牦牛卵巢颗粒细胞中Bmal1基因的表达试验

为了研究Bmal1基因在牦牛卵巢颗粒细胞中的表达情况。本试验利用细胞免疫荧光法分析Bmal1基因在体外培养的牦牛卵巢颗粒细胞中的表达定位,并用qRT-PCR方法检测经地塞米松处理后24 h内不同培养时间点颗粒细胞中Bmal1基因的表达规律。结果显示:Bmal1在牦牛颗粒细胞的细胞质中表达。Bmal1基因在不同培养时间点的颗粒细胞中呈节律性表达(P0.05),振幅为0.28。表明牦牛颗粒细胞中存在Bmal1基因并且呈现规律性表达,Bmal1有可能是牦牛卵巢发育中的关键性生物节律调控基因。     

siRNA干扰牦牛Bmal1基因对颗粒细胞激素分泌的影响

本研究旨在探讨敲低Bmal1基因对体外培养牦牛颗粒细胞雌二醇(E2)和孕酮(P4)分泌的影响。应用siRNA技术下调颗粒细胞中Bmal1基因的表达,利用ELISA试剂盒检测细胞培养液中E2与P4含量,再通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)和蛋白印迹(Western Blot)检测细胞激素分泌相关基因的表达情况。结果显示:经si-Bmal1转染颗粒细胞后,E2分泌量显著下降,P4分泌量极显著下降;在mRNA检测水平上,激素合成相关基因Cyp19a1、Star的表达量下降;在蛋白检测水平上,Cyp19a1、Star的结果与mRNA表达基本一致。综上表明,敲低Bmal1基因能通过调控相关基因的表达抑制体外培养牦牛颗粒细胞E2和P4的分泌水平,Bmal1基因参与牦牛颗粒细胞激素分泌的调控。     

牦牛卵泡发育过程中MST1和YAP1的表达特征研究

哺乳动物STE20样激酶1(Mammalian Sterile 20-like Kinase 1,MST1)和Yes相关蛋白1(Yes AssociatedProtein1,YAP1)作为Hippo信号通路的主要成员，在哺乳动物胚胎发育、细胞增殖与凋亡、调节器官体积以及维持内环境的稳态等过程中发挥生理学效应。为探讨MST1和YAP1对牦牛卵泡发育产生的影响，本实验采集健康牦牛的卵巢，按照卵泡直径大小将其分为小卵泡（2～4 mm）、中卵泡（4～6 mm）、大卵泡（6～8 mm）和超大卵泡（>8 mm），采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)、Western Blotting、免疫组织化学技术，对不同大小卵泡中MST1基因和YAP1基因及其蛋白表达情况进行分析研究。结果显示，MST1和YAP1基因及其蛋白在牦牛各个发育阶段卵泡中均有表达，其表达量在不同大小卵泡中存在一定差异。尤其处于优势化选择阶段时中卵泡的表达量显著高于其他3个期。YAP1在牦牛各发育阶段卵泡中的表达变化与MST1基本一致。从表达部位来看，MST1和YAP1蛋白主要分布于卵泡颗粒细胞和卵泡膜细胞中。结果表明，MST...     

牦牛RGS1基因克隆及其在发情周期卵巢中的表达

本研究旨在阐明牦牛RGS1基因的表达特性及其在牦牛发情周期中卵巢组织的表达。通过采集不同发情周期的牦牛卵巢及肌肉、脾、心、肾、胃、小肠、小脑、肝和肺组织,以GenBank上已发布的黄牛RGS1基因序列设计引物,利用RT-PCR方法扩增克隆牦牛RGS1基因及检测其在牦牛各组织中的表达谱,并使用相关生物信息学软件分析RGS1基因的结构和功能。采用实时荧光定量PCR法检测RGS1基因在牦牛发情周期卵巢中mRNA的表达水平。结果表明,本试验克隆得到牦牛RGS1基因718bp的cDNA序列。同源性与进化树分析表明,牦牛RGS1核苷酸序列与黄牛、野牦牛等大多数哺乳动物的遗传距离较近,其在进化进程中相对较保守。牦牛RGS1基因CDS区为591bp,编码196个氨基酸残基,相对分子质量为22.48ku,不含跨膜结构和信号肽,为亲水性蛋白和非分泌蛋白。蛋白二级结构和三级结构以α-螺旋和自由卷曲结构为主。RGS1基因在所选牦牛组织样品中均有表达,其中在小肠、小脑、心和胃中表达量最高。荧光定量PCR结果显示,牦牛黄体期卵巢中RGS1mRNA的表达量极显著高于卵泡期和红体期(P0.01),卵泡期中RGS1mRNA表达水平高于红体期,但差异不显著(P0.05)。本研究成功克隆了RGS1基因及其在牦牛卵巢3个时期中mRNA的差异性,表明该基因参与发情周期卵巢的内分泌活动调控。     

