西门塔尔杂种牛UCP3基因多态性与生长性状的关联性分析

宁夏作为全国重要的肉牛养殖地,肩负着向全国提供优质牛肉的责任。西门塔尔(Bos taurus)杂种牛作为主要养殖群体,更是研究的重点。检测西门塔尔杂种牛解偶联蛋白3(uncoupling protein3,UCP3)基因的遗传多态性,分析其与生长性状的相关性,旨在选择出具有生长速度快的基因类型个体,为下一步选育选配工作提供基础资料。本研究采用PCR-SSCP(polymerase chain reaction-single strand conformation polymorphism)方法结合DNA测序检测UCP3基因的多态性,利用DNAMAM、POPGENE1.31、PIC(Polymorphism information content)程序、SAS软件,计算等位基因频率、基因型频率、多态信息含量,对各个基因型与生长性状(体重、体高、体斜长、胸围)进行关联性分析。UCP3基因共检测到5处点突变,为G5465A、C7921G、T8018C、T8162C、A7953G,其中A7953G突变前后不引起氨基酸改变,其他位点突变后分别引起丙氨酸变成苏氨酸,脯氨酸变成精氨酸,半胱氨酸变成精氨酸,酪氨酸变成组氨酸;对其中两个多态位点进行适合性检验,多态位点Hardy-Weinberg不平衡;遗传多样性分析表明,两个位点的PIC值分别为0.372 7、0.370 4,均表现为中度多态;最小二乘均值分析表明,在第3外显子,GA基因型个体各月龄生长性状优于GG基因型,5 465 bp处发生G→A的突变会影响体重、体高和体斜长,尤其在生长后期,增重优势明显;在第6外显子CC基因型各月龄体尺性状优于TC基因型个体,8 162 bp处发生T→C的突变会影响从初生到18月龄的体高、体斜长的增长速度(P0.05);将2个突变位点合并进行分析,组合基因型个体(GACC)体重、体高、体斜长均高于其他基因型组合,且体重性状的组合效应值高于单个多态位点。UCP3基因单个或组合位点不同基因型与西门塔尔杂种牛生长性状之间有着显著、极显著的关联,组合GACC基因型不同月龄体重、体斜长优于单个位点。可以将G5465A、T8162C位点作为宁夏西门塔尔杂种牛生长性状分子辅助标记(marker assisted selection,MAS),同时,初步确定GACC基因型是影响宁夏西门塔尔杂种牛体重性状的最佳组合基因型,这对加快宁夏本地肉牛发展具有重要意义。     

南阳牛Gli3基因多态性及其与生长性状的相关性

Gli3基因是Gli-Kruppel家族中的一员,其参与的Sonic hedgehog信号通路在动物生长发育,特别是早期生长发育过程中有重要作用.利用PCR-SSCP和DNA测序技术研究了187头纯种南阳牛Gli3基因编码区4个位点(E4、E5、E6和E7)的多态性,发现E4和E5位点存在SSCP多态.对不同SSCP带型的对应片段进行了测序分析,共发现3个新的SNP多态位点(T123600C、T123696C和A128688G),其中第123600和第123696两个位点处于连锁状态.E5位点处于Hardy-Weinberg平衡状态,E4位点处于非平衡状态.不同基因型与生长发育性状的相关性分析显示,E4位点上,CC基因型个体的六月龄体重、胸围、坐骨端宽、日增重指标显著大于TT基因型个体(P<0.05),该位点有可能作为南阳牛早期生长性状标记辅助选择的标记之一.     

