骨保护素和核因子κB受体活化因子配基对体外培养鸭破骨细胞的影响

探讨了核因子κB受体活化因子配基(Receptor activator of NF-κB ligand,RANKL)和不同浓度骨保护素(Os-teoprotegerin,OPG)对鸭破骨细胞(Osteoclasts,OC)生成和活化的影响.从7日龄内番鸭长骨骨髓分离破骨细胞,添加1,25-(OH)2D3进行诱导培养15 h后,更换含不同细胞因子的培养液(对照组:不加细胞因子;30 μg/LsRANKL组;30 μg/L sRANKL+10 μg/L OPG组;10μg/L OPG组;50 μg/L OPG组;100 μg/L OPG组),继续培养.倒王显微镜进行OC形态学观察,比较各组培养3 d后抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)阳性OC数量、培养7 d后扫描电镜观察象牙片吸收陷窝.结果表明:50 μg/L OPG组、100μg/L OPG组OC数均极显著少于10 μg/LOPG组(P<0.01);添加OPG组OC数均极显著少于30μg/L sRANKL组(P<0.01),象牙片吸收陷窝随OPG添加浓度的增加而减少,面积减小,陷窝深度变浅.RANKL能够促进OC的生成及活化,而OPG可与RANKL竞争性地结合RANK抑制OC的生成和活化,从而抑制OC的骨吸收.     

2种方法诱导形成的破骨细胞特性比较

采集ICR小鼠骨髓单核细胞在体外培养过程中加入25.0 μg/L M-CSF+50.0 μg/L RANKL诱导形成破骨细胞,同时选择RAW264.7细胞培养过程中添加100.0 μg/L RANKL诱导分化为破骨细胞.通过检测抗酒石酸碱性磷酸酶(Tartrate resistant acid phosphatase,TRAP)染色阳性数及骨吸收陷窝,比较小鼠骨髓单核细胞和RAW264.7细胞株诱导形成的破骨细胞活性.结果显示,小鼠骨髓诱导的细胞TRAP阳性数显著低于RAW264.7细胞株(P＜0.05),而小鼠骨髓诱导的破骨细胞所形成骨吸收陷窝的面积显著大于RAW264.7细胞株(P＜0.05).结果表明,2种方法均可诱导形成具有典型特征的破骨细胞,骨髓单核细胞诱导形成的破骨细胞活性更强,但破骨细胞的数量和纯度明显低于RAW264.7细胞株.     

鸡破骨细胞分离和培养方法的改进

为获得大量有活力的鸡破骨细胞(Osteoclast,OC),本试验选取18日龄鸡胚,从长骨中提取骨髓细胞,用胰酶消化,40%和70%的percoll梯度离心分离骨髓间质细胞。在此基础上,用60 ng/mL核因子κB受体活化因子配体(RANKL)、50 ng/mL巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)诱导培养。采用抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色、骨吸收陷窝以及标志性蛋白TRAP、基质金属蛋白酶9(MMP-9)、组织蛋白酶K检测鉴定破骨细胞。结果显示,诱导后的TRAP阳性细胞剧增,TRAP、MMP-9和组织蛋白酶K蛋白表达极显著上调,可在牛骨上形成大量的骨吸收陷窝。研究表明,该方法是一种快速、实用、高效的鸡破骨细胞分离培养技术。     

破骨细胞分化因子可诱导鸡骨髓细胞形成破骨样细胞

研究了鸡破骨细胞分化因子（Chicken osteoclast differentiation factor，chODF）体外诱导鸡骨髓细胞形成破骨样细胞的能力。在无菌条件下取鸡股骨和胫骨，收集骨髓细胞。试验分设A、B、C、D、E、F、G7组。A组为对照组，不加细胞因子，其他各组为试验组，其中B组仅加chODF，C组只加巨噬细胞集落刺激因子（Macrophage-colony-stimulatingfactor，M-CSF），D、E和F组同时加不同浓度的chODF和M—CSF，G组同时加chODF、M-CSF和鸡护骨素（Chicken osteoprotegerin，chOPG）。通过抗酒石酸盐酸性磷酸酶（Tratrate-resistant acid phosphatase，TRAP）、HE、骨吸收陷窝甲苯胺蓝染色和显微、超微检查，观察和鉴定破骨样细胞（Osteoclastlikecell，OLC）的形成。结果表明，chODF可诱导形成典型的OLC，骨吸收陷窝清晰可见，其陷窝面积大，数量多，且TRAP阳性多核细胞的数目与ODF的浓度呈正相关，多组比较其差异显著（P〈0．05），但若加入chOPG，则阻断了OLC的形成和骨吸收。本试验建立了一种鸡骨髓细胞诱导破骨样细胞方法，既为体外研究鸡破骨细胞的分化发育和功能调节创造了条件，也为进一步研究OPG／ODF／RANK（NF-κB受体，Receptoractivator of NF-κB）在蛋鸡骨质疏松症等骨骼疾病的作用机制提供理论基础。     