溶血磷脂酸受体1-3在牦牛不同时期卵巢中表达定位

为探究正常生理下条件下溶血磷脂酸受体(LPAR)1-3在牦牛不同时期卵巢(卵泡期、黄体期、妊娠期)表达及生物学作用,利用RT-qPCR检测LPAR1-3基因在不同时期卵巢上的表达,同时利用蛋白质免疫印迹、免疫组织化学(IHC)等方法对LPAR1-3基因和蛋白的表达进行分析和定位。结果显示,LPAR1-3在牦牛不同时期卵巢上均有表达,其中LPAR1-3的表达量在妊娠期显著高于卵泡期和黄体期(P0.05),卵泡期表达量最低;在卵泡期、黄体期、妊娠期LPAR3的表达量均显著高于LPAR1和LPAR2(P0.05),LPAR2的表达量最低;IHC结果显示,LPAR1-3在卵巢生殖上皮、颗粒细胞、卵泡液、卵泡膜和黄体细胞均有表达。研究结果提示LPAR1-3可能在卵泡生长、发育、排卵以及维持妊娠等一系列生殖过程中发挥重要的作用,其中LPAR3可能在这一过程中起主要作用,该结果有助于对牦牛繁殖机能的进一步研究,可为高原哺乳动物生殖生理的研究提供理论依据。     

牦牛卵泡发育及卵母细胞成熟过程中CYP19A1表达差异分析

旨在探索CYP19A1在牦牛卵泡发育过程及不同成熟阶段卵母细胞中的表达水平。采用实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR,qRT-PCR)检测CYP19A1在牦牛不同级别卵泡(≤3 mm、3～5 mm、5～8 mm及≥8 mm)和卵丘—卵母细胞复合体(Cumulus-oocyte complex,COCs)体外成熟的不同阶段(成熟0 h、12 h、18 h及24 h)中的表达水平,免疫荧光技术(Immunofluorescence,IF)检测CYP19A1蛋白在COCs中的表达定位。结果显示:CYP19A1基因在不同级别的卵泡中均有表达,在卵泡发育早期表达量最高,随卵泡发育呈低水平表达;CYP19A1基因在COCs中的相对表达量显示,未成熟(0 h)COCs的表达量最低,成熟18 h的COCs表达水平达到最高值,之后呈下降趋势。通过免疫荧光技术发现COCs中CYP19A1蛋白的表达主要集中在卵丘细胞上。推测CYP19A1在卵巢颗粒细胞中的表达有助于卵泡发育和卵母细胞成熟雌二醇(Estradiol,E_2)的分泌,对卵泡和卵母细胞早期发育有积极的调控作用,为进一步探索CYP19A1在牦牛雌性生殖中的作用机制提供了理论支撑。     

CCND2在雌性牦牛生殖轴系中的表达分布

细胞周期蛋白CCND2(Cyclin-D2)是细胞增殖和细胞周期中G1/S期转变的关键调控因子,在癌症、营养代谢以及卵泡发育中参与调控.为研究CCND2在雌性牦牛(Bos grunniens)生殖轴系(HPOA轴)中的表达分布及其对季节性繁殖的作用机制,选取健康发情期雌性牦牛的下丘脑、垂体、卵巢组织,采用实时荧光定量P...     

