花生EST资源的SSR信息分析

微卫星或简单重复序列(simple sequence repeats,SSR)存在于表达序列标签(expressedsequence tags,ESTs)中。为了在花生中开发EST-SSR功能性标记,利用生物信息学对NCBI公共数据库中的41501条花生ESTs序列进行EST-SSRs特征分析。剔除冗余序列,得到全长为5125.94kb的无冗余EST8391条。在这些序列中搜索出1109个SSR,分布于946条EST中,出现频率是11.27%。这些EST-SSR的平均长度为18.16bp,平均分布频率1/4.62kb。在1～6bp的重复基元中,三核苷酸重复基元的SSRs出现频率最高(49.23%),其次是二核苷酸(32.83%)、单核苷酸(14.88%)。AG/CT和AAG/CTT是二、三核苷酸中的优势重复基元,分别占二、三核苷酸重复的71.43%和31.50%。本研究为开发多态性花生微卫星标记提供了候选序列。     

大豆EST资源的SSR信息分析

微卫星或简单重复序列(simple sequence repeats,SSR)存在于表达序列标签(expressed sequence tags,ESTs)中.为了在大豆中开发EST-SSR功能性标记,利用生物信息学对NCBI公共数据库中的394 370条大豆ESTs序列进行EST-SSRs特征分析.剔除冗余序列,得到全长为51 332.21 kb的无冗余EST 80 735条.在这些序列中搜索出7 754个SSR,分布于6 674条EST中,出现频率是8.27%.这些EST-SSR的平均长度为15.26 hp,平均分布频率是1/6.62 kb.在1～6 bp的重复基元中,三核苷酸重复基元的SSRs出现频率最高(43.72%),其次是二核苷酸(37.34%)、单核苷酸(15.92%).AG/CT和AAG/CTT是二、三核苷酸中的优势重复基元,分别占二、三核苷酸重复的62.83%和25.22%.本研究为开发多态性大豆微卫星标记提供了候选序列.     

甘蔗EST序列的SSR信息分析

从NCBI公共数据库获得262 113条甘蔗EST,通过前处理和聚类拼接得到全长为50 058.89 kb的无冗余Unigene 62 565条。在这些序列中搜索出9 482个SSRs,出现频率是15.15%;平均5.28 kb出现1个SSR。三核苷酸重复是主要的类型,占总SSRs的45.92%。CT和CGC是二、三核苷酸中的优势重复类型,分别占二、三核苷酸重复的21.22%和8.18%。此外还对筛选出的SSR进行多态性预测,得到了长度在20 bp以上的低级基元一、二、三核苷酸EST-SSR共1 405条,占长度20 bp以上的SSR总数的59.16%。结果为甘蔗EST-SSR标记的开发和相关分子生物学研究提供资料和奠定基础。     

茶树EST-SSR的信息分析与标记建立

在1589条茶树EST中,共发掘出了281个EST-SSR,分布于246条EST中,出现频率是17.68%,平均长度为33.06βbp,平均分布频率是1/2.61βkb。在茶树EST-SSR中,二核苷酸重复是主要的重复类型,出现最多的重复基元类型是AG/CT重复。设计了19对SSR引物,在对引物、dNTP、MgCl₂的浓度及退火温度等参数进行测试后,建立了合适的PCR反应体系。以衍生绝大多数EST-SSR的龙井43βDNA为模板,对引物进行了筛选,有16对引物显示扩增,可用率为84.2%; 进一步在10个茶树品种中进行多态性测试,显现出多态性的引物占可扩增引物的62.5%。本文研究结果证明了根据茶树EST建立SSR标记是有效、可行的。     

蓖麻EST资源的SSR信息分析与功能注释

将NCBI公共数据库62 592条蓖麻EST序列进行拼接,得到无冗余Unigene 11 708条,总长度921 kb.在无冗余序列中发现含有SSR的EST序列2471条,共3 271个位点.SSR发生频率为27.94％,平均分布距离为2.81 kb.在1～6 bp的重复基元中,单核苷酸重复基元出现频率最高(37.51％),其次是三核苷酸重复基元(34.63％)、二核苷酸重复基元(25.61％).出现较多的重复基元是A/T(36.32％),其次是AG/CT(18.28％).蓖麻的EST-SSR出现频率较高、类型较丰富、多态性潜能较高,具有较高的利用价值.对蓖麻的EST-SSR功能注释(COG,SwissProt,KEGG),有9条序列注释到脂肪酸合成与代谢相关的基因,为后续有针对性开发EST-SSR标记提供重要依据,也为进一步开发蓖麻EST-SSR标记奠定基础.     

