肌、肺、心脏、小肠和肝脏中表达差异不显著。Western blot结果表明,在腹部脂肪中PCK1蛋白的表达量显著高于皮下脂肪(P0.05)。研究结果可为进一步探讨脂肪沉积机制及优化延黄牛肉品品质奠定基础。     

BMP4基因在细毛羊肩部皮肤的表达及其与毛囊密度的关联分析

为了探讨骨形态发生蛋白家族4(BMP4)基因与毛囊密度的关系,试验以敖汉细毛羊为研究对象,采集肩部(多毛区)的皮肤组织样,应用实时荧光定量PCR技术测定BMP4基因的mRNA表达量,并与肩部皮肤毛囊密度进行关联性分析。结果表明:细毛羊肩部BMP4基因的表达量与毛囊密度之间呈显著负相关(P0.05),相关系数为-0.391。初步推测BMP4基因可能对毛囊密度的增加起抑制作用。     

EphA2及EphrinA2在敖汉细毛羊皮肤中的表达及分布规律研究

本文旨在探究EphA2及其配体EphrinA2基因在细毛羊毛囊发生、发育过程中的表达与分布规律,为毛囊发育的分子调控机制提供理论基础。试验以敖汉细毛羊生长发育不同时期体侧部皮肤为材料,采用实时荧光定量PCR和免疫组化技术,对EphA2和EphrinA2基因的mRNA和蛋白水平在皮肤毛囊中的表达规律进行研究。实时荧光定量PCR结果显示:EphA2和EphrinA2基因的表达量在胎龄120d时显著高于胎龄90d和出生后1d(P0.01);出生后1和30d时差异不显著(P0.05)。免疫组化结果表明:EphA2及EphrinA2蛋白在胎龄90和120d、出生后1和30d,4个时期的细毛羊体侧皮肤毛囊发育过程中,主要在毛囊、毛母质、外根鞘和表皮中表达,且呈现一定的特异性表达。综上结果表明,EphA2及EphrinA2与细毛羊皮肤毛囊形态发生、发育过程密切相关,可为相关研究提供借鉴。     

不同群体肉羊背最长肌中H-FABP mRNA表达的比较研究

心脏型脂肪酸结合蛋白(H-FABP)基因是影响肌间脂肪(IMF)含量进而调控肉品质的的主要候选基因。试验以乌珠穆沁羊以及以南非肉用美利奴羊、东北细毛羊、小尾寒羊、杜泊羊为亲本获得的3种杂交羊(杜寒杂DS组,南寒杂SS组,东南杂NS组)为研究对象,采用实时荧光定量PCR技术测定了背最长肌中H-FABP mRNA的相对表达量,比较该基因在不同群体中的表达差异。结果表明:H-FABP在不同品种肉羊背最长肌中均有表达,但不同群体间差异不显著(P>0.05)。以乌珠穆沁羊H-FABP mRNA表达量为参照,H-FABP mRNA在杜寒杂交羊中的相对表达量约为乌珠穆沁羊的3倍,南寒杂交羊中的相对表达量约为乌珠穆沁羊的0.5倍,东南杂交羊中的相对表达量约为乌珠穆沁羊的1.4倍。H-FABP可能是调控纯种地方绵羊及杂交肉羊肌肉肉质性状的候选基因。     

miR-200c和miR-429靶向调节绵羊皮下脂肪细胞中SCD1表达的研究

旨在预测并验证调节绵羊皮下脂肪细胞中SCD1基因表达的关键miRNAs。本研究利用4个生物信息学软件TargetScan、mirDB、StarBase和miRanda预测与该基因具有靶标关系的关键miRNAs;利用双荧光素酶报告系统验证SCD1基因与miRNAs的靶标关系;利用荧光定量PCR和Western-blotting技术,分别在mRNA和蛋白水平上检测miRNAs对SCD1 mRNA和蛋白质表达的影响。预测结果表明,miR-200c和miR-429是调控SCD1基因表达的关键miRNAs;双荧光素酶报告系统检测证明,2个miRNAs与SCD1基因都具有靶标关系;荧光定量PCR显示,miR-200c和miR-429显著抑制SCD1 mRNA的表达(P0.05),且miR-200c作用更大;Western-blotting显示,miR-200c和miR-429极显著抑制SCD1蛋白质的表达(P0.01);显微镜观察发现,miR-200c和miR-429抑制绵羊皮下脂肪细胞脂滴生成。由此证明,miR-200c和miR-429均靶向抑制SCD1基因的表达,进而抑制绵羊脂肪生成。     

