利用E.coli表达系统制备猪细小病毒NS1抗原表位区蛋白的研究

为通过E.coli表达系统制备猪细小病毒NS1抗原表位区蛋白,本试验利用DNAstar软件确定含有抗原表位的NS1蛋白片段,然后运用PCR方法从含有NS1基因的载体中扩增NS1抗原表位区基因片段,并将该基因片段插入到原核表达载体pGEX-4T-1中,构建成与GST标签融合的NS1抗原表位基因的表达载体pGEX-GST-NS1,将表达载体转化BL21大肠杆菌筛选出工程菌。经IPTG诱导表达NS1融合蛋白,经GST-琼脂糖凝胶磁珠分离纯化,制备出与GST融合的NS1抗原表位蛋白。经SDS-PAGE以及Western blot鉴定,制备的NS1融合蛋白分子量和预期一致,并且可以和抗GST标签抗体进行特异反应,表明NS1抗原蛋白已成功制备,为下一步NS1抗体的研制提供了必要的条件。     

人工合成的脑心肌炎病毒VP1表位基因在大肠杆菌中的表达与抗原性测定

在分析脑心肌炎病毒VP1蛋白抗原表位基础上人工合成一段含VP1抗原表位双链DNA序列（150bp），克隆于原核表达载体pGEX-6p-1，经酶切鉴定后转化大肠杆菌（E.coli）BL21感受态细胞，以异丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）诱导表达融合蛋白。经过GSTrap FF亲和层析柱获得纯化蛋白，经SDS-PAGE电泳显示相对分子质量为30800。以该纯化蛋白免疫家兔，获得效价分别为1：25600和1：1600的抗血清。Western—blot结果显示该融合蛋白与经过空载体pGEX-6p-1表达的GST蛋白孵育的抗血清反应后有明显的特异性条带。结果表明：脑心肌炎病毒VP1蛋白抗原表位区150bp编码基因在E.coli中获得正确表达，纯化后的蛋白具有抗原性。     

兔出血症病毒VP60主要抗原表位的原核表达及其免疫原性

[目的]研究兔出血症病毒（RHDV）VP60主要抗原表位基因原核表达蛋白的免疫原性。[方法]采用RT-PCR方法扩增了RHDV衣壳蛋白VP60主要抗原表位基因。以pET-28b（＋）为表达载体,在E.coliRosetta菌株中表达重组蛋白。通过Western blot分析和接种家兔检测了重组蛋白的免疫原性。[结果]经Western blot检测,在相对分子量24.0k Da处出现特异性的反应带。以纯化的重组蛋白制备的抗血清可以与纯化的RHDV发生特异性的ELISA反应。[结论]RHDV VP60主要抗原表位的原核表达产物具有较好的免疫原性。     

利用噬菌体随机肽库筛选抗原模拟表位的研究进展

噬菌体随机肽库技术是将编码外源多肽的DNA序列插入到噬菌体外壳蛋白结构基因的适当位置,使外源基因随外壳蛋白结构基因的表达而表达,被展示的外源多肽可保持相对独立的空间结构和生物活性,是一种基因型与表达型的统一。近年来,噬菌体随机肽库技术被广泛应用于各种抗原的模拟表位筛选中,并取得了显著成果。综述了利用噬菌体随机肽库技术在抗原模拟表位筛选中的研究进展。     

鸡新城疫病毒Lasota株HN蛋白主要抗原表位基因在大肠杆菌中的表达

用RT-PCR法从NDV Lasota疫苗株中扩增出HN基因,将其克隆到pGEM-T easy vector中,构建了重组质粒pT-HN.设计了1对引物,用PCR法扩增出HN蛋白主要抗原表位基因(442～1 734 bp共1 239 bp),将其连接到原核表达载体pET-28a( ),构建重组质粒pET-HN.用IPTG诱导使其在大肠杆菌BL21(DE3)中表达.SDS-PAGE结果表明,NDV HN主要抗原表住基因在pET-HN中获得了高效融合表达,其表达蛋白的分子量为28 kD.同时,通过试验摸索并确定了表达HN蛋白主要抗原表位基因的最佳诱导条件:IPTG终浓度为0.4 mmol·L-1,诱导时间为4 h,温度为37℃.     