咖啡叶锈病菌转录组SSR信息分析

咖啡叶锈病是咖啡一种毁灭性病害。利用GRAMENE网站提供的SSR鉴定工具SSRIT(Simple Sequence Repeat Identification Tool),对咖啡叶锈病菌8 310条无冗余的EST分别进行SSR鉴定。结果共搜查到1 292个1~6碱基SSR,出现频率最高的为三碱基重复基元类型,其次为二碱基重复基元类型与六碱基重复基元类型。分别为459、321与214个,其出现频率分别为35.5%、24.8%与16.6%。AT/AT为二核苷酸中优势重复类型,占其总数的49.8%;而ATC/ATG与AAG/CTT则为三核苷酸中优势重复类型,二者分别占三核苷酸SSR总数的23.5%与23.3%。进一步对SSR多态性进行了预测,从而筛选出长度在22 bp以上具有潜在多态性的SSR 223个。此结果对于咖啡叶锈病菌群体遗传变异、多样性和进化等研究提供了分子标记。     

油棕EST序列中SSR的分布特征分析

为充分利用现有公共数据库中的EST资源开发EST-SSR引物,本研究从GenBank数据库获取39 227条油棕EST,通过聚类拼接和处理,得到全长为7977.734 kb的无冗余序列15 716条。在这些序列中共检索出699个SSRs,检出率为4.45%,平均11.41 kb出现1个SSR,包括99种重复基元。其中,二核苷酸和三核苷酸重复是主要的类型,分别占总SSRs的38.48%和25.32%。在所有的核苷酸重复基序中,二核苷酸重复序列AG/CT所占比例最高,约占27.47%。Blastx分析发现44.95%的SSR-ESTs与非冗余蛋白质序列数据库(nr)中功能基因同源,功能已知的蛋白质中葡萄来源的SSR-ESTs所占比例最大,为4.42%。同时对54条SSR-ESTs通过GO体系进行功能分类,其中46条能找到同源物,其余8条无同源物,这些序列可划分为18个亚类,在所有功能亚类中,结合活性的功能项和SSR-ESTs数量最多,另外580条未被注释功能信息。本结果将为利用EST-SSR标记来研究油棕基因组学和开展分子育种工作提供参考依据。     

甜菜EST-SSR引物的开发与应用

利用NCBI公共数据库现有的甜菜(Beta vulgaris L.)表达序列标签(expressed sequence tags,EST)数据信息,开发了甜菜EST-SSR标记。在所有的29830条甜菜EST序列中共确认得到20109条非冗余EST序列,总长为11287.6kb。在含有微卫星重复的6951条EST序列中按照SSR引物设计要求,最终获得了2845个EST-SSR,平均每3.96 kb含有1个SSR。EST-SSR的分布频率和特征分析表明,A/T单碱基重复最多,其次是AAG/CTT三核苷酸重复,AG/CT二核苷酸重复,ACCTCC/AGGTGG等六核苷酸重复最少。随机合成了100对SSR引物,并分别选用6个甜菜品种进行多态性检验,将其按遗传相似性分为两组,多态信息含量(polymorphism information content,PIC)平均值为0.47。本研究证实这种全新的开发甜菜SSR标记的方法具有高效、多态性较高的特点,在甜菜遗传多样性分析、功能基因定位、遗传图谱构建以及比较基因组等研究方面有广阔的利用前景。     

青稞转录组SSR位点及其基因功能分析

为了探讨青稞转录中SSR位点信息及其所在基因的生物学功能,使用MISA软件分析青稞转录组中SSR的分布频率和重复基元的基本类型,通过BLASTX对含有SSR的Unigene与nr、COG、Swiss-Prot和KEGG等公共数据库进行比对和功能注释。结果表明,在青稞转录组拼接得到的58 065个Unigene中发现9 576条序列中含有11 930个SSR位点,SSR发生频率为16.49%,平均每6.63kb出现1个SSR位点,共有119种重复基元(motif)。青稞转录组SSR出现频率最高的是三核苷酸重复基元(64.19%),其次是二核苷酸重复基元(24.05%)。AG/CT和AGG/CCT、CCG/CGG、AGC/CTG分别是二核苷酸重复和三核苷酸重复中的优势重复基元。在转录组中SSR重复次数以5~12次为主,基序长度主要集中在12~25bp,平均长度为21.15bp。9 576个含SSR的Unigene与nr、COG、Swiss-Prot和KEGG等公共数据库进行BLASTX比对,分别得到7 987、5 559、5 588和2 077个注释。通过基因功能注释发现青稞转录组中含SSR的序列主要与生物的基础代谢相关。     