南阳牛ATP5B基因启动子区域多态性与生长性状的关联性研究

ATP合成酶亚基β(ATP synthase subunit beta,ATP5B)作为ATP合成的重要关键蛋白之一,参与多种生物代谢活动。南阳牛(Bos taurus)是中国本土五大黄牛良种之一,以良好的抗逆性闻名于世,是重要的黄牛种质资源。本研究以南阳牛为研究对象,探究ATP5B基因启动子区域的多态性与南阳牛生长性状相关关系。利用生物信息学技术分析了不同物种ATP5B蛋白功能保守性,检测了南阳牛不同组织ATP5B基因m RNA表达量,并利用DNA测序方法检测南阳牛ATP5B基因启动子区域的多态性,分析了单个多态位点不同基因型与南阳牛生长性状的关联性,随后对具有多态性位点的不同基因型启动子活性做了双荧光素酶活性检测。结果发现牛的ATP5B和猪(Sus scrofa)等物种存在14个相似的motif结构和5个保守性功能域;南阳牛ATP5B基因在内脏组织和肌肉、脂肪组织中广泛表达,其中,在肌肉组织中表达量最高且显著高于其他组织(P0.05),脂肪中次之;在南阳牛ATP5B基因启动子区域检测到了3个SNP位点,分别为g.-428TA,g.-390TC和g.-322CG。将南阳牛生长性状与SNPs进行关联性分析,结果表明g.-428TA位点上TT基因型个体的体重、体高和胸围显著高于AA基因型个体(P0.01或P0.05);g.-390TC位点上TT基因型个体的体高和胸围与CC基因型个体存在极显著性差异(P0.01);g.-322CG位点CC基因型个体的体重和体长显著高于GG基因型个体(P0.01或P0.05)。双荧光素酶活性报告显示,各SNP位点的不同基因型启动子活性略有差别,但未达到显著水平(P0.05)。因此,南阳牛ATP5B基因启动子区域的这3个SNP可考虑作为南阳牛生长性状相关分子标记的候选基因位点,用于南阳牛的分子育种工作,为相关分子育种工作提供参考。     

牛类胰岛素生长因子结合蛋白3基因PCR-SSCP分析

采用PCR-SSCP技术分析了牛类胰岛素生长因子结合蛋白3(IGFBP3)基因在南阳牛、鲁西牛和中国西门塔尔牛3个牛品种中的遗传多态性。结果表明:IGFBP3的第3外显子不存在遗传多态性;第2外显子在3个牛品种中检测到了AA、AB和BB基因型,而且A等位基因为3个牛群体的优势等位基因,分布较高。3个品种中,中国西门塔尔牛AA基因型频率最高,达到0.6615,而鲁西牛和南阳牛则相对较低,分别为0.4043和0.3095。对第2外显子的多态片段测序分析表明:位于IGFBP3基因第8069bp处发生单碱基突变T→C,并导致了苯丙氨酸变为亮氨酸。     

新疆褐牛Toll样受体基因(TLR4)外显子Ⅲ2021位点突变与奶牛体细胞评分的相关性研究

Toll-样受体(toll like receptors,TLRs)可以通过识别病原微生物启动天然免疫并激活适应性免疫.以中国荷斯坦奶牛和新疆褐牛为研究对象,对TLR4基因外显子3进行了序列分析,并对发现的多态性位点进行PCR-RFLP分析,共发现TLR4 E3+1656、TLR4 E3+2021和TLR4 E3+2414三个多态位点.对TLR4E3+1656和TLR4 E3+2021位点x2检验表明:2个品种的突变均处于Hardy-Weinberg平衡状态(P>0.05).运用最小二乘法分析表明,TLR4E3+1656位点的各基因型个体间的体细胞评分(SCS)差异不显著(P>0.05);而TLR4 E3+2021位点中AA与AB基因型SCS水平差异显著(P<0.05),AA与BB基因型SCS水平差异极显著(P<0.01),但AB与BB基因型SCS水平差异不显著(P>0.05).研究结果提示,TLR4E3+2021位点的AA基因型可能与抗乳房炎的抗性有关,A等位基因是乳房炎抗性的有利基因.采用RT-PCR技术检测了不同基因型的新疆褐牛个体中TLRs信号通路下游的部分基因mRNA的表达水平,结果显示,NF-κB1、NF-κB2和IL-1β基因mRNA表达水平与TLR4 E3+2021位点AB和BB两种基因型差异显著(P<0.05),TLR4、IL-10和IL-8基因mRNA表达水平与TLR4 E3+2021位点AB和BB两种基因型差异不显著(P>0.05).     

