猪羊水干细胞的分离培养及向脂肪细胞诱导分化

羊水干细胞是一种存在于胎儿羊水中Oct4阳性的多能性干细胞.该细胞具有增殖能力强、分化潜能高和免疫原性低等特点,在生物学和医学研究上具有广泛的应用前景.本实验从不同胎龄的猪胎儿标本中分离猪羊水干细胞,并通过诱导其向脂肪细胞分化来检测其多向分化潜能.结果表明,从胎龄为30～70 d的猪胎儿羊水中分离出的羊水干细胞贴壁率高,增殖能力强,活性好,并建立了两株猪羊水干细胞系.经流式细胞仪和RT-PCR检测,猪羊水干细胞表达CD117、CD44、CD166和CD90表面抗原,不表达CD45、CD54和CD34;稳定表达Oct4、Nanog、C-myc和HLA-abc干细胞特异标志基因;转染报告基因载体pOct4-EGFP和pNanog-EGFP后表达绿色荧光;此外,猪羊水干细胞还能够在体外诱导分化为脂肪细胞.研究结果为大动物羊水干细胞的研究提供了可借鉴的材料.     

优化的小鼠STO细胞系重编程多功能干细胞的建立

研究鼠胚成纤维细胞系STO (SIM-6-thiogunanie-oualiain)诱导为多功能干细胞(induced pluripotent stem cells),(STO-iPSCs).通过磷酸钙法将连接有Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc 4个转录因子的慢病毒载体FUW-OSKM转染293FT细胞包装病毒,然后用病毒感染STO细胞,以干细胞培养条件培养.挑取诱导15d的克隆并在有饲养层和无饲养层的培养体系中培养.对获取的STO-iPSCs进行生物学特性分析,具有典型胚胎干细胞的形态特征,碱性磷酸酶染色呈阳性;qPCR结果表明,表达很高的原癌基因Nanog和Oct4 mRNAs;免疫细胞化学表明,表达胚胎干细胞特异性标志Nanog和Oct4,并且能够体外诱导分化为神经细胞.实验获得了STO-iPSCs,建立了STO-iPSCs无饲养层培养体系.     

猪诱导多能干细胞多能性相关基因启动子区域甲基化检测

DNA甲基化是一种十分重要的表观遗传修饰,与转座元件沉默、基因组印记以及X染色体失活等多种生物学过程相关。胚胎特异性转录因子的表达可以将已经分化的小鼠(Mus musculus)成纤维细胞重编程为诱导多能干细胞(iPSCs)。由于在重编程过程中还伴随着一系列的表观遗传修饰变化,iPSCs可作为研究表观遗传特点的有利工具,用来研究表观遗传修饰的相互作用及其动态学过程。本研究中,从35 d的猪(Sus scrofa)胎儿分离出胎儿成纤维细胞(PFF),使用经典的4因子组合,即Oct4、Sox2、Klf4和cMyc将PFF重编程为iPSCs,并进行了多能标记的染色,结果表明,所得到的克隆呈现OCT4、SOX2、NANOG和SSEA1阳性结果。采用亚硫酸氢盐测序法对内源性多能性相关基因Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc的启动子区域甲基化进行了检测,发现其启动子甲基化程度很低,表明体细胞重编程为iPSCs的过程伴随着多能基因启动子甲基化程度的降低,为理解iPS重编程中多能性相关基因的DNA去甲基化过程和了解控制多能性相关基因的表观遗传调节提供基础。     

ES-D3细胞nanog基因干扰载体的构建 及其干涉效果*

选择ES细胞nanog基因中4个区域合成寡聚核苷酸,构建了4个含有小鼠U6启动子的siRNA（小分子干涉RNA）表达载体并瞬时转染小鼠ES-D3细胞.半定量RT-PCR分析显示,所构建的4个siRNA表达载体中有3个可以在细胞内转录出siRNA或shRNA（短发夹RNA）,诱发RNA干涉（RNAinterference,RNAi）,能显著抑制目的基因nanog的表达;同时发现,干扰的ES-D3细胞生长48 h后,集落形态与未干扰细胞相比差别不大,但隆起不如后者明显,形态也不如后者规则,生长速度也较慢,AKP染色阳性,与未转染细胞相比没有差别.     

