小鼠胚胎干细胞体外定向诱导分化成骨细胞

将小鼠5d龄ES-D3细胞源的类胚体(EBs)单细胞,按5×104/mL接种6孔细胞培养板,在DMEM基础培养基中使EBs单细胞贴壁培养。于第14!21天时,分别添加60%成骨细胞条件培养液(A组)、50μg/mL维生素C"50mmol/Lβ-磷酸甘油(B组)和50μg/mL维生素C"50mmol/Lβ-磷酸甘油"1μmol/L地塞米松(C组),并设不添加诱导剂对照组(D组)。第22天时用1%茜素红染色显示阳性细胞,计算成骨细胞诱导形成率,数据用方差分析和多重比较检验。结果表明,A组细胞增殖呈团状聚集,茜素红染色阳性细胞结节多分布于聚集的细胞群内及其边缘,成骨细胞诱导形成率为10.04%,与对照组比较,差异极显著(P<0.01);B组诱导分化的细胞分泌物形成网状结构,茜素红染色阳性细胞分布在这些网状结构中,成骨诱导形成率为7.43%,与对照组比较差异显著(P<0.05);C组茜素红染色阳性细胞分散而均匀,但未出现网状结构,成骨细胞诱导形成率提高至27.57%,与对照组比较差异极显著(P<0.01)。     

猪H1foo基因的克隆与真核表达载体的构建

卵特异性连接组蛋白(oocyte-specific linker histone H1,H1foo)是在哺乳动物卵母细胞与早期胚胎内特异表达的连接组蛋白,它在卵母细胞生长成熟、受精及胚胎发育中起关键性作用.本研究旨在克隆猪H1foo基因,并构建其真核表达载体.首先利用5'RACE和RT-PCR的方法获得猪H1foo基因的CDS区,并提交GenBank,登录号为HQ915640;然后将H1foo基因的CDS区连接到载体pMD19-T上,经酶切后定向克隆到表达载体pVenus上,从而构建pVenus-H1foo真核表达载体;用脂质体2000介导重组质粒pVenus-H1foo转染Hela细胞,荧光显微镜下观察、RT-PCR检测,确定重组质粒在Hela细胞内的表达和定位;最后通过体外转录试剂盒将H1foo-venus体外转录为mRNA,并显微注射至猪卵母细胞,荧光显微镜观察其表达和定位.序列分析表明猪Hlfoo基因CDS区全长1 041bp,编码346个氨基酸,蛋白分子量为36.45kD,在核苷酸水平上与牛、人和小鼠H1foo基因的相似度分别为75.7％、67.9％和54.3％;真核表达载体pVenus-H1foo转染后,能在He(l)a细胞中表达并可以准确的定位在细胞核;体外转录的H1foo-venusmRNA显微注射猪卵后其融合蛋白也能准确定位于细胞核.本研究克隆了猪H1foo基因并成功构建其真核表达载体;体外转录的H1foo-venusmRNA能在猪卵中正确表达和定位,为进一步研究H1foo在猪卵母细胞成熟以及核移植过程中的作用提供了基础资料.     

支持牛类胚胎干细胞发育的饲养层培养体系的建立

以小鼠胎儿和牛睾丸为材料 ,以含 1 5 % NBS、0 .1 mmol/ Lβ-巯基乙醇、0 .1 μmol/ L Na2 Se O3的DMEM溶液为培养液 ,分离获得了传 1 5代的小鼠胎儿成纤维细胞和 5代牛睾丸成纤维细胞 ,建立了小鼠和牛类 ES细胞培养体系。结果表明 :牛睾丸成纤维细胞和小鼠胎儿成纤维细胞均属附着生长型细胞 ,与小鼠胎儿成纤维细胞相比较 ,牛成纤维细胞直径和长度大 ,生长速度快 ,易于老化 ;1 2～ 1 6日龄的小鼠胎儿最适宜分离与克隆小鼠胎儿成纤维细胞 ;在 2 5℃条件下 ,以 0 .2 5 %胰蛋白酶 0 .0 4% EDTA消化液作用胎儿小块组织分离原代小鼠胎儿成纤维细胞 ,消化液作用时间不应超过 2 0 min,以相同的消化液在 3 7℃条件下 ,离散贴壁成纤维细胞 ,作用时间以 2～ 3 min为宜 ;培养细胞密度与传代时间间隔有密切关系 ,若传代时间间隔为 3～ 4d,培养细胞浓度应为 3× 1 0 5个 / ml～ 5× 1 0 5个 / ml;在成纤维细胞分离与克隆过程中 ,培养基中添加0 .1μmol/ L Na2 Se O3 0 .1 mmol/ Lβ-巯基乙醇 1 5 % NBS,有利于 MEF和 NBTF的增殖     