热应激绍兴鸭不同组织HSP70基因mRNA表达研究

研究蛋鸭热应激条件下不同组织中热休克蛋白70(HSP70)基因mRNA表达规律,为揭示蛋鸭热应激反应机理提供参考。60只绍兴蛋鸭25℃饲养20d,其中30只进行40℃热应激处理1h,采取荧光定量PCR方法分别测定不同组织中HSP70mRNA的表达水平。试验组与对照组相比,肝脏、脾脏和胰腺组织HSP70mRNA表达差异不显著,其他6种组织HSP70基因表达量均有不同程度的增加,试验组心脏、腿肌、垂体、下丘脑、胸肌、肾脏中HSP70基因表达量分别高于对照组3.6倍、2.8倍、2.7倍、2.4倍、2.2倍和1.57倍。     

KDR基因在延黄牛不同部位脂肪组织中相对表达量的研究

试验旨在阐明KDR基因在不同脂肪组织中的表达水平,为延黄牛脂肪沉积规律提供参考.以延黄牛皮下脂肪和腹部脂肪为材料,采用荧光定量PCR技术检测不同部位脂肪组织中KDR基因的相对表达量,通过2-ΔΔCt法处理不同部位脂肪组织相对表达量数据,SPSS 17.0软件分析表达水平差异显著性.结果表明:KDR基因在腹部脂肪中的表达量显著高于皮下脂肪组织(P<0.05),研究结果可为进一步探讨不同部位脂肪组织的发育机制奠定基础.     

绵羊肌肉组织MyoG和PID1基因的表达及其与肌内脂肪含量的关系

本研究旨在探究绵羊不同部位肌肉MyoG和PID1基因mRNA的发育变化规律,分析MyoG和PID1基因mRNA表达水平对肌内脂肪沉积的影响。选取2、4、5、6月龄敖汉细毛羊公羔和12月龄敖汉细毛羊成年公羊各5只,屠宰后取背最长肌和股二头肌检测肌内脂肪(Intramuscular fat,IMF)含量,用实时荧光定量PCR检测两个部位肌肉MyoG和PID1mRNA表达量,并进一步分析表达量与肌内脂肪含量的关系。结果表明,2~5月龄时,背最长肌和股二头肌的IMF含量均随着月龄的增加而增加;而5~12月龄时则基本保持不变;同月龄背最长肌IMF含量极显著高于股二头肌(P0.01)。两个部位肌肉MyoG和PID1mRNA表达的发育模式有所不同,具有组织特异性。背最长肌MyoG基因表达量5月龄最高(P0.01),PID1基因表达量6月龄最高(P0.05),均呈上升-下降趋势;股二头肌MyoG和PID1基因各月龄之间表达量均差异极显著(P0.01),MyoG基因表达量随着月龄增长呈上升-下降趋势,PID1基因表达量大体呈下降-上升趋势。同月龄MyoG和PID1表达量存在组织差异。相关分析表明,MyoG和PID1表达量与IMF含量呈不同程度正相关。综上,MyoG基因表达对绵羊肌内脂肪的沉积可能有正调控作用,而PID1基因表达可能对肌内脂肪的沉积产生一定的影响。     