南阳牛IGF-IR、CAPNⅡ和UCP 3基因多态性与生长性状的相关分析

对南阳牛胰岛素样生长因子-Ⅰ受体(ICF-IR)、钙激活中性蛋白Ⅱ(CAPN Ⅱ)和解偶联蛋白3(UCP 3)3个位点PCR-RFLP与生长性状进行相关分析.在所研究群体中,IGF-IR/Taq Ⅰ多态位点上BB型个体仅检测到2头,IGF-IR/Taq Ⅰ位点等位基因A和CAPN Ⅱ/Hha Ⅰ位点等位基因B为优势等位基因.南阳牛在IGF-IR/Taq Ⅰ和CAPN Ⅱ/Hha Ⅰ位点处于Hardy-Weinberg平衡状态,在UCP 3/Bgl Ⅰ位点偏离HardyWeinberg平衡状态.相关分析表明,IGF-IR/Taq Ⅰ位点不同基因型对南阳牛生长性状影响不显著.CAPN Ⅱ/Hha Ⅰ位点对6月龄的生长性状影响显著(P＜0.05);对不同生长阶段的体协长和胸围影响显著(P＜0.05或P＜0.01).UCP 3/Bgl Ⅰ位点对6月龄的体重、体高和体协长,24月龄体高、体协长和胸围影响显著(P＜0.05).在CAPN Ⅱ/Hha Ⅰ和UCP 3/Bgl Ⅰ位点上,南阳牛AB型个体生长性状表现最好.CAPN Ⅱ/Hha Ⅰ和UCP 3/Bgl Ⅰ多态可以作为南阳牛早期选育的有效标记.     

大黄鱼FST基因SNP筛选及与生长性状相关性分析

为探索FST基因单核苷酸多态性(SNP)与大黄鱼生长性状的相关性,本研究采用直接测序和高分辨率熔解曲线(HRM)法分别进行SNP位点筛查和验证分型。结果共筛查到19个SNP位点,其中2个在外显子1,8个在外显子2,7个在外显子3,外显子4和外显子5各1个,近端启动子区域未筛查到突变。位于外显子4的g.2169AC位点,AA基因型占96.8%,CC基因型占3.2%,多态信息含量为0.0600;位于外显子5的g.2998AG位点,AA基因型占63.2%,AG基因型占30%,GG基因型占6.8%,多态信息含量为0.2828,这2个位点均处于哈代-温伯格平衡状态。相关性分析表明,在g.2169AC位点,CC型个体各个生长性状(体重、体长、全长、体高)均大于AA型个体,但差异不显著(P0.05);g.2998AG位点,AG型个体各性状均值最大,GG型个体最小,但只在全长性状上基因型AG与GG存在显著性差异(P0.05),表明FST基因编码区的突变对大黄鱼的生长性状有一定的影响。本试验结果为大黄鱼育种中体型的选择提供了一定的理论依据。     

奶牛IGFBP-3基因部分序列PCR-SSCP多态性与产奶量和生长性能的相关性

采用PCR-SSCP技术,对荷斯坦奶牛及荷斯坦公牛冻精杂交改良的黄牛后代(回交二代)共105头奶牛胰岛素样生长因子结合蛋白3(IGFBP-3)基因内含子2部分序列和外显子3全部序列进行了多态性研究,分析了该基因与奶牛生产性状的相关性.结果表明:IGFBP-3基因第2内含子共存在2个等位基因3种基因型,A、B基因频率为O.7667和O.2333,AA、AB和BB基因型频率分别为0.6000、O.3333和0.0667.该群体在这一位点上处于Hardy-Weinberg平衡状态,遗传杂合度(H(e))和多态信息含量(PIC)分别为O.3578和为O.2937.测序结果显示,与普通黄牛该基因序列(AF305712)相比,B等位基因在第8 515碱基处发生了G→A的转换,而A等位基因在此处与AF305712序列相同.此外,A、B等位基因在第8 634碱基位置(属第3外显子区)均为c,而普通黄牛在此处为T碱基,该突变为同义突变.最小二乘法分析表明,AA基因型305 d产奶量和12月龄体重极显著高于AB和BB基因型(P<0.01);AA型12月龄体长和体高均极显著高于AB型(P<0.01),而BB型与AB型和AA型差异不显著;不同基因型的胸围和腹嗣差异不显著.     