牦牛p38MAPK在雌性主要生殖器官中的表达

旨在研究p38MAPK在母牦牛主要生殖器官中的表达情况,了解其表达差异性,为牦牛的繁殖性能研究提供相关基础资料。本研究采集卵泡期、黄体期、妊娠期成年健康母牦牛(各2头)主要生殖器官样品,免疫组化技术检测p38MAPK蛋白的表达部位;qRT-PCR和Western-blot技术对其基因和蛋白进行相对表达量测定。结果:1)免疫组化结果显示,p38MAPK蛋白在牦牛的卵巢、输卵管和子宫均呈阳性表达;2)qRT-PCR结果表明,p38MAPK基因在卵巢中的表达量卵泡期显著高于妊娠期(P0.05);在输卵管中的表达量黄体期显著高于卵泡期和妊娠期(P0.05);在子宫中的表达量妊娠期极显著高于卵泡期和黄体期(P0.01);3)Western-blot结果显示,p38MAPK蛋白在卵巢中的表达量卵泡期极显著高于黄体期和妊娠期(P0.01);在输卵管中的表达量黄体期极显著高于卵泡期和妊娠期(P0.01);在子宫中的表达量妊娠期极显著高于卵泡期和黄体期(P0.01)。结果表明,p38MAPK在母牦牛同一生殖器官的不同繁殖阶段其表达存在差异性,其可能参与了牦牛卵泡发育、黄体功能发挥以及胚胎着床和发育等一系列生殖过程,为牦牛的繁殖性能研究提供相关基础资料。     

时钟基因在扬州鹅内分泌组织中的节律性表达

鹅产蛋行为是典型的节律行为,为了揭示时钟基因在扬州鹅不同内分泌组织中的节律性表达规律,选取在连产周期内且产蛋时间基本一致的扬州鹅24只,在48 h内每隔6 h采集3只鹅的下丘脑、垂体、卵巢组织样品,并采用RT-qPCR分别检测Clock、Bmal1、Bmal2、Cry1、Cry2、Per2基因在不同时间点的表达变化。结果显示:所检测的6个时钟基因在3个组织中均有所表达,且在不同的时间点表达量有所差异。其中Clock基因在3个组织中的表达均呈现出节律性,Bmal1基因在垂体和卵巢中表现出节律性,Bmal2基因在卵巢中表现出节律性,Per2基因在下丘脑、卵巢组织中与Clock基因表达趋势相反,表现出负反馈调节作用。表明Clock基因很有可能介导Per2参与鹅产蛋行为节律调控。     

牦牛FSHR基因克隆及其在生殖轴中的表达研究

本研究旨在阐明牦牛促卵泡素受体(follicle stimulating hormone receptor,FSHR)基因CDS序列及其在牦牛生殖轴中表达的特点,为探讨其在牦牛繁殖活动中的调控作用奠定基础。试验采集卵泡期的牦牛与黄牛下丘脑、脑垂体前叶、卵巢、输卵管及子宫组织,通过RT-PCR技术对牦牛FSHR基因cDNA进行扩增、克隆与序列分析;采用实时荧光定量PCR法检测FSHR基因在牦牛与黄牛中的组织表达差异。结果显示,牦牛FSHR基因编码区全长2 088bp,编码695个氨基酸,蛋白质分子式为C6378H10670N2088O2637S576,分子质量为177 263.85u,理论等电点(pI)为4.88,与黄牛、绵羊、山羊和猪氨基酸序列同源性较高(91.50%～99.38%)。FSHR蛋白为酸性不稳定疏水蛋白,存在信号肽与8个跨膜结构;二级结构由延伸链(15.54%)、α-螺旋(42.30%)、β-转角(1.44%)和无规则卷曲(40.72%)组成;系统进化树表明,牦牛与黄牛亲缘关系最近;实时荧光定量PCR结果显示,FSHR基因在黄牛、牦牛检测组织中均有表达,牦牛子宫中表达量显著或极显著高于除卵巢外的其他组织(P0.05;P0.01),而黄牛卵巢中表达量显著或极显著高于其他组织(P0.05;P0.01);黄牛卵巢中表达量极显著高于牦牛(P0.01)。说明FSHR基因在动物进化中较为保守,其在牦牛卵巢中表达量低可能影响到牦牛繁殖机能。     