猪SP-A基因荧光定量PCR检测方法的建立

SP-A(surfactant protein-A)mRNA的表达对肺的发育、成熟均起关键作用,并且与肺部疾病的发生相关。为了建立荧光定量PCR技术检测猪SP-A表达量的方法,根据猪SP-A基因的mRNA序列(EU622632)设计引物,从纯化模板、PCR程序设计等方面进行了优化,建立了基于SYBR Green I染料技术的Power SYBR(Green荧光定量PCR方法。结果表明,所建立的Power SYBR(Green荧光定量PCR方法检测猪SP-A基因具有特异性好、简便、可靠等特点,为猪SP-A基因定量分析奠定了基础。     

实时荧光定量PCR检测鸡生长激素基因方法的建立

本研究旨在建立定量分析鸡生长激素(Growth hormone,GH)基因mRNA表达水平的实时荧光定量PCR方法,为鸡GH基因mRNA表达水平的定量分析及探讨其与马立克氏病遗传抗性间关系奠定基础。根据GenBank数据库中鸡的GH基因序列,使用Oligo7软件在该基因保守区域设计合成一对引物并扩增GH基因片段,经回收纯化后连接到pGM-T载体,成功构建了含有GH基因片段的pGM-T-GH标准质粒。在此基础上,通过SYBR GreenⅠ染料法建立了pGM-T-GH重组质粒的实时荧光定量PCR标准曲线及其回归方程,成功建立了实时荧光定量PCR检测鸡GH基因的方法。     

阉割对猪甲状腺转录因子-1、2(TTF-1,2)基因表达的影响

为了研究阉割对甲状腺转录因子-1、2(TTF-1,2)基因的影响,本研究采用荧光定量PCR技术分析阉割与非阉割金华猪甲状腺组织中丁TF_1和TTF-2基因在60、90和120日龄时的表达水平.结果表明:非阉割猪TTF-1和TTF-2基因在不同生长阶段的表达量呈稳步上升趋势,阉割猪TTF-1和TTF-2基因的表达基本稳定.TTF-1与TTF-2 mRNA的表达量均是在60、90日龄时阉割组高于非阉割组;在120日龄时,阉割组TTF-1与TTF-2 mRNA的表达量均低于非阉割组,但差异不显著(P>0.05).结果,建立的SYBR-Green荧光定量PCR方法可以有效地用于TTF-1和TTF-2基因的表达分析;另外,阉割使得猪甲状腺TTF-1和TTF-2基因在60、90日龄的表达量升高,且TTF-1基因的表达与猪部分肉质性状存在显著的相关性.     

冷应激对新疆阿勒泰羊脂蛋白脂酶mRNA表达的影响

为研究冷应激对阿勒泰羊脂蛋白脂酶(lipoprotein lipase,LPL)mRNA表达的影响,试验分别采集冷应激前与冷应激后阿勒泰羊6个部位的组织,采用实时荧光定量PCR方法检测各组织中LPL mRNA的表达水平,分析其在不同部位中表达的变化.结果显示,阿勒泰羊LPL mRNA表达量在冷应激后显著或极显著升高(P<0.05;P<0.01),其中颈部肌间脂肪和尾部脂肪冷应激后表达量最高.表明阿勒泰羊在低温下脂肪组织的动员能力较强,使机体产热增加,以抵抗冷应激.     

新吉细毛羊角蛋白的EST筛选及表达研究

试验旨在从新吉细毛羊皮肤组织表达序列标签(expressed sequence tags,ESTs)中筛选与毛囊发育相关基因并探讨其表达模式与羊毛细度的相关性。利用组装、比对软件Trinity与Blat对新吉细毛羊皮肤组织ESTs组装、注释进而筛选与毛囊发育相关基因,并通过实时荧光定量PCR相对定量方法以2^-△△Ct值检测相关基因在不同绵羊个体中的表达规律。结果显示,从474条ESTs中筛选注释获得了4个与毛囊发育相关的角蛋白基因KRT27、KAP3.2、KAP11.1和KAP8.1;4个角蛋白基因在超细型细毛羊皮肤组织表达量极显著高于细型细毛羊的表达量(P<0.01);4个角蛋白基因表达量:KRT27 >KAP3.2 >KAP11.1 >KAP8.1。该研究为角蛋白基因在细毛羊转录水平上的研究提供了一定数据。