cNanog和cPouV表达下调对鸡胚胎干细胞(cESCs)多能性的影响

利用稳定干扰载体pSuper-cNanog和pSuper-cPouV转染鸡(Gallus gallus)胚胎干细胞(chicken embryonic stem cells,cESCs),观察多能性相关基因cNanog和cPouV下调后cESCs的增殖特性和多能性标记的改变。Real-time PCR检测分析结果显示,cNanog和cPouV两基因的表达量从48 h开始出现显著下降趋势,并随着转染筛选时间的延长而呈现持续显著下降趋势,96 h可达65%以上(P0.05)。下调cNanog和cPouV基因的表达后,cESCs呈现分化形态,细胞增殖速度减慢,隆起逐渐不明显,边缘不整齐。待筛选后培养至96 h时,干扰cNanog基因的细胞多能性标记碱性磷酸酶(alkline phosphatase,AKP)和阶段特异性胚胎抗原1(stage-specific embryonic antigen-1,SSEA-1)均不表达,而干扰cPouV基因的细胞中则仍有部分表达。将下调cPouV基因的cESCs再次用pSuper-cNanog转染,培养48 h多能性标记AKP和SSEA-1均不表达。结果说明,cNanog和cPouV基因在维持鸡胚胎干细胞多能性和自我更新中起重要作用,且cNanog基因占主导地位。本研究为研究家禽胚胎发育的分子机制以及家禽胚胎干细胞体外培养时自我更新和多能性维持的分子机制提供理论依据。     

L-Wnt3a细胞用于制备胚胎干细胞饲养层的研究

小鼠胚胎成纤维细胞(mouse embryonic fibroblasts,MEFs)作为胚胎干细胞培养的饲养层细胞,受到细胞代次等因素限制,需要长期反复制备,消耗大量的实验动物。寻找可替代小鼠胚胎成纤维细胞支持干细胞生长增殖的稳定细胞系,对于降低干细胞的培养成本和减少工作量具有重要意义。L-Wnt3a细胞是一个能够稳定向细胞外分泌Wnt3A蛋白的永生细胞系,目前尚不清楚其是否支持小鼠胚胎干细胞的培养。本研究探讨L-Wnt3a作为饲养层细胞对于小鼠(Mus musculus)胚胎干细胞系的建立以及该细胞条件培养液对无饲养层培养小鼠胚胎干细胞的影响。实验结果表明,丝裂霉素C浓度为10μg/mL,作用4 h时,可显著抑制L-Wnt3a细胞的体外生长而不影响细胞的活力。用该细胞制备饲养层,原代分离、培养小鼠胚胎干细胞,成功建立小鼠胚胎干细胞系。利用L-Wnt3a细胞制备条件培养液进行胚胎干细胞的培养,结果显示,L-Wnt3a条件培养液可支持小鼠胚胎干细胞在无饲养层条件下自我增殖,该条件下培养的胚胎干细胞表达碱性磷酸酶、Oct4、Sox2、Nanog、E-cadherin(E-CAD)和SSEA-1多能性因子,并能够在体内、外分化为3个胚层,形成嵌合体后代。L-Wnt3a细胞作为饲养层细胞,能够成功分离获得小鼠胚胎干细胞,可以避免小鼠胚胎成纤维细胞作为饲养层细胞存在的代数限制、制备繁琐等问题;并且LWnt3a条件培养液可以在无饲养层条件下维持小鼠胚胎干细胞的自我更新,能够在一定程度上有效避免饲养层细胞对胚胎干细胞造成的不利影响。     