小鼠卵母细胞和早期胚胎端粒酶活性的测定

为了解小鼠早期发育过程中端粒酶的活性变化,本研究利用端粒重复序列扩增法(TRAP)进行了小鼠卵母细胞和附植前胚胎端粒酶活性的测定。结果表明,小鼠卵母细胞、桑椹胚和囊胚为端粒酶阳性,而2-细胞和8-细胞为阴性。依据电泳条带在成像系统下的光密度,计算相对总产品产量(TPG)的定量比较发现,囊胚端粒酶活性最高,为269.331;桑椹胚次之,为96.231;卵母细胞最低,为85.782。小鼠桑椹胚和囊胚胚胎记数及单细胞端粒酶活性比较结果显示,囊胚单细胞TPG最低,为3.45;桑椹胚单细胞略高于囊胚,为4.00;而卵母细胞最高,为85.782,大约是囊胚细胞的25倍。     

牛p53基因真核表达载体构建及其在卵母细胞中表达定位

p53是一种肿瘤抑制基因,在细胞周期阻滞、细胞凋亡、衰老和自噬过程中发挥着调控作用,在机体的各个组织中广泛表达.本研究旨在构建牛p53基因真核表达载体并研究其在牛卵母细胞中的表达和定位.首先从牛(Bos taurus)卵丘细胞中克隆了p53基因并将其连接到pMD 19-T载体上,双酶切鉴定后定向连接到pVenus载体上构建了pVenus-p53真核表达载体,经脂质体2000介导转染Hela细胞,确定重组质粒在Hela细胞中的表达定位,主要定位于细胞核.然后用体外转录试剂盒将p53-Venus转录成cRNA,通过显微注射观察其在卵母细胞中的表达定位情况,主要定位于细胞核,但胞质中也有少量表达.最后,取体外培养不同时期的牛卵母细胞,通过实时定量PCR检测p53在体外培养不同时期的表达量的变化,采用2-ΔΔC法分析p53/β-actin表达水平的变化值,p53的表达从GV期到MⅠ期迅速升高,在MⅠ期其表达量达到最高,随后又逐渐降低.本研究构建了牛p53真核表达载体pVenus-P53,并且体外转录的p53-Venus cRNA能在牛卵母细胞中正确表达定位,检测了p53在牛卵母细胞成熟培养各个时期表达量的变化,为进一步研究p53在牛卵母细胞体外成熟中的作用提供了参考资料.     

动物细胞分化与克隆

细胞分化是细胞行使功能的前提条件，是特定基因表达的结果。细胞分化状态的维持需要细胞外环境、细胞与细胞之间信息交流及其细胞内环境等共同作用，从而保证分化细胞染色体的特定空间结构。细胞内环境中细胞核因素的影响可以归结为后生性遗传作用，细胞质因素主要有转录后基因沉默(RNAi)和蛋白质磷酸化作用等。克隆动物的实质是细胞分化过程的逆转。克隆动物的过程及其卵母细胞质中的特殊物质破坏了维持供体细胞分化状态的各种条件，改变了分化细胞染色体的特定空间结构，对分化细胞进行了重新编程。克隆过程中卵母细胞质对体细胞的去分化过程并非完全正确，同时由于体细胞染色体可能存在的变异，导致体细胞克隆效率很低。加强对发育生物学基本问题的研究和对现有克隆动物进行详细的研究分析，并继续改进和完善现有的体细胞克隆操作程序，是提高克隆动物效率的当务之急。     

小鼠生殖细胞特异基因Oct4启动子片段克隆及报告载体构建

本研究通过PCR方法从小鼠(Mus musculus)基因组中扩增出Oct4启动子的CR4区和CR1区,将其克隆到真核报告载体pEGFP-1,构建了携带Dct4启动子片段的小鼠生殖细胞特异性报告载体CR1,4-pEGFP-1.用该载体转染多种细胞,在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白(EGFP)在细胞中的表达情况,同时以半定量RT-PCR检测转染细胞中Oct4及其它生殖细胞特异性基因的转录情况.结果显示,GFP在小鼠胚胎干细胞、小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)和C2C12细胞中均不表达,而在P19细胞和睾丸细胞中表达.RT-PCR结果显示,Oct4在P19、睾丸细胞和生殖干细胞中特异性转录.这表明所构建的绿色荧光蛋白报告载体只在生殖细胞和多能生殖干细胞中内表达,该质粒可作为示踪生殖细胞的工具,同时也可以作为生殖干细胞多能性状态的一个监测标记.     