OPG/RANKL/RANK系统的研究进展

OPG/RANKL/RANK系统是近年来骨科研究领域中的重大突破,研究发现许多激素、细胞因子等均通过直接或间接的调节骨保护素(osteoprotegerin,OPG),核因子-κB受体活化因子配体(receptor activator ofNF-κB ligand,RANKL)的表达,调控OPG、RANKL和核因子-κB受体活化因子(recep-tor activator of NF-κB,RANK)之间的比例,从而介导破骨细胞的分化和功能而达到抗骨质疏松或致骨质疏松的作用。现就OPG/RANKL/RANK系统在骨质疏松中的作用做一综述。     

钙螯合羊骨胶原多肽抑制骨质疏松发生的RANK/RANKL/OPG信号机制

OPG/RANKL/RANK信号通路在破骨细胞形成过程中起着至关重要的作用,本研究将探讨钙螯合羊骨胶原多肽(SBCP-Ca)对骨质疏松(OP)发生的抑制作用及其基于OPG/RANKL/RANK信号通路的作用机制。通过摘除大鼠双侧卵巢建立OP模型,SBCP-Ca(100mg·mL~(-1))的灌胃剂量为10mL·(kg·d)~(-1),持续8周。试验期结束后,股骨远端干骺端扫描电镜观察结果表明OP造模成功。模型组大鼠血液中反映骨形成和吸收的PINP和β-CTx水平均极显著高于假手术组(P0.01),股骨中的钙含量和羟脯氨酸含量则极显著低于假手术组(P0.01)。SBCP-Ca组的血清PINP、β-CTx水平则与假手术组无显著差异(P0.05),股骨中的钙含量和羟脯氨酸含量极显著高于模型组(P0.01)。荧光定量PCR结果表明模型组股骨组织中RANK和RANKL相对转录水平均极显著高于假手术组(P0.01),骨质疏松对OPG的表达没有显著影响。SBCP-Ca组的RANK和RANKL极显著低于模型组(P0.01),OPG水平则极显著高于模型组和假手术组(P0.01)。以上结果表明:SBCP-Ca可有效抑制OP的发生,通过抑制RANK和RANKL表达,促进OPG表达的三重作用来抑制破骨细胞的形成和骨吸收活性。     

鸭胚与小鼠的破骨细胞特性比较

本文分别采集鸭胚与小鼠的破骨细胞(osteoclast,OC),通过检测TRAP阳性细胞数及骨吸收陷窝面积,比较鸭胚与小鼠的OC形态、数目及活性。结果表明,鸭胚OC形状不规则、体积较大、核多且主要分布于胞质,而小鼠OC形状较规则、体积小、核多且大多分布于细胞边缘;随机选取视野中,鸭胚与小鼠OC数差异不显著;而鸭胚OC骨吸收陷窝面积显著大于小鼠OC骨吸收陷窝面积(P0.05)。表明鸭胚与小鼠OC均具有OC的普遍特征,但两者在骨吸收活性方面存在差异。     

骨保护素对破骨细胞活性的影响

旨在探讨骨保护素(osteoprotegerin,OPG)对破骨细胞(osteoclast,OC)活性的影响.采用小鼠原代OC模型,在体外培养的基础上添加不同浓度OPG,通过TRAP阳性细胞计数、细胞骨架F-actin染色、骨吸收功能检测等手段,观察OPG对体外培养OC的作用.结果发现,OPG能够直接作用于OC,减少其数量,破坏其F-actin环,减弱其骨吸收活性,且随OPG浓度的增加,对OC的影响更加明显.结果表明,OPG能够减少OC数量并抑制其骨吸收活性,呈现剂量效应.     