牦牛跨膜附睾蛋白1基因的克隆及其在卵丘卵母细胞复合体中的表达分析

试验旨在分析牦牛跨膜附睾蛋白1（transmembrane epididymal protein 1，TEDDM1）基因的分子特征及其在卵泡发育中的时序表达特性。研究分别收集发情期牦牛大卵泡（φ≥8 mm）、中卵泡（φ=5~7 mm）和小卵泡（φ≤3 mm）中的卵丘-卵母细胞复合体（COCs）；提取总RNA并反转录，对TEDDM1基因CDS区全序列进行克隆测序，用生物信息学软件分析其编码蛋白分子特征；以牛GAPDH基因为内参，采用实时荧光定量PCR技术分析TEDDM1基因在卵泡发育不同时期的表达水平。结果表明，牦牛TEDDM1基因CDS区全长903 bp，共编码300个氨基酸，与野牦牛、牛、野牛、绵羊和水牛氨基酸序列有极高的相似性，在进化中较为保守；牦牛TEDDM1蛋白为非分泌型不稳定疏水蛋白，共存在7个螺旋结构，整条肽链7次横跨胞膜，属于典型的G蛋白偶联受体；其潜在的磷酸化位点共21个，其中酪氨酸、苏氨酸和丝氨酸磷酸化位点分别为1、3和17个，仅存在1个N-糖基化位点，无O-糖基化位点；存在未知功能结构域蛋白家族（domains of unknow function protein families，DUFs）716结构域，且该结构域涵盖多个跨膜区域；实时荧光定量PCR检测结果发现，中卵泡中TEDDM1基因表达水平显著高于大卵泡和小卵泡（P<0.05），而大卵泡与小卵泡的表达水平差异不显著（P>0.05）。本研究分析了牦牛TEDDM1基因序列及其在牦牛COCs中的表达特性，为进一步揭示该基因在牦牛卵泡发育过程中的调控作用奠定了理论基础。     

牦牛FSHR基因克隆及其在生殖轴中的表达研究

本研究旨在阐明牦牛促卵泡素受体(follicle stimulating hormone receptor,FSHR)基因CDS序列及其在牦牛生殖轴中表达的特点,为探讨其在牦牛繁殖活动中的调控作用奠定基础。试验采集卵泡期的牦牛与黄牛下丘脑、脑垂体前叶、卵巢、输卵管及子宫组织,通过RT-PCR技术对牦牛FSHR基因cDNA进行扩增、克隆与序列分析;采用实时荧光定量PCR法检测FSHR基因在牦牛与黄牛中的组织表达差异。结果显示,牦牛FSHR基因编码区全长2 088bp,编码695个氨基酸,蛋白质分子式为C6378H10670N2088O2637S576,分子质量为177 263.85u,理论等电点(pI)为4.88,与黄牛、绵羊、山羊和猪氨基酸序列同源性较高(91.50%～99.38%)。FSHR蛋白为酸性不稳定疏水蛋白,存在信号肽与8个跨膜结构;二级结构由延伸链(15.54%)、α-螺旋(42.30%)、β-转角(1.44%)和无规则卷曲(40.72%)组成;系统进化树表明,牦牛与黄牛亲缘关系最近;实时荧光定量PCR结果显示,FSHR基因在黄牛、牦牛检测组织中均有表达,牦牛子宫中表达量显著或极显著高于除卵巢外的其他组织(P<0.05;P<0.01),而黄牛卵巢中表达量显著或极显著高于其他组织(P<0.05;P<0.01);黄牛卵巢中表达量极显著高于牦牛(P<0.01)。说明FSHR基因在动物进化中较为保守,其在牦牛卵巢中表达量低可能影响到牦牛繁殖机能。     

Smad1基因在敖汉细毛羊发情不同时期卵巢中的表达规律研究

为了探索Smad1 mRNA及其蛋白在敖汉细毛羊不同发情时期卵巢中表达量的变化规律,试验采用实时荧光定量PCR、免疫组化方法分析绵羊不同繁殖状态下(乏情期、发情间期、发情前期、发情期)Smad1基因在卵巢中mRNA表达量的变化规律及卵巢中该基因蛋白的表达,并进行图像分析。结果表明:发情期Smad1基因表达量最高,极显著高于其他三个时期(P0.01);发情前期Smad1基因表达量显著高于乏情期和发情间期(P0.05)。在绵羊不同发情时期Smad1蛋白主要表达于乏情期原始卵泡、次级卵泡的颗粒细胞、发情间期次级卵泡的卵泡膜细胞,在发情前期与发情期卵泡中未见表达。卵巢中Smad1基因可能促进黄体溶解,对卵泡发育、卵子的成熟以及释放起作用,与绵羊发情的启动有一定关系。     