剑麻斑马纹病菌EST-SSR标记开发与评价

剑麻斑马纹病是剑麻生产中具有破坏性的一种真菌病害。本研究从Gen Bank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucest)中随机下载10 525条寄生疫霉EST序列,经过去冗余处理后得到5 519条无冗余EST。利用MISA(MIcro SAtellite identification tool)软件进行SSR发掘,从中共搜索到199个1~6碱基SSR,其中三核苷酸重复基元类型最多,共鉴定到55个,占SSR总数的27.6%;其次是二核苷酸重复基元类型和单核苷酸重复基元类型,分别鉴定到51和47个,各占所鉴定SSR总数的25.6%和23.6%。进一步分析表明,AG/CT二核苷酸重复基元类型为优势重复类型,占二核苷酸SSR总数的76.5%。而AAG/CTT和AGC/CTG 2个基元类型在三核苷酸中出现频率最多,分别为15和11次,分别占三核苷酸SSR总数的27.3%及20.0%。从鉴定的199个SSR中,选取含有SSR的合适区段设计了22对引物,并通过18个剑麻斑马纹病菌菌株的基因组DNA进行了评价,结果只有其中9对引物能从剑麻斑马纹病菌基因组DNA中有效扩增,其扩增移效率为40.9%。由此表明,利用此方法来开发剑麻斑马纹病菌的分子标记具有可行性,只是存在一个转移效率问题。     

甘蔗EST-SSR标记的开发和多样性分析

运用生物信息学分析方法对甘蔗(Saccharum spp.)的282 809条表达序列标签(ESTs)进行分析,共获得Unigene 138 590条,发掘出分布于10 086条Unigene的10 505个微卫星(EST-SSR)位点,SSR发生频率为7.26%,平均9.22 kb出现1个SSR。在7个杂交甘蔗品种中,三核苷酸基元的SSR数量最多(74.95个/Mb),其次为二核苷酸基元的SSR(22.95个/Mb),二者占总数的90.27%。以CCG/CGG、AG/CT为重复基元的SSR是最常见的EST-SSR类型,富含G/C的EST-SSR占据极明显的优势。与拟南芥和水稻cDNA序列内SSR的比较表明,富含G/C的SSR可能是禾本科植物SSR的一个共同特点。研究发现,SSR在EST与基因组序列之间以及在不同甘蔗品种之间的分布存在差别,具有丰富的多样性。此外,从EST数据分析获得杂交甘蔗品种的16个保守基因,从中发掘了9个SSR位点。最后,利用Primer3和e-PCR软件设计了一批具有物种特异性和通用性的EST-SSR PCR引物,相关数据可以通过http://59.50.66.49/SSR/sugarcane/sugarcane.EST-SSR.tgz链接从因特网下载。该研究结果可为开展甘蔗遗传多样性分析、种质资源鉴定和分子辅助育种提供参考。     

胡椒EST-SSR标记的开发和应用

通过分析NCBI数据库中胡椒转录组数据,共得到unigene 23 524条,其中618条unigene中检测到643个EST-SSR位点,SSR发生频率为2.63%,平均分布距离为12.86 kb。在643个EST-SSR中,二、三核苷酸重复是主要重复类型,分别占27.84%和69.36%,其中(AG/CT)n、(AAG/CTT)n出现频率最高,(NNN/NNN)5类型占EST-SSR位点的42.90%。利用PRIMER3.0设计358对引物,随机合成45对引物,并选用其中11对扩增较好的多态性引物,对43份胡椒种质的遗传多样性进行初步检测,构建聚类分析树状图。结果说明,胡椒EST-SSR标记的开发是可行的,并能够有效的用于胡椒遗传分析研究,具有较高的应用价值。     