梅岭土鸡原始生殖细胞的生物学特性

作为精原细胞和卵原细胞的祖细胞,由于其全能性的特点可作为体外胚胎发育研究的良好模型,而禽类独特的生理和发育特点使得其原始生殖细胞(PGCs)在转基因研究中有着巨大价值。本研究通过对孵化5.5d的梅岭土鸡(Gallus domesticus)胚生殖腺中分离得到的PGCs,接种于24孔培养板在温度37℃、95%空气和5%CO2的培养箱中进行体外培养;借助组织化学及免疫组织化学染色对PAS(高碘酸希夫氏染色)、AKP(碱性磷酸酶染色)、SSEA-1(胚胎阶段特异性表面抗原-1)以及TERT(端粒酶反转录酶)进行了鉴定;采用荧光定量PCR技术对PGCs阶段特异性表达基因Cvh(鸡Vasa基因同系物)、Cdh(鸡死端同系物)、Dazl(类无精症缺失)和干细胞多能性相关基因PouⅤ(POU结构域Ⅴ类转录因子1)、Nanog(nanog同源异型盒)、Sox-2(性别决定区Y盒2)基因表达进行了分析;利用脂质体介导法,将绿色荧光蛋白(pEGFP-N3)基因导入鸡PGCs细胞,结果表明,PGCs集落有典型的鸟巢状结构,且PAS、AKP、SSEA-1以及TERT染色阳性;PGCs阶段特异性表达基因Cvh、Cdh、Dazl和干细胞多能性相关基因PouV、Nanog和Sox-2在鸡PGCs中均远远高于在鸡成纤维细胞(CEF)中的表达;转染24h后,绿色荧光蛋白均匀的充满细胞质和细胞核,转染效率最高为16%,研究结果为禽类PGCs分化过程中基因调控及基因标记、转基因动物克隆等技术提供了良好基础。     

鸡FGF8基因RNA干扰载体的构建及其对PGCs形成的影响

原始生殖细胞(primordial germ cells,PGCs)作为精细胞的祖细胞,广泛用于研究精子的发生。成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor,FGF)家族对PGCs的形成至关重要。为了探究成纤维生长因子8(FGF8)的具体功能,本研究通过构建家鸡(Gallus domesticus)FGF8的短发夹RNA(short hairpin RNA,sh RNA)慢病毒干扰载体,获得稳定低表达FGF8的鸡胚胎干细胞株,并进一步研究FGF8在鸡胚胎干细胞(embryonic stem cells,ESCs)向PGCs分化中的功能。根据家鸡FGF8的转录本设计3个RNA干扰靶点,连接到p GMVL-SC5干扰载体,瞬时转染鸡胚成纤维细胞DF1。以q RT-PCR技术检测各靶点对FGF8的干扰效率,将干扰效率最佳的sh RNA载体进行慢病毒包装。在以慢病毒敲低FGF8的ESCs中进行视黄酸(retinoic acid,RA)诱导,观察各组细胞形态变化,收集不同时间的各组细胞,利用q RT-PCR、间接免疫荧光以及流式细胞术等方法,分析检测生殖相关标记基因的表达变化和PGCs形成效率。结果表明,FGF8慢病毒干扰载体构建成功,分别命名为sh FGF8-1、sh FGF8-2、sh FGF8-3,其中sh FGF8-2干扰效率最佳。将sh FGF8-2进行慢病毒包装,获得滴度为5×10~(8 )TU/m L、干扰效率为(70±4.31)%的慢病毒载体。对于FGF8表达抑制的ESCs,体外RA诱导4 d后,PGC样细胞显著增加,ESC标记基因Nanog表达极显著下调(P0.01),PGC标记基因Cvh、C-kit表达极显著上调(P0.01)。此外,免疫荧光及流式细胞术分析结果也进一步证实,诱导4 d后与对照组比较,FGF8低表达使CVH~+PGCs比例显著增加(P0.01)。本研究成功构建了稳定转染鸡胚胎干细胞的FGF8特异性慢病毒载体,并证实FGF8在体外参与调控PGCs的形成。     