PEDV N蛋白的原核表达纯化及B细胞抗原表位预测分析

本研究旨在对猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)N基因进行克隆构建、表达与其B细胞抗原表位性质的预测。将PEDV的N基因进行PCR扩增,克隆到原核表达载体pET-28a(+)中,经酶切验证获得阳性克隆,将阳性克隆在表达菌E. coli BL21(DE3)中表达。通过对表达条件及纯化条件的优化,获得高纯度表达蛋白。利用生物信息同源模型化软件Swiss-Pdb Viewer建立PEDV-N蛋白的3D结构,并根据生物信息学软件DNA-Star预测PEDV-N蛋白的二级结构、抗原性、亲水性和表面可及性分析,综合分析预测其B细胞抗原表位。经预测PEDV-N蛋白氨基酸序列中存在13个B细胞优势抗原表位区域。研究结果将进一步为PEDV-N蛋白体外表达产物的应用及研制基因工程疫苗提供理论基础。     

犬细小病毒VP2主要抗原表位区的原核表达载体构建及诱导表达

利用PCR扩增CPV-2bVP2蛋白的主要抗原表位区基因,并将该基因片段克隆到原核表达载体pGEX-6P-1上,通过诱导表达条件的摸索,实现了VP2蛋白主要抗原表位区在大肠杆菌中的高效表达,sDs—PAGE检测表达的融合蛋白主要以可溶形式存在,并利用亲和层析得到融合蛋白。     

人工合成的脑心肌炎病毒VP1表位基因在大肠杆菌中的表达与抗原性测定

在分析脑心肌炎病毒VP1蛋白抗原表位基础上人工合成一段含VP1抗原表位双链DNA序列(150 bp),克隆于原核表达载体pGEX-6p-1,经酶切鉴定后转化大肠杆菌(E coli)BL21感受态细胞,以异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达融合蛋白.经过GSTrap FF亲和层析柱获得纯化蛋白,经SDS-PAGE电泳显示相对分子质量为30800.以该纯化蛋白免疫家兔,获得效价分别为1:25 600和1:1600的抗血清.Westem-blot结果显示该融合蛋白与经过空载体pGEX-6p-1表达的GST蛋白孵育的抗血清反应后有明显的特异性条带.结果表明:脑心肌炎病毒VP1蛋白抗原表位区150 bp编码基因在E.coli中获得正确表达,纯化后的蛋白具有抗原性.     

猪圆环病毒2型ORF1和ORF3 T淋巴细胞抗原表位的克隆与原核表达

根据Stevenson筛选出来的3个具有活性的T淋巴细胞抗原表位(T lymphocyte epitope,TCE)合成tce基因(180 bp),成功插入到pMD18-T Simple载体中,筛选获得重组质粒,命名为pMD-TCE.将tce酶切产物亚克隆到原核表达载体pET-32a(+)中,获得重组质粒,命名为pET-TCE.用IPTG进行诱导表达,收集菌液进行SDS-PAGE检测,结果显示合成基因在pET-32a(+)中获得了高效融合表达,其表达蛋白相对分子质量约为25 000,Western-blot分析结果表明,获得的融合蛋白可与猪圆环病毒2型(PCV2)阳性血清发生特异性反应,具有良好的免疫原性.     

新城疫病毒HN基因主要抗原位点区段的原核表达

利用生物软件对新城疫病毒GD/GM/03/Ch的血凝素神经氨酸酶(HN)蛋白进行抗原特性分析,选定169～267位氨基酸、318～405位氨基酸和448～571位氨基酸3个区域作为多肽表位候选区域.用含新城疫病毒HN基因的重组质粒为模板,设计引物通过PCR扩增获得HNa、HNb和HNc 3个抗原结构域基因片段,分别经双酶切定向克隆到原核表达载体pBT上进行表达,并构建了pBT-HNa-b-c串联重组质粒进行表达,经过SDS-PAGE和Western-blot分析,验证了表达产物具有反应原性.     

禽类血管活性肠肽与乙肝病毒核心抗原融合基因的构建

在制备以禽类血管活性肠肽（VIP）为基础的基因工程疫苗工作中，选择乙肝病毒核心抗原（HBcAg)作为载体来提高鹅VIP的免疫原性，首先将克隆于鹅VIP cDNA和HBc基因第1至435bp的序列片段先后插入到质粒pRSET A的BamH I/EcoR I和Nhe I/BamH I克隆位点之间，构建成VIP序列位于HBc序列之后的VIP融合基因的重组质粒pHBc-VIP,其次将HBc第1至225bp序列的扩增片段和HBc第244bp之间包括VIP的充列经扩增，EcoR I酶切，连接，再扩增的片段先后插入到质粒pBSKS /－的BamH\Pst和Pst\HindⅢ克隆位点，构建成VIP持入到HBc基因中间（HB cAg的第75和82位氨基酸之间）融合基因的重组质粒pVIP-HBc.     