牛BoLA-DRB3基因第2外显子多态性及其序列分析

BoLA-DRB3基因是牛主要组织相容性复合物(major histocompatibility complex,MHC)基因家族中的Ⅱ类基因,它是该基因家族中最主要的功能基因,所编码的MHC抗原与免疫应答和抗病性密切相关。其第2外显子编码抗原的主要功能区。实验采用PCR-RFLP方法对鲁西牛、南阳牛和晋南牛3个群体的BoLA-DRB3基因第2外显子扩增产物进行多态性分析,检测到A、B和C3个等位基因,出现6种基因型。χ2适合性检验结果表明,鲁西牛和晋南牛在HaeⅢ酶切位点均达到了Hardy-Weinberg平衡状态(P>0.05),而南阳牛未达到Hardy-Weinberg平衡状态(P<0.01)。结合测序,结果显示在BoLA-DRB3基因第2外显子的第154、155、156和157位的碱基产生突变使得产生HaeⅢ酶切多态。序列比对后发现有13.70%的核苷酸发生突变,相对应有14.61%的氨基酸发生了替代。     

甘肃高山细毛羊瘦素基因Leptin第3外显子多态性与生长速度相关性分析

瘦素(Leptin)是由肥胖基因(obese)编码,由脂肪细胞分泌的一种多肽激素,是研究牛、羊生长发育和肉质等性状的重要候选基因。为探讨Leptin基因与绵羊生长速度的相关性,本研究利用单链构象多态性(single strand conformation polymorphism,SSCP)分析技术对甘肃高山细毛羊(Ovis aries)Leptin基因第3外显子进行遗传多样性检测,并对不同基因型及等位基因与生长速度的相关性进行分析。结果表明,在甘肃高山细毛羊Leptin基因第3外显子上共检测到4个(A~D)等位基因和2个SNPs(G271A和G433A),构成4个基因型(AA、AB、AC和AD),其中2个(B和D)等位基因和1个SNPs(G433A)为首次发现,等位基因A和基因型AC频率分别为0.6586和0.4095,为优势等位基因和基因型;与生长速度相关性分析发现,基因型AC对1月龄、2月龄和4月龄个体体重影响显著(P0.05)高于同等阶段其他基因型个体,等位基因C与1月龄、2月龄、4月龄体重和平均日增重关联性均显著(P0.05)。本研究显示,甘肃高山细毛羊Leptin基因第3外显子遗传多样性丰富,可以通过选留携带等位基因C和基因型AC的个体提高甘肃高山细毛羊的生长速度,研究结果也为绵羊Leptin基因的遗传特征研究提供基础数据。     

小鼠生殖细胞特异基因Oct4启动子片段克隆及报告载体构建

本研究通过PCR方法从小鼠(Mus musculus)基因组中扩增出Oct4启动子的CR4区和CR1区,将其克隆到真核报告载体pEGFP-1,构建了携带Dct4启动子片段的小鼠生殖细胞特异性报告载体CR1,4-pEGFP-1.用该载体转染多种细胞,在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白(EGFP)在细胞中的表达情况,同时以半定量RT-PCR检测转染细胞中Oct4及其它生殖细胞特异性基因的转录情况.结果显示,GFP在小鼠胚胎干细胞、小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)和C2C12细胞中均不表达,而在P19细胞和睾丸细胞中表达.RT-PCR结果显示,Oct4在P19、睾丸细胞和生殖干细胞中特异性转录.这表明所构建的绿色荧光蛋白报告载体只在生殖细胞和多能生殖干细胞中内表达,该质粒可作为示踪生殖细胞的工具,同时也可以作为生殖干细胞多能性状态的一个监测标记.     