基于转录组测序的油梨 EST-SSR 引物开发

利用转录测序技术,开发油梨表达序列标签-简单重复序列（EST-SSRs）,为 SSR 标记在油梨种质资源鉴定、 品种选育及遗传连锁图谱构建奠定基础。采用 Illumina 二代测序的技术,共获得 37 639 条无冗余的序列,对其进行 SSR 搜索,共获得 6 419 条简单序列重复（SSR）。利用 Primer 3.0 软件设计 SSR 引物,并以 11 份油梨种质筛选多态性引物。 基于转录组序列开发出的 EST-SSR 的分布频率为 17.05%。在油梨 EST-SSR 中,单核苷、二核苷和三核苷的重复占主 导,占总数的 99.07%。单、二、三核苷酸重复单元分别占总 SSR 的 37.47%、31.80%和 29.80%;出现频率最高的二核 苷酸重复基元是 AG/CT,占总数的 29.15%,出现最高的三核苷酸重复基元为 AAG/CTT,占 12.01%。随机选择 315 个 SSR 位点合成引物,经 11 份油梨种质筛选鉴定,227 对引物可扩增获得产物,有效扩增率为 72.06%;其中 34 对引物 表现出良好多态性,占有效引物的 12.78%,占总引物的 10.79%。在 34 对多态性引物中,每对引物扩增等位基因数 2~12 个。利用高通量测序开发 SSR 引物有较好的实用性,开发获得的 34 个具有多态性的油梨 SSR 标记可用于研究油梨及 其相关近缘物种的遗传变异。     

基于转录组测序的油梨 EST-SSR 引物开发

利用转录测序技术,开发油梨表达序列标签-简单重复序列（EST-SSRs）,为 SSR 标记在油梨种质资源鉴定、品种选育及遗传连锁图谱构建奠定基础。采用 Illumina 二代测序的技术,共获得 37 639 条无冗余的序列,对其进行 SSR搜索,共获得 6 419 条简单序列重复（SSR）。利用 Primer 3.0 软件设计 SSR 引物,并以 11 份油梨种质筛选多态性引物。基于转录组序列开发出的 EST-SSR 的分布频率为 17.05%。在油梨 EST-SSR 中,单核苷、二核苷和三核苷的重复占主导,占总数的 99.07%。单、二、三核苷酸重复单元分别占总 SSR 的 37.47%、31.80%和 29.80%;出现频率最高的二核苷酸重复基元是 AG/CT,占总数的 29.15%,出现最高的三核苷酸重复基元为 AAG/CTT,占 12.01%。随机选择 315 个SSR 位点合成引物,经 11 份油梨种质筛选鉴定,227 对引物可扩增获得产物,有效扩增率为 72.06%;其中 34 对引物表现出良好多态性,占有效引物的 12.78%,占总引物的 10.79%。在 34 对多态性引物中,每对引物扩增等位基因数 2~12个。利用高通量测序开发 SSR 引物有较好的实性,开发获得的 34 个具有多态性的油梨 SSR 标记可用于研究油梨及其相关近缘物种的遗传变异。     

11种热带植物EST-SSR标记的开发和多样性分析

对11种热带植物的640 863条表达序列标签（ESTs）进行分析，发掘出13 916个EST-SSR位点，平均分布频率约为109.37个/Mb，主要特点表现为：（1）不同物种间的EST-SSR丰度存在明显差异，其中菠萝EST-SSR位点最为丰富（201.75个/Mb）；芒果EST-SSR位点丰度最低（49.55个/Mb）；（2）二、三核苷酸基元的SSR最为常见，两者占总数的88.68％。其中，AG/CT、AT/AT和AAG/CTT在不同基因组区域都是占优势的SSR类型；（3）SSR在基因组不同区域分布丰度存在很大差异。其中，麻疯树基因组SSR（gSSR）的丰度是EST-SSR丰度的17倍多；（4）保守基因内AG/CT重复的SSR极其丰富。此外，设计了一批具有物种特异性的EST-SSR PCR引物。     

小麦EST-SSRs分子标记的特性及其遗传作图

为了解普通小麦EST来源的微卫星的多样性,从大约1 000个包含微卫星的ESTs中设计了300对引物,研究和评估了它们的多态性水平,并且将多态性标记加入到现有的遗传图谱中.在五种不同类型的重复单元中,三个碱基的重复单元出现最多,占到77%.几乎所有的EST SSRs标记(99.3%)的重复单元都含有G-C碱基对.37.4%的微卫星都是四次重复.对于扩增和多态性,300对引物中有60对没有扩增,21.3%的扩增引物没能产生预期的扩增片断.58%的标记至少在所用8个材料的一个中显示出多态性.W7984和Opata组合表现出最高的多态性水平.大多数普通小麦EST-SSRs标记的重复次数小于10,并且4次重复是最为普遍的.81个新的EST-SSR位点被添加到两个已有的参照遗传图谱中(62个加到ITMI,19个加到CTCS).研究结果表明小麦EST-SSRs标记展示了一些不同于基因组微卫星的特异特征,在标记发展和其他遗传应用中,这就使得它们能够成为一种非常有价值的资源.