小鼠Gli-similar-1(Glis1)基因新转录本功能分析

Gli-similar-1(Glis1)是一种在小鼠卵母细胞和受精卵一、二细胞期高表达蛋白,在小鼠胚胎发育中起着重要的作用。本实验以小鼠(Mus musculus)肾为材料,克隆小鼠 Glis1 基因,并构建与绿色荧光蛋白融合表达的真核表达载体 pEGFP-C1-Glis1。研究了 Glis1 蛋白的表达和亚细胞定位,并利用 qPCR 检测过表达 Glis1 对 Oct4、Sox2、c-Myc、N-Myc、Klf4、Nanog、Nrgn 和 Tspan18 等基因表达的影响。结果表明,从小鼠肾中成功克隆到 Glis1 的一个新转录本(GenBank 登录号: JQ043365),其第三个核定位信号缺失 4 个氨基酸,C 端结构域缺失 124 个氨基酸,包括富含脯氨酸结构域全部氨基酸序列。Glis1 定位于细胞核,过表达能够显著上调Tspan18。研究结果表明,Glis1 新转录本与现有转录本亚细胞定位结果一致,其在小鼠胚胎发育和小鼠成纤维细胞重编程过程中可能发挥不同的功能。     

利用转基因小鼠表达法氏囊病毒A片段的研究

摘要： 将法氏囊病毒(IBDV)A片段定向连于乳腺特异性表达载体p7GMB53, 用于转基因实验, 用PCR和Southern杂交对阳性小鼠及其后代进行检测。 共注射了879枚小鼠受精卵, 移植受体26只, 产仔39只。 经PCR检测阳性6只（其中2只死胎）,Southern杂交检测确定了2只阳性小鼠(1公1母)。外源基因整合的拷贝数分别为3拷贝（公）和9拷贝（母）。将两只阳性小鼠进行了传代,实验表明二者分别为种系纯合体及种系嵌合体。 ELISA 及Western blot检测认为阳性母鼠表达了IBDV 衣壳蛋白。初步验证了先前构建的含基质附着区序列（MARs）的乳腺表达载体能克服转基因的位置效应,实现转入目的基因的表达,提高乳腺反应器的制备效率。     

水牛转录因子Klf4基因编码区序列克隆及在真核细胞中表达研究

Krtippel样因子4依脾）在调控细胞增殖、分化和胚胎发育中有重要作用,也是生产诱导多能干细胞（iPSC）重要的转录因子之一。本研究对水牛K牌进行克隆和表达研究,为生产水牛iPSC和研究其在体细胞重编程中的机理奠定基础。采用RT—PCR克隆并分析水牛K牌编码区序YIJ（CDS）;mRNA水平和蛋白水平检测K牌在水牛胎儿成纤维细胞（BFF）和胃上皮细胞（BSEC）中的表达情况;构建表达水牛K孵的逆转录病毒载体（pMX—Klf4）、病毒感染BFF、免疫荧光技术分析外源K脾在BFF中的表达情况。结果表明：水牛CDS全长1434bp,氨基酸序列与牛、猪、人和鼠相应氨基酸序列的相似性分别为99％、97％、92％$N92％,蛋白结构保守;内源Klf4在BFF和BSEC中都有表达,pMX介导的外源K脾能在BFF中表达。     