尖孢镰刀菌古巴专化型4号生理小种中FoGAS1基因的克隆与序列分析

采用PCR和RT-PCR的方法,从尖孢镰刀菌古巴专化型4号生理小种中克隆得到了FoGAS1基因的DNA及cDNA序列,并运用生物信息学的方法对该基因所编码的氨基酸序列进行分析,预测其编码蛋白质的结构和功能。结果表明,FoGAS1基因全长1 672 bp,其中开放阅读框全长1 623 bp,编码含有540个氨基酸残基的蛋白质,该蛋白分子量为58398.1,等电点pI=4.83,为性质稳定的亲水性蛋白。FoGAS1蛋白为跨膜蛋白,含有22个丝氨酸磷酸化位点,2个苏氨酸磷酸化位点,8个酪氨酸磷酸化位点。该蛋白在C端有一个信号肽结构,为一种分泌蛋白。通过系统进化树分析,该蛋白在不同种属镰刀菌中高度保守。     

CRISPR/Cas9靶向敲除番茄SNAC4/9突变体的构建、鉴定及分析

NAC转录因子参与植物生长发育、果实色素积累、细胞壁形态形成和植株衰老等过程。为系统研究SNAC4(SlNAC48,基因ID:101247735)和SNAC9(SlNAC19,基因ID:101248665)在番茄成熟衰老进程中的精准功能,本试验设计SNAC4/9敲除靶点,通过重叠聚合酶链式反应（overlapping PCR）法构建单引导RNA(sgRNA)表达盒,采用金门分子克隆（golden gate）方法将单个或多个sgRNA表达盒组装至pYLCRISPR/Cas9载体。PCR和测序结果表明,SNAC4/9敲除载体构建成功,通过农杆菌转化法将编码Cas9蛋白和sgRNA的基因导入Micro-Tom番茄细胞,对阳性苗进行靶点和脱靶位点检测,结果表明番茄成功突变且未脱靶,通过鉴定T1代突变体进一步证明,CRISPR/Cas9基因编辑番茄的靶点在代际之间可以稳定遗传。与野生型相比,SNAC4/9敲除果实色素积累减少,成熟延迟,表明SNAC4/9在番茄果实成熟中发挥重要作用。本研究为进一步探究SNAC4/9调控番茄果实色素代谢和胞壁代谢机制提供了遗传材料和试验基础。     

家兔骨形态发生蛋白4基因(BMP4)启动子甲基化与杂种优势的关系

骨形态发生蛋白4(BMP4)对动物骨组织的生长及动物机体生长发育起着重要的影响。本研究通过甲基化特异性PCR(methylation-specific PCR,MSP)方法检测4个家兔群体共80只家兔(新西兰兔(NewZealand Oryctolagus cuniculus)、福建黄兔(Fujian Yellow O.cuniculus)以及这两个品种正反交2个群体各20只)BMP4基因启动子CpG岛甲基化的状态,并结合屠体性状进行比对分析,为探索能否将BMP4基因启动子甲基化作为分子标记用于辅助育种,并阐明启动子甲基化与杂种优势的关系。结果显示,2个杂交群体的屠宰性能均高于福建黄兔与新西兰白兔的均值,虽低于新西兰兔但差异不显著(P>0.05),与福建黄兔之间差异极显著(P<0.01);群体内不同性别间甲基化水平与屠体性状均无明显差异(P>0.05),新西兰兔甲基化水平与福建黄兔、福建黄兔×新西兰兔群体间差异显著(P<0.05),其他各群体之间差异不显著(P>0.05);各群体不同甲基化水平下屠宰性状存在差异,但屠宰性状的测定结果不能与甲基化水平完全匹配,推测可能与特异位点的甲基化状态有关。本研究为能否将BMP4基因启动子甲基化作为分子标记以及阐明启动子甲基化与杂种优势的关系提供了一定参考。     