1,25(OH)_2D_3对体外诱导培养鸡胚破骨细胞的影响

为了研究1,25(OH)2D3对体外诱导培养鸡胚破骨细胞的作用,从18日龄鸡胚长骨(股骨和胫骨)分离骨髓细胞进行培养,在培养过程中分别添加10-7,10-8和10-9mol/L的1,25(OH)2D3。通过倒置显微镜观察其活体形态,对培养1,3,5,7 d的破骨细胞进行抗酒石酸酸性磷酸酶染色(TRAP)鉴定,培养7 d后进行骨吸收陷窝和功能分析。结果显示,10-8mol/L组除第1天和其他各组差异不显著以外,第3,5,7天诱导所生成的破骨细胞的数量都显著高于10-7和10-9mol/L这2组(P0.05),极显著高于对照组(P0.01)。经扫描电镜观察,无论是吸收陷窝面积还是陷窝吸收程度,10-8mol/L组均显著高于其2组;对照组无明显陷窝。由此可知,1,25(OH)2D3能诱导鸡胚骨髓细胞形成破骨细胞,且浓度为10-8mol/L时效果最好,所诱导的破骨细胞活性较高。     

维生素D介导鸡BMSCs和BMMs共培养体系中破骨细胞的形成

为探究1α, 25-(OH)_2D_3对鸡骨髓间充质干细胞(BMSCs)和骨髓单核巨噬细胞(BMMs)体外共培养体系中破骨细胞(OC)形成的影响,笔者对1α, 25-(OH)_2D_3处理后的细胞进行抗酒石酸酸性磷酸酶染色(TRAP)、骨吸收功能鉴定、OC标志基因mRNA和蛋白表达的检测。结果表明:1α, 25-(OH)_2D_3能够上调BMSCs中核因子κB受体活化因子配体(RANKL)的表达,下调骨保护素(OPG)的表达。1α, 25-(OH)_2D_3处理共培养细胞5 d,OC数目较对照组明显增多,骨吸收活性较对照组极显著增强,基质金属蛋白酶9(MMP-9)、Ⅱ型碳酸酐酶(CAⅡ)、组织蛋白酶K(CtsK)及TRAP等标志性蛋白的mRNA和蛋白表达极显著高于对照组(P0.01),其中10~(-8) mol·L~(-1) 1α, 25-(OH)_2D_3效果最明显。结果表明,10~(-8) mol·L~(-1) 1α, 25-(OH)_2D_3能够介导鸡BMSCs和BMMs共培养体系中OC的形成,该OC具有骨吸收活性,为进一步研究OC在家禽骨骼及钙磷代谢紊乱性疾病中的作用机制奠定基础。     

番鸭破骨细胞的培养及鉴定

分离7日龄内番鸭长骨破骨细胞（osteoclast,OC）,倒置显微镜观察其活体形态。培养1、3、5、7d进行抗酒石酸酸性磷酸酶染色（TRAP）,培养7d后进行骨吸收陷窝定量分析,观察番鸭OC数量、体外生存时间以及骨吸收功能。结果显示,倒置显微镜下观察,OC为多核巨细胞,有伪足并借助伪足的凹凸伸缩而改变形态、运动行走。玻片上OCTRAP染色阳性,培养7d的象牙片上产生明显吸收陷窝。直接分离OC的数量随培养时间延长而减少,单核细胞融合而成的OC数量随培养时间延长而增加;分离培养的鸭OC具有骨吸收活性,TRAP染色阳性。     

钙磷对体外培养SD大鼠破骨细胞生成和活化的影响

通过成骨细胞与脾细胞共培养，在体外诱导脾细胞转化为破骨细胞，转化过程中分别加入3、5mmol／L的钙或磷及不同比例的钙、磷，设不添加钙、磷因子对照。经形态学观察、抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色计数、扫描电镜观察象牙片吸收陷窝研究钙、磷因子对大鼠破骨细胞生成和活化的影响。结果表明，培养液中钙、磷浓度分别为3、5mmol／L时对破骨细胞的生成及活化均有显著抑制作用（P〈0．05），5mmol／L Ca对破骨细胞生成活化的抑制与对照组差异极显著（P〈0．01）。Cca：Cp=2：1组对破骨细胞生成和活化的抑制作用最强。证实钙、磷通过抑制破骨细胞的生成和活化抑制破骨细胞的骨吸收活性。     