6月龄和成年牦牛卵巢及卵泡发育状况研究

为了研究6月龄牦牛和成年牦牛卵巢及表面卵泡发育状况,试验比较了6月龄和成年牦牛卵巢长度、宽度、厚度、重量、卵泡数量以及卵母细胞体外成熟培养效果。结果表明:成年牦牛卵巢长度(2.29±0.43)cm、宽度(1.91±1.31)cm和厚度(1.60±1.90)cm均显著大于6月龄牦牛[(1.65±0.30)cm、(1.14±0.25)cm、(0.79±0.26)cm](P<0.05),成年牦牛卵巢体积(6.92±7.00)cm3和重量(3.19±1.58)g极显著大于6月龄牦牛体积(1.63±0.93)cm3和重量(0.87±0.44)g(P<0.01)。6月龄牦牛Ⅰ级卵泡数(14.47±8.74)枚和平均总卵泡数(15.17±8.87)枚极显著高于成年牦牛Ⅰ级卵泡数(7.97±3.72)枚和平均总卵泡数(8.98±3.87)枚(P<0.01),Ⅱ级卵泡数差异不显著(P>0.05),成年牦牛平均每头含(0.02±0.15)枚Ⅲ级卵泡,而6月龄牦牛无Ⅲ级卵泡。成年牦牛有黄体卵巢重量显著大于无黄体卵巢重量(P<0.05),有黄体卵巢含(0.06±0.24)枚Ⅲ级卵泡,而无黄体卵巢不含Ⅲ级卵泡。6月龄和成年牦牛A、B级卵母细胞体外培养成熟率分别为(81.39±3.53)%、(80.44±4.50)%,差异不显著(P>0.05),而6月龄牦牛卵巢的平均卵母细胞数和平均A、B级卵母细胞数均显著高于成年牦牛(P<0.05)。     

HSP90、HSP70、HSP27在不同发育时期猫卵巢的表达规律研究

为了探究HSP90、HSP70、HSP27在不同发育时期猫卵巢的表达规律,试验运用免疫组织化学方法检测了5月龄、10月龄、1岁龄、1.5岁龄(未妊娠)和1.5岁龄(妊娠20 d)猫卵巢的HSP90、HSP70、HSP27蛋白表达情况。结果表明:HSP90在5月龄猫卵巢上为强表达,在10月龄猫成熟卵泡、1岁龄猫初级卵泡、1.5岁龄(未妊娠)猫初级卵泡、1.5岁龄(妊娠20 d)猫黄体与原始卵泡、初级卵泡上弱表达,在1岁龄猫原始卵泡表达较强;HSP70在5月龄、10月龄、1岁龄猫的卵巢各级卵泡和1.5岁龄猫的黄体强表达;HSP27在10月龄猫卵巢中未见表达,在5月龄猫卵巢中各级卵泡呈弱表达,在1岁龄、1.5岁龄(未妊娠)、1.5岁龄(妊娠20 d)猫卵巢中强表达。说明HSP90、HSP70、HSP27在猫卵巢不同发育时期都有不同程度的表达,提示其在卵巢卵泡发育、卵母细胞成熟、黄体形成和退化等过程发挥重要作用。     

绵羊卵巢卵泡FoxO1表达模式的研究

本研究旨在探究Fox O1在绵羊卵巢卵泡的表达模式。屠宰场取卵巢获得卵泡,分为小卵泡(直径≤3 mm)、中卵泡(3 mm<直径<5 mm)、大卵泡(直径≥5 mm)3组。利用免疫组化技术对不同直径卵泡的FoxO1进行定位分析,通过机械分离法分离卵泡颗粒细胞,qRT-PCR和Western blotting技术检测FoxO1在小、中、大卵泡颗粒细胞的表达量。结果显示:在绵羊卵泡中,FoxO1表达于颗粒细胞层;中卵泡的FoxO1 mRNA表达量高于小卵泡和大卵泡(P<0.01),小卵泡FoxO1mRNA表达量高于大卵泡(P<0.01);FoxO1蛋白在大卵泡的表达量低于小卵泡和中卵泡(P<0.01),但小卵泡和中卵泡表达量差异不显著。综上表明,FoxO1在绵羊卵泡颗粒细胞层表达,且在大卵泡中的表达量极显著低于小卵泡和中卵泡。     