中国荷斯坦牛TLR1基因SNPs快速筛查及蛋白功能预测

为探究中国荷斯坦牛Toll样受体1(TLR₁)基因与中国荷斯坦牛乳房炎抗性的关联性,以中国荷斯坦牛为试验对象,构建DNA混合池,采用PCR扩增和直接测序法对中国荷斯坦牛TLR₁基因进行单核苷酸多态性(SNP)检测,从而筛选出对中国荷斯坦牛免疫方面有显著影响的SNPs位点,同时应用在线软件对中国荷斯坦牛TLR₁基因编码的蛋白质进行功能预测。结果表明,中国荷斯坦牛TLR₁基因编码727个氨基酸,组成了一种不稳定的水溶性蛋白,蛋白质二、三级结构均以α-螺旋为主;PCR扩增后,在扩增片段处共发现8个SNPs位点,分别为A⁶¹T-TLR₁、C⁶³²A-TLR₁、C¹⁴⁰⁸T-TLR₁、C¹⁴⁵¹T-TLR₁、A¹⁴⁶¹G-TLR₁、A¹⁴⁷⁵C-TLR₁、G¹⁵⁵⁰A-TLR₁、G¹⁵⁹⁶A-TLR₁,其中A⁶¹T-TLR₁、C⁶³²A-TLR₁、C¹⁴⁰⁸T-TLR₁、A¹⁴⁶¹G-TLR₁、G¹⁵⁹⁶A-TLR₁属错义突变,分别由原来的赖氨酸(Lys)、苯丙氨酸(Phe)、丙氨酸(Ala)、异亮氨酸(Ile)、缬氨酸(Val)突变为甲硫氨酸(Met)、亮氨酸(Leu)、缬氨酸(Val)、缬氨酸(Val)、异亮氨酸(Ile),SNPs位点的等位基因频率在突变前后均存在差异。DNA池结合直接测序技术检测到TLR₁基因8个SNPs位点,可作为中国荷斯坦牛乳房炎的遗传标记进行深入研究;蛋白质功能预测结果表明,有多种与免疫相关的因子几率较高。本研究结果为中国荷斯坦牛在分子领域的抗病育种提供了理论依据。     

Effects of long-term feeding of chitosan on postprandial lipid responses and lipid metabolism in a high-sucrose-diet-impaired glucose-tolerant rat model

This study was designed to investigate the effects of long-term feeding of chitosan on postprandial lipid response and lipid metabolism in a high-sucrose (HS)-diet-impaired glucose-tolerant rat model. As the results, HS-diet-fed rats supplemented with 5 and 7% chitosan in diets for 9 weeks had lower postprandial plasma total cholesterol (TC) levels, but 7% chitosan in the diet had higher postprandial plasma triglyceride (TG) and TG-rich lipoprotein TG levels. Supplementation of chitosan significantly decreased the postprandial ratio of apolipoprotein B (apoB)48/apoB100 in TG-rich lipoprotein fractions of HS-diet-fed rats. Long-term supplementation of 5 and 7% chitosan in diets for 16 weeks had lower plasma TC, low-density lipoprotein cholesterol (LDL-C) + very low density lipoprotein cholesterol (VLDL-C), TC/high-density lipoprotein (HDL-C) ratio, leptin, and tumor necrosis factor-α (TNF-α) levels in HS-diet-fed rats. Moreover, it was noticed that the VLDL receptor (VLDLR) protein expression in skeletal muscles of HS-diet-fed rats was significantly decreased, which could be significantly reversed by supplementation of 5 and 7% chitosan. Rats supplemented with 7% chitosan in the diet significantly elevated the lipolysis rate and decreased the accumulation of TG in epididymal fat pads of HS-diet-fed rats. The plasma angiopoietin-like 4 (ANGPTL4) protein expression was not affected in HS-diet-fed rats, but it was significantly increased in 7% chitosan-supplemented HS-diet-fed rats. Taken together, these results indicate that supplementation of chitosan in the diet can improve the impairment of lipid metabolism in a HS-diet-fed rat model, but long-term high-dose chitosan feeding may enhance postprandial plasma TG and TG-rich lipoprotein TG levels in HS-diet-fed rats through an ANGPTL4-regulated pathway.     

荷斯坦牛DRA基因多态性及序列特征分析

为探讨荷斯坦牛DRA基因的多态性及序列特征,本研究采用基因组DNA混合池扩增并直接测序的方法对荷斯坦牛DRA基因编码区进行多态性分析,同时利用生物信息学方法预测DRA基因的理化特性及其编码蛋白的高级结构。结果表明,荷斯坦牛DRA基因编码区上有4个碱基突变,包含1个错义突变和3个同义突变。DRA基因共编码253个氨基酸,编码产物是一种稳定的不可溶蛋白,具有15个潜在的磷酸化位点,二级结构为混合型,三级结构由α-螺旋、β-折叠、β-转角和无规则卷曲组成。本研究结果为荷斯坦牛的疾病相关基因筛选和抗病分子育种提供了一定的理论依据。     