大豆丛枝菌根共生结构和多聚磷累积双定位方法

【目的】多聚磷是丛枝菌根内磷的主要贮存形式,定性、定量观察多聚磷对于解析菌根中磷代谢具有重要意义。随着植物体内越来越多的参与菌根真菌与寄主植物之间营养交换过程的基因被鉴定,迫切需要进一步提高根内菌根共生结构和多聚磷累积的染色和定位分析技术。【方法】本研究利用丛枝菌根真菌Glomus mosseae侵染的大豆植株,采集新鲜根样制片,一部分薄根片利用低浓度荧光染料麦胚凝集素,室温染色30 min,在波长488 nm的蓝光激发下使用荧光显微镜观察拍照;另一部分薄根片利用荧光染料4’,6-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐(DAPI)进行染色,在波长405 nm紫外光激发下观察并拍照;进一步取新鲜制备的薄根片,先后用以上两种荧光染料进行染色,分别在波长405 nm和488 nm的激发光下观察并拍照,完成了菌根共生结构和多聚磷的共定位。【结果】1)使用荧光染料麦胚凝集素,大豆丛枝菌根真菌侵染结构的荧光标记活性染色法,可以清晰地检测到大豆丛枝菌根中所有的共生结构,包括丛枝,泡囊和根内菌丝等。2)在丛枝菌根真菌侵染的根中,各种共生结构都呈现出黄色荧光,为DAPI与多聚磷结合在紫外光激发下的呈色。根段中部分细胞内的蓝白色斑点为DAPI与细胞核中DNA结合的显色结果。在含有成熟丛枝结构的细胞中,也可观察到大部分丛枝呈蓝白色,主要是丛枝膜质结构的呈色。因此,利用荧光染料4’,6-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐染色法定位多聚磷,能很好地区分多聚磷酸盐、DNA和膜质。3)在以上研究的基础上,通过荧光光路的切换,可以同时观察到菌根共生结构和多聚磷的共定位。处于发育阶段的整个丛枝中多聚磷累积的亮黄色清晰可见。在成熟的丛枝中,由于膜质结构发达,对累积在丛枝结构中的多聚磷的染色观察产生了一定影响,导致仅仅局部的多聚磷累积清晰可见。【结论】本研究建立的大豆菌根共生结构与多聚磷累积的双定位分析系统,能够直观观察植物与丛枝菌根真菌的养分交换,清晰地对丛枝菌根共生结构中多聚磷的累积进行定位分析,可作为从组织和细胞水平研究菌根共生体的重要技术手段。     

甘蓝型油菜BnaLPAT4基因功能研究

为了验证油菜溶血磷脂酸酰基转移酶4(BnaLPAT4)在油脂合成中的作用,本试验通过同源克隆法从甘蓝型油菜湘油15号中获得2条全长分别为1 143、1 140 bp的BnaLPAT4基因,分别命名为BnaLPAT4-1和BnaLPAT4-2,构建pGAL::BnaLPAT4-1和pGAL::BnaLPAT4-2载体转化酵母INVSC,通过气相色谱法检测酵母中的脂肪酸组分,并以植物表达载体pBI121为骨架,构建pNapin::BnaLPAT4-1和pNapin::BnaLPAT4-2载体并通过农杆菌介导法转染拟南芥,获得转基因苗后检测拟南芥转基因种子脂肪酸组分。结果表明,酵母菌转化子与空转化子之间的脂肪酸组分发生显著变化,其中BnaLPAT4-1转化子饱和脂肪酸的含量达66.88%,是空转化子的2.61倍,酵母转化子生成了亚麻酸和花生酸;BnaLPAT4-2转化子中C16脂肪酸的含量较对照提高22.40个百分点。BnaLPAT4在拟南芥种子中特异表达,花生烯酸含量较野生哥伦比亚型提高4.7个百分点,且拟南芥转基因材料种子中的芥酸和花生三烯酸的含量为0。本研究结果为验证BnaLPAT4基因的生物学功能和油脂成分改良提供了理论参考。     

水稻卷窄叶突变相关基因OsCSLD4的RNAi研究及表达分析

在图位克隆获得目的基因OsCSLD4的基础上,利用Invitrogen公司的Gateway系统将500bp的OsCSLD4基因cDNA编码序列以反向互补的方式插入pANDA35HK,构建了水稻卷窄叶突变相关基因OsCSLD4的干涉载体pANDAH05。利用农杆菌转化法将干涉载体pANDAH05及对照空载体pANDA35HK分别转化突变体原始亲本日本晴幼胚。转基因阳性植株表型观察结果显示:干涉载体pANDAH05转化日本晴幼胚后,T0代植株出现了类似于突变体1ah137的表型,叶片明显变窄,卷曲程度增加,株高降低;对照空载体pANDA35HK转化日本晴幼胚后,T0代植株仍保持野生型表型;Real-timePCR检测结果显示:日本晴转干涉载体pANDAH05后,目的基因表达量明显降低,干涉强度不同目的基因表达量降低程度不同,研究结果表明目的基因OsCSLD4在水稻叶片形态发育过程中起着非常重要的作用。     