猪卵巢细胞中凋亡抑制因子cFLIP在卵巢卵泡和黄体中的表达

采用免疫组织化学法检测猪卵巢中细胞凋亡调控蛋白即细胞内FLICE样抑制蛋白（Cellular FLICE-like inhibitory protein,cFLIP）在猪卵巢卵泡和黄体中的表达水平。结果显示,在健康卵泡和功能性黄体中均能够观察到cFLIP的高度表达,而闭锁卵泡和退化黄体中cFLIP的表达显著减弱。结果表明,cFLIP作为一种细胞凋亡抑制因子,参与猪卵巢中的卵巢闭锁和黄体退化。     

牦牛卵巢组织学结构的观察

本试验对牦牛的卵巢结构进行了研究,主要是通过大体解剖和显微结构的观察。通过研究,把牦牛的卵泡分为了原始卵泡、初级卵泡、次级卵泡和囊状卵泡。研究发现,牦牛的卵巢中数量较多的是原始卵泡,它主要分布在皮质的浅表层。原始卵泡是由卵母细胞以及周围单层的扁平卵泡细胞组成。初级卵泡体积增大,透明带开始形成。次级卵泡体积迅速增大,透明带厚度明显增加,卵泡膜增厚。囊状卵泡腔体大,卵母细胞位于卵泡一侧,形成放射冠状的卵丘。     

牦牛StAR基因克隆及其生物信息学与组织表达特性的研究

旨在克隆获得牦牛StAR基因编码序列（CDS）并进行生物信息学分析,探究其mRNA组织表达特性。本研究以屠宰场采集的成年母牦牛心、肝、脾、肺、肾、卵巢、输卵管、子宫组织（n=5）,不同年龄（胎牛、1岁、2岁）牦牛的卵巢（n=3）,不同发情周期（卵泡期、黄体期）的牦牛卵巢（n=3）,黄体期黄牛的卵巢（n=3）及实验室冻存的牦牛颗粒细胞为研究材料。以牦牛黄体期卵巢cDNA为模板,用逆转录PCR克隆StAR基因,并使用MEGA7.0和ExPASy-ProtParam等软件分析其生物信息学特性;采用实时荧光定量PCR技术分析牦牛StAR基因组织表达特性。结果发现,StAR基因CDS区长858 bp,编码285个氨基酸,StAR蛋白总体带正电荷,属于碱性亲水稳定蛋白,无跨膜结构及信号肽,主要存在于细胞质和线粒体; StAR基因具有较高的保守性,符合物种进化规律。牦牛StAR基因在卵巢表达水平最高（P<0.01）,且2岁时卵巢表达水平极显著高于胎牛和1岁龄（P<0.01）,黄体期卵巢表达水平极显著高于卵泡期（P<0.01）;黄体期黄牛卵巢中StAR基因的表达量极显著高于牦牛（P<0.01）;在颗粒细胞的体外培养过程中StAR基因表达量逐渐上升,在培养24 h时达到高峰（P<0.01）,随后显著降低。综上所述,StAR基因序列较为保守,在牦牛卵巢组织中表达最高,且表达水平随年龄与卵巢周期而变化,提示StAR基因可能参与牦牛卵巢及黄体功能相关的繁殖调控。     

RT-PCR技术检测绵羊卵巢内Ghrelin的表达

为了明确Ghrelin在绵羊卵巢有腔卵泡上是否存在表达,本研究利用实时定量RT-PCR技术检测了绵羊卵巢有腔卵泡内的卵母细胞、卵丘细胞和壁层颗粒细胞的Ghrelin蛋白的表达量情况。结果揭示绵羊卵巢有腔卵泡内各类型细胞Ghrelin mRNA的相对表达量大致相同。绵羊卵巢有腔卵泡内各类型细胞Ghrelin蛋白的表达及Ghrelin mRNA的表达模式,尤其是卵母细胞中的表达,揭示这一新型分子在绵羊卵巢上具有潜在的调控作用。