两种方法所获鸭破骨细胞数量及活性比较

对直接从鸭骨髓腔机械分离的成熟破骨细胞（osteoclasts,OC）和由鸭骨髓来源单核细胞融合成的OC样多核巨细胞（multinucleatedgiantcells,MNGCs）进行培养,分别进行抗酒石酸酸性磷酸酶（tartrate-resistantacidphosphatase,TRAP）染色并计数,扫描电镜观察象牙片吸收陷窝,比较了2种方法获得0C的骨吸收功能。结果显示,2种方法均能分离培养出TRAP阳性且具有骨吸收功能的多核OC,但直接分离获得的成熟OC骨吸收功能更强。     

番鸭破骨细胞骨髓诱导培养体系的建立

无菌分离、冲洗7日龄内番鸭长骨骨髓,收集、培养破骨细胞（Osteoclasts,OC）。培养过程中对照组不添加钙、磷因子,试验组加入不同浓度比例的钙磷双因子（Ca∶P分别为2∶1、1∶1、1∶2）,进行破骨细胞骨髓诱导培养。倒置显微镜观察细胞形态,于培养1、3d进行抗酒石酸酸性磷酸酶染色（TRAP）计数,培养7d后扫描电镜观察象牙片吸收陷窝。结果显示,培养3d时试验组TRAP阳性细胞均多于对照组,差异极显著（P〈0.01）;试验2∶1组与1∶1组差异不显著（P〉0.05）,其余各组间均差异极显著（P〈0.01）;扫描电镜观察,象牙片吸收陷窝程度与钙磷比例大小（2∶1、1∶1、1∶2）成反比。当钙磷比例为1∶2时,破骨细胞数量最多,功能活跃。结果表明,鸭破骨细胞骨髓诱导培养体系已成功建立。     

破骨细胞与奶牛产乳热

奶牛产乳热是奶牛围产期的多发病,在养殖生产中造成了重大危害。研究发现,产乳热的发生与分娩前后血钙浓度降低有关。甲状旁腺激素(PTH)、降钙素(CT)和1α,25-(OH)_2D_3可直接或间接地调控破骨细胞(OC)的形成、活化和骨吸收功能,从而调控骨钙动员和血钙浓度,很可能与产乳热的发生息息相关。本文就PTH、CT和1α,25-(OH)_2D_3在产乳热中调控OC的可能机制作一综述。     

磷对体外培养番鸭破骨细胞生成及骨吸收功能的影响

本试验旨在观察磷对体外培养番鸭破骨细胞(OC)生存、生成以及骨吸收功能的影响.分离1日龄番鸭长骨骨髓细胞,培养过程中分别加入不同比例的NaH2PO4、10-8 mol/L 1,25-(OH)2D3二因子、不同浓度的NaH2PO4单因子.倒置显微镜观察细胞形态,更换含磷培养液后6 h、12 h、18 h、24 h、30 h和7 d进行抗酒石酸酸性磷酸酶染色(TRAP),分别进行OC计数、形态观察;培养30 h内吖啶橙染色,观察OC凋亡情况,7 d后扫描电镜观察象牙片吸收陷窝情况.结果表明:在同一时间点,添加磷培养液均能抑制1,25-(OH)2D3诱导产生OC,并抑制OC的骨吸收活性,抑制程度与磷浓度成正比,3、5和7 mmol/L组OC数量均极显著少于对照组(P＜0.01);5 mmol/L组OC数量极显著少于3 mmol/L组(P＜0.01);5 mmol/L组与7 mmol/L组差异不显著;更换含磷液培养12、18、24和30 h,均可见磷含量达3 mmol/L时OC数量均极显著少于对照组(P＜0.01),磷浓度相同组,OC数量随着培养时间的延长而减少.添加磷培养液能够抑制体外诱导培养OC的生成及骨吸收活性,抑制体外培养成熟OC的生存.     