牛生发泡期裸卵体外成熟培养体系的建立

本研究通过牛(Bos taurus)卵母细胞体外成熟培养不同时间(0和10 h),剥除卵母细胞外周的颗粒细胞后继续培养,观察其与不脱颗粒细胞正常体外成熟培养卵母细胞之间的差异.研究结果显示:成熟培养0脱颗粒细胞的卵母细胞,与正常成熟培养的卵母细胞在成熟率(19.51%vs.80.14%,P<0.05)、卵裂率(27.08%vs.82.61%,P<0.05)和孤雌激活胚胎囊胚率(7.69%vs.21.71%,P<0.05)差异显著;成熟培养10 h后脱颗粒细胞的牛卵母细胞,与正常体外成熟培养的卵母细胞相比,在成熟率(82.71%vs.80.14%,P>0.05)、卵裂率(83.01%vs.82.61%,P>0.05)和孤雌激活胚胎囊胚率(19.30%vs.21.71%,P>0.05)无显著差异.向成熟培养10h脱颗粒细胞的卵母细胞内注射pVenus-Hlfoo mRNA,pVenus,pDsRed1-N1和重组质粒pDsRedl-Hle都能够得到表达.非功能标记基因显微注射组与对照组在卵母细胞成熟率(81.42%vs.82.03%,P>0.05)、卵裂率(75.24%vs.78.15%,P>0.05)和孤雌激活胚胎囊胚率(17.42%vs.18.82%,P>0.05)上差异不显著.研究结果提示:在成熟培养10 h,剥离颗粒细胞不会影响牛卵母细胞的发育潜能,这一技术平台可以用于牛卵母细胞体外成熟分子机制的研究.     

两种激活处理促进小鼠孤雌胚胎原核形成

不同人工处理方法激活哺乳动物卵母细胞的机理相似,但其激活效率存在差异。本研究以昆明（KM）、129/Sv×KM F1和C3H×KM F1雌鼠来源的卵母细胞为对象,利用氯化锶（SrCl2,Sr2＋）联合细胞松弛素B（cytochalasin B,CB）（Sr2＋＋CB）和离子霉素（ionomycin,Ion）联合6-二甲胺基嘌呤（6-dimethylaminopurine,6-DMAP）（Ion＋6-DMAP）两种激活方法处理下对比分析不同品系小鼠卵母细胞的激活效率,并以卵母细胞原核形成率、原核数量和孤雌胚胎体外发育来评价两种激活剂的激活效率。研究结果表明,Ion＋6-DMAP激活卵的1原核比率显著高于2原核（p〈0.05）,Sr2＋＋CB激活卵的2原核比率显著高于1原核（p〈0.05）;KM、129/Sv×KM F1和C3H×KM F1各组孤雌胚胎卵裂率和激活率没有显著差异（P〉0.05）,但129/Sv×KM F1和C3H×KM F1囊胚发育率显著高于KM组（p〈0.05）。3种小鼠品系的卵母细胞用Sr2＋＋CB处理的孤雌胚胎发育率显著高于Ion＋6-DMAP。结果证明,Sr2＋＋CB处理小鼠卵母细胞的激活效率明显优于Ion＋6-DMAP;129/Sv×KM F1和C3H×KM F1的孤雌胚胎体外发育率显著高于KM小鼠,为研究小鼠遗传背景影响孤雌胚胎发育的机理提供参考。     

自由舔食补饲小苏打在高产奶牛疾病预防中的应用研究

[目的]饲喂碳酸氢钠能够参与反刍动物瘤胃酸碱调节并发挥重要的酸碱平衡作用。试验通过对比高产、中产、低产3个不同群体荷斯坦奶牛每头每日补饲不同剂量小苏打后,观察其对奶牛个体平均泌乳天数和日单产的影响,探究小苏打的最佳补饲量与补饲方法,为我国现阶段高产奶牛的饲管提供有价值的借鉴。[方法]对本场挤奶大厅1 000头泌乳牛连续16个月不间断全群补饲小苏打,以奶牛恶性舔土现象出现的次数以及临床热应激疾病发病数量作为瘤胃酸碱平衡的量化指标,分析各试验组的小苏打补饲量。[结果]高产群、中产群、低产群每头荷斯坦奶牛每日通过自由舔食分别平均获得61 g, 70 g, 80 g的小苏打,加上精饲料中分别提供的174 g, 156 g, 120 g,高产群、中产群、低产群每头每日实际需要量为235 g, 226 g, 200 g。[结论]通过高产奶牛自由舔食补饲小苏打的研究,确认自由舔舐是一种安全有效的小苏打补充方法。添加适合剂量的小苏打能够预防高产奶牛代谢性疾病的发生,有效减少奶牛恶性舔土现象,从而提高奶牛的生产和繁殖性能。