3个血清型鸡源大肠杆菌1型菌毛蛋白抗原位点变异分析

采用Goldkey及DNA Star分析软件对发表的3个不同血清型的鸡大肠杆菌1型菌毛结构基因(pilA)进行同源性及抗原位点分析。结果显示,3种鸡大肠杆菌(O_1、O_(78)及O_(88))l型菌毛pilA基因相似性为91.36％～98.38％,所编码的氨基酸同源性为93.50％～97.84％;3种血清型鸡大肠杆菌(O_1、O_(78)及O_(88))1型菌毛蛋白二级结构在1～73位及150～185位氨基酸的二级结构基本相似,而111～150位氨基酸的α螺旋与β折叠的数量有所不同。菌毛蛋白亲水性、抗原性及抗原决定簇预测表明,来源于3种血清型大肠杆菌的1型菌毛蛋白在l～110位及150～184位氨基酸存在相似的二级结构及抗原位点,且不同血清型之间存在一定的共同抗原。     

乙肝表面抗原植物表达载体构建及转化烟草的初步研究

为了探索用植物表达乙肝病毒抗原的可能性 ,将乙肝表面抗原基因插入带有 GUS报告基因的双元载体 p CAMBIA1 30 1。构建成转化烟草的双元载体 p CAMBIA1 30 1 s。用电击法将重组载体转入农杆菌 ,再侵染烟草。用抗生素筛选后 ,抗性小苗 PCR及 GUS染色呈阳性。表明这种载体不但能成功表达病毒蛋白 ,还具有快速鉴定转化株的优点     

鸭肝炎病毒单克隆抗体的研究

[目的]研制鸭肝炎病毒的单克隆抗体。[方法]将DHV-W株的鸭胚尿囊液经冻融、氯仿处理和超速离心纯化后,免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,探讨DHV特异性强、敏感性高、简便快速的DHV抗原诊断方法。[结果]经间接ELISA筛选获得1株能稳定分泌DHV的单克隆抗体的杂交瘤细胞株5G8。特性鉴定结果表明该株单抗ELISA效价较高且特异性好,中和特性稍差。杂交瘤细胞冻存6个月和12个月后复苏能稳定分泌特异性抗体。[结论]HDV的McAb成功制备为DHV的快速诊断、筛选特定基因探针等技术奠定了基础。     

乙肝病毒表面抗原基因转化番茄

将乙肝病毒表面抗原 (HBs Ag)基因与 Ca MV3 5 s启动子及 nos终止子构建植物表达载体 p1 3 0 1 HBs,直接法转入根癌农杆菌 EHA1 0 5 (Agrobacterium tumefaciens) ,以该菌株介导叶盘法转化番茄 ,得到抗潮霉素的再生植株 .抗性苗总 DNA经 PCR、Southern斑点杂交证实目的基因已整合到番茄基因组中 ,EILSA检测证明在番茄中正确表达了乙肝表面抗原蛋白 .     

犬传染性肝炎病毒Hexon蛋白基因的克隆和原核表达质粒的构建

通过设计特异性引物,以犬传染性肝炎患犬的全血基因组DNA为模板,经PCR扩增,获得了犬传染性肝炎病毒Hexon蛋白基因,将其插入到pMD18-T载体进行测序、鉴定,构建原核表达质粒载体pGEX-6p-1-Hex-on。结果显示,犬传染性肝炎病毒Hexon基因已被成功地克隆,基因全长2 718 bp,包含从起始密码子ATG到终止密码子TAA的完整序列。与犬传染性肝炎病毒国际标准株Hexon蛋白基因的同源性为99.7%,通过实验鉴定表明pMD18-Hexon克隆载体和原核表达质粒载体pGEX-6p-1-Hexon已成功构建。     

鸭病毒性肝炎高免卵黄抗体的研制

用DVH弱毒疫苗和DVH油乳剂苗免疫健康高产蛋鸡制备高免卵黄抗体,研究了高免卵黄抗体治疗雏鸭DVH的疗效。结果表明,高免卵黄抗体治疗DVH的疗效取决于卵黄抗体的中和效价、治疗时间和免疫途径。卵黄抗体的中和效价应达28.5以上,并且在感染DVH 24 h以内对雏鸭进行肌肉注射,免疫效果最好。     

鸭病毒性肝炎高免卵黄抗体的研制

用DVH弱毒疫苗和DVH油乳剂苗免疫健康高产蛋鸡,可以制备高免卵黄抗体.高免卵黄抗体治疗雏鸭病毒性肝炎疗效的试验表明,用卵黄抗体治疗DVH的疗效取决于卵黄抗体的中和效价及治疗的时间.卵黄抗体的中和效价应达28.5以上,并且在感染DVH24 h以内对雏鸭进行肌肉注射,免疫效果为最适宜.