破骨细胞形成和活化的两种调控机理

破骨细胞(osteoclast，OC)是一种终末分化的巨大的多核细胞，它的作用是降解并吸收矿化的骨组织。骨形成和骨重建是一个生理控制过程，该过程包括破骨细胞介导的骨吸收和成骨细胞(osteoblast，OB)介导的骨形成。激素水平的变化及多种炎性因子和生长因子的干扰都会打破OB和OC之     

RhoU基因沉默对破骨细胞分化的影响

为了研究RhoU(Wrch1)在破骨细胞(osteoclast,OC)分化过程中的作用及其机理,试验以RAW 264.7细胞(单核巨噬细胞系)为基础材料,分别转染阴性慢病毒和siRhoU慢病毒并建立稳定的细胞系;在巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)和核因子κB受体活化因子配体(RANKL)存在的条件下,阴性对照组和RhoU沉默组细胞系分别诱导3或4 d。采用荧光定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)技术检测RhoU和破骨细胞标志性mRNA的表达,蛋白免疫印迹(Western blot)技术检测RhoU和破骨细胞标志性蛋白的表达,抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色观察OC的形成,激光共聚焦显微镜观察OC及其前体细胞的形态变化。结果显示,与阴性对照组相比,RhoU沉默组RhoU基因mRNA和蛋白表达量极显著降低(P0.01);OC形成的数量和面积极显著减少(P0.01);OC前体细胞丝状伪足形成受阻,破骨细胞缺乏完整的封闭带;OC特异性基因mRNA和蛋白表达量均显著或极显著下降(P0.01或P0.05),而TRAP基因mRNA变化不显著(P0.05)。综上表明,沉默RhoU基因能抑制破骨细胞的分化,抑制前体细胞丝状伪足的形成进而影响其融合可能是其主要原因。     

IGF-1体外调控奶牛成骨细胞骨保护素和核因子κB受体活化因子配体的表达

为了研究胰岛素样生长因子-1(insulin-like growth factor,IGF-1)对奶牛成骨细胞骨重建相关因子表达的影响,探讨IGF-1对奶牛成骨细胞形成-吸收的作用,试验采用体外分离培养奶牛成骨细胞,用改良Gomori钙钴法染色鉴定,再以0,1,10,50,100 ng/mL人重组胰岛素样生长因子-1(recombinated human insulin-like growth factor-1,rhIGF-1)干预培养5 d后,半定量RT-PCR法检测成骨细胞骨保护素(osteoprotegerin,OPG)和核因子κB受体活化因子配体(receptor activator of nu-clear factor-κB ligand,RANKL)mRNA的表达,ELISA检测细胞培养上清液OPG蛋白水平。结果表明:1~100 ng/mL rhIGF-1干预5 d,OPG、RNAKL mRNA表达均较未干预组增加,10,50,100 ng/mL组OPG/β-actin、RANKL/β-actin比值显著高于未干预组(P0.05),且在1~100 ng/mL浓度范围内,rhIGF-1呈剂量依赖方式上调OPG蛋白表达,其中10,50,100 ng/mL干预组与未干预组差异显著(P0.05)。说明IGF-1调控奶牛成骨-破骨细胞介导的形成-吸收偶联,促进骨形成,这可能是IGF-1参与奶牛骨代谢性疾病的重要机制之一。     

不同钙磷比例对体外培养番鸭破骨细胞生成及骨吸收功能的影响

从1～7日龄番鸭长骨骨髓分离破骨细胞（Osteoclasts，OC）进行培养，培养过程中添加不同摩尔浓度比例的钙磷双因子（CCa：Cp为2：1、1：1、1：2）。倒置显微镜观察细胞形态，于培养第1、3天进行抗酒石酸酸性磷酸酶染色（TRAP），培养7d后扫描电镜观察象牙片吸收陷窝，研究不同钙磷比例对番鸭OC生成及骨吸收功能的影响。结果显示，培养第3天时试验组TRAP阳性细胞多于对照组，差异极显著（P〈0．01）。试验组中除CCa：Cp=1：1组与CCa：Cp=2：1组之间无显著差异外（P〉0．05），其余各组间差异均极显著（P〈0．01）。扫描电镜观察，象牙片吸收陷窝程度与钙磷比例大小（CCA：Cp为2：1、1：1、1：2）成反比。证实合适比例的钙、磷（CCa：CP=2：1）通过抑制OC生成和活化，抑制OC的骨吸收活性。