家蚕胞质肌动蛋白基因启动子的克隆及piggyBac转座子表达载体的构建

摘要: 利用PCR方法从家蚕（Bombyx mori）总DNA中克隆到细胞质肌动蛋白基因（cytoplasmic actin）启动子片段，序列分析表明，该片段中含有典型的组成型表达的细胞质肌动蛋白基因A3（BmA3）调控序列：SRE元件（serum response element）和ActE1元件(active element 1)。该序列的核苷酸序列与来自欧洲的一个家蚕品种的序列同源性为94%。通过多次重组，将A3启动子片段(不含信号肽序列)与转座子 piggyBac的转座酶编码区融合构建成辅助质粒；将其(含信号肽序列和部分编码区)与报告基因多管水母绿色荧光蛋白基因gfp融合，插入到人工合成的转座子piggyBac两反向重复末端序列之间，进而构建成基于转座子piggyBac的转基因载体。研究中构建的转座子转基因载体仅6.4 kb，并在两反向重复末端序列之间设计了1个多克隆位点区，便于目的基因的插入。     

用猪骨髓间充质干细胞为供体生产猪的转基因胚胎

以pEGFP-N 1质粒,通过电转染的方法转染了猪骨髓间充质干细胞,经过G 418筛选,获得了阳性细胞克隆。以转染的猪骨髓间充质干细胞与体外成熟(in v itro m aturation,IVM)的卵母细胞构建克隆胚。结果表明:通过体细胞核移植技术,猪骨髓间充质干细胞可以有效地生产转基因囊胚,并且绿色荧光蛋白可用于转基因胚胎的筛选。     

红色荧光标记载体pBacA4DsRed1的构建及其表达

以首次克隆的家蚕Bombyx mori 肌动蛋白（actin4, A4）启动子、红色荧光蛋白基因DsRed1和多聚腺苷酸识别序列SV40为元件，经多次克隆将其插入到 piggyBac转座载体中，构建成pBacA4DsRed1转基因表达载体。将该载体显微注射到胚盘形成前期的蚕卵中，在荧光显微镜下观察其发光情况，结果发现：在胚胎早期发育的第三天，检测到蚕卵内发出较强的红色荧光。由于蚕卵没有红色自发荧光，用DsRed1标记背景干扰小，对注射蚕种无特别选择，在荧光显微镜下观察到明显的红色荧光，表明pBacA4DsRed1载体构建正确且能在蚕卵中表达。红色荧光蛋白(RFP)基因丰富了报告基因的种类，并且与绿色荧光蛋白(GFP)基因一样，可以作为理想的报告基因应用于家蚕的功能基因研究。     

CRISPR/Cas9靶向敲除番茄SNAC4/9突变体的构建、鉴定及分析

NAC转录因子参与植物生长发育、果实色素积累、细胞壁形态形成和植株衰老等过程。为系统研究SNAC4(SlNAC48,基因ID:101247735)和SNAC9(SlNAC19,基因ID:101248665)在番茄成熟衰老进程中的精准功能,本试验设计SNAC4/9敲除靶点,通过重叠聚合酶链式反应（overlapping PCR）法构建单引导RNA(sgRNA)表达盒,采用金门分子克隆（golden gate）方法将单个或多个sgRNA表达盒组装至pYLCRISPR/Cas9载体。PCR和测序结果表明,SNAC4/9敲除载体构建成功,通过农杆菌转化法将编码Cas9蛋白和sgRNA的基因导入Micro-Tom番茄细胞,对阳性苗进行靶点和脱靶位点检测,结果表明番茄成功突变且未脱靶,通过鉴定T1代突变体进一步证明,CRISPR/Cas9基因编辑番茄的靶点在代际之间可以稳定遗传。与野生型相比,SNAC4/9敲除果实色素积累减少,成熟延迟,表明SNAC4/9在番茄果实成熟中发挥重要作用。本研究为进一步探究SNAC4/9调控番茄果实色素代谢和胞壁代谢机制提供了遗传材料和试验基础。