鸭脂肪型脂肪酸结合蛋白基因（A-FABP）内含子1序列多态性分析

根据鸭A-FABPmRNA序列和鸡A-FABP基因组序列设计1对引物扩增出鸭脂肪型脂肪酸结合蛋白基因(A-FABP)内含子1序列(GenBank登录号:FJ536257),并根据扩增产物设计4对引物,利用PCR-SSCP对鸭A-FABP基因部分序列进行SNP检测,且对不同鸭群体进行群体遗传学分析.结果表明:克隆序列包含鸭A-FABP基因外显子1、2部分序列和完整的内含子1序列,与鸡A-FABP基因内含子1同源性为75.1%;经SSCP检测,发现引物P1扩增片段有3处碱基突变,引物P3扩增片段有6处碱基突变,这些突变分别产生了3种和8种基因型.在P1位点樱桃谷鸭和苏牧麻鸭偏离了Hardy-Weinberg平衡(P0.05),在P3位点3个群体均符合Hardy-Weinberg平衡(P＞0.05).同时,这些基因型在不同鸭群体中分布存在显著或极显著差异(P<0.05或P<0.01).群体遗传学分析结果显示A-FABP基因在不同鸭群体中具有丰富的单核苷酸多态性,可以进一步作为候选基因来分析其与脂肪性状相关性.     

阴沟肠杆菌UW4菌株ACC脱氨酶基因的克隆、序列分析及原核表达

从阴沟肠杆菌(Enterobactercloacae)UW4菌株提取细菌总DNA,根据已报道的阴沟肠杆菌ACC脱氨酶(1-aminocy-clopropane-1-carboxylicaciddeaminase)基因序列设计简并引物,通过PCR扩增获得1条约1.02kb特异片段,把该片段连接到pGEM-Tvector上进行测序。序列分析结果表明,该基因编码区全长为1017bp,共编码338个氨基酸残基,与报道的序列相比仅存在8个核苷酸的差异,同源性达99.1%;将其翻译成氨基酸序列后发现,仅引起了4个氨基酸残基的变化,氨基酸同源性为98.2%。利用DNASIS软件对蛋白质二级结构进行分析比较,发现其蛋白质二级结构及其单元与报道的序列完全一致。将其插入原核表达载体pET-28b进行诱导表达,发现其表达蛋白在分子量约39kD处比对照多出一明显条带;经Westernblot分析检测,发现此带即为His-ACDS融合蛋白。     

家蚕真核细胞翻译起始因子(BmeIF4E)基因的克隆、表达及功能分析

本研究从自建的家蚕(Bombyx mori)蛹期cDNA文库中筛选到一条cDNA序列,发现其在序列和结构上与其他物种的真核细胞翻译起始因子钮基因(BmeIF4E)具有较高的相似性,推测可能是家蚕eIF4E基因,将该序列命名为BmeIF4E,GenBank登录号为DN443192.为研究BmeIF4E的生物学功能,将该基因插入原核表达载体pET-28a(+)中,构建重组质粒pET-28a(+)-BmeIF4E,转化感受态细胞BL21(DE3),IPTG诱导表达并纯化该重组蛋白,制备多克隆抗体.利用家蚕Bm5细胞进行亚细胞定位研究结果表明,BmeIF4E既存在于细胞质中也存在于细胞核中.荧光定量PCR和Westem blot分析结果表明,在不同组织及发育时期该基因的表达有差异,在各组织中BmeIF4E表达量从高到底依次是马氏管、表皮、脂肪体、气管、卵巢、中肠、头和丝腺;在卵、幼虫、蛹和蛾4个发育时期中,蛾中的表达量最高,其次是蛹,再次是五龄幼虫,而在卵中表达量较低.以该基因的ORF为模板体外转录dsRNA,脂质体法转染Bm5细胞,72 h后提取细胞总蛋白作Western blot检测RNA干扰情况,发现BmeIF4E基因被干扰后,总蛋白中目的蛋白含量明显低于阴性对照组.MTT法检测结果表明,干扰后细胞活力也明显下降.研究结果提示,BmeIF4E作为一种重要的管家基因,在家蚕的整个生命周期中均有表达,起着十分重要的作用.