基因Ⅰ型乙型脑炎病毒病毒样颗粒的制备及其对小鼠的免疫原性分析

降低猪场的流行性乙型脑炎（Japanese encephalitis，JE）感染率对于阻断人的JE暴发至关重要，鉴于我国JE防控形势的紧迫性和现有基因Ⅲ型商品化乙型脑炎病毒疫苗对部分基因Ⅰ型乙型脑炎病毒（genotype Ⅰ Japanese encephalitis virus，GⅠ JEV）流行毒株免疫保护的不确定性，急需研制安全高效、成本低廉的新型猪用GI JEV疫苗。本研究在杆状病毒载体pFastBac^TM多克隆酶切位点插入GⅠ JEV的prME基因表达盒，测序验证后的阳性重组质粒转染DH10Bac^TM感受态细胞后获得Bacmid-prME重组杆粒，进一步将其转染至Sf9昆虫细胞后，获得Bac-prME重组杆状病毒。Western blot、间接免疫荧光及电镜观察GⅠ JEV病毒样颗粒组成蛋白表达及病毒样颗粒形成情况，通过小鼠免疫试验初步评价GⅠ JEV病毒样颗粒的免疫原性。Sf9昆虫细胞中prME基因表达盒编码的蛋白得到高效表达，且组装形成病毒样颗粒。病毒样颗粒免疫原性评估结果表明：GⅠ JEV病毒样颗粒可诱导免疫小鼠产生高滴度的乙型脑炎病毒中和抗体。本研究利用杆状病毒昆虫细胞表达系统获得了GⅠ JEV病毒样颗粒，为研制安全高效的乙型脑炎病毒病毒样颗粒亚单位疫苗提供物质基础。     

基因Ⅰ型乙型脑炎病毒病毒样颗粒的制备及其对小鼠的免疫原性分析

降低猪场的流行性乙型脑炎(Japanese encephalitis, JE)感染率对于阻断人的JE暴发至关重要,鉴于我国JE防控形势的紧迫性和现有基因Ⅲ型商品化乙型脑炎病毒疫苗对部分基因Ⅰ型乙型脑炎病毒(genotypeⅠJapanese encephalitis virus, GⅠJEV)流行毒株免疫保护的不确定性,急需研制安全高效、成本低廉的新型猪用GI JEV疫苗。本研究在杆状病毒载体pFastBac~(TM)多克隆酶切位点插入GⅠJEV的prME基因表达盒,测序验证后的阳性重组质粒转染DH10Bac~(TM)感受态细胞后获得Bacmid-prME重组杆粒,进一步将其转染至Sf9昆虫细胞后,获得Bac-prME重组杆状病毒。Western blot、间接免疫荧光及电镜观察GⅠJEV病毒样颗粒组成蛋白表达及病毒样颗粒形成情况,通过小鼠免疫试验初步评价GⅠJEV病毒样颗粒的免疫原性。Sf9昆虫细胞中prME基因表达盒编码的蛋白得到高效表达,且组装形成病毒样颗粒。病毒样颗粒免疫原性评估结果表明:GⅠJEV病毒样颗粒可诱导免疫小鼠产生高滴度的乙型脑炎病毒中和抗体。本研究利用杆状病毒昆虫细胞表达系统获得了GⅠJEV病毒样颗粒,为研制安全高效的乙型脑炎病毒病毒样颗粒亚单位疫苗提供物质基础。     

猪流行性乙型脑炎病毒B细胞多表位抗原的表达及免疫原性分析

流行性乙型脑炎病毒(JEV)可引起猪的繁殖障碍性疾病。本文利用基因重组技术,选取JEV prM/M、E、NS1蛋白的6个B细胞抗原表位,设计B细胞多表位基因,构建原核表达质粒,在大肠杆菌BL21中表达融合重组蛋白rMEP。纯化的rMEP免疫小鼠,通过抗体、中和抗体及亚型检测研究其免疫原性。结果表明,rMEP在上清中高效表达,Western blot结果证实rMEP具有较好的抗原性。在小鼠免疫模型中,rMEP免疫组小鼠血清中产生较高水平的针对rMEP的抗体和特异性中和抗体,且rMEP可诱导产生IgG1和IgG2a抗体,但以IgG1为主。这些结果表明,构建的JEV B细胞多表位蛋白能够刺激小鼠产生较强的体液免疫应答,为研究JEV的多表位疫苗提供新的思路和参考。     

共表达PRRSV GP5和N蛋白重组杆状病毒的构建与鉴定

利用杆状病毒双表达系统构建高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒（HP—PRRSV）N蛋白和GP5蛋白的重组杆状病毒Bac—N—GP5,对重组病毒进行间接免疫荧光、Westernblot分析以及动物免疫试验。结果表明：重组杆状病毒中表达了重组N和GP5蛋白,重组杆状病毒免疫小鼠后产生了抗PRRSVGP5蛋白和N蛋白的特异性抗体。本试验成功构建共表达PRRSVN蛋白和GP5蛋白的重组杆状病毒,为下一步应用该重组杆状病毒作为基因工程亚单位疫苗奠定基础。     

流行性乙型脑炎病毒E蛋白多表位肽在毕赤酵母中分泌表达及其免疫原性研究

为构建流行性乙型脑炎病毒(JEV)E蛋白多表位疫苗,本研究将人工合成的优化后的E蛋白多表位肽(MP)序列克隆入酵母表达载体p PICZα-A,构建分泌型重组酵母表达质粒p PICZ-MP,经SacⅠ酶切线性化后电转化导入毕赤酵母X-33,阳性重组子经甲醇诱导表达,亲和层析纯化重组蛋白(rMP)。通过测定rMP免疫小鼠的抗体水平、抗体亚型、中和抗体和CTL,以评价该多表位疫苗在小鼠模型上的免疫原性。结果表明:成功构建了表达JEV E蛋白多表位抗原的重组酵母菌株X33(pPICZ-MP),能分泌表达多表位肽r MP。纯化后的r MP免疫小鼠产生了较强的体液免疫和细胞免疫反应,其中和抗体水平、CTL活性均与活病毒疫苗组差异不显著(p0.05),且能保护小鼠免受致死量JEV的攻击。构建的JEV E蛋白多表位疫苗具有良好的免疫原性,能够刺激小鼠产生特异性的细胞免疫和体液免疫应答反应,为流行性乙型脑炎多表位疫苗研制提供新的思路。     

水貂细小病毒NS1与VP2蛋白的原核表达及免疫原性分析

为了比较VP2和NS1两种蛋白的免疫原性,选择免疫原性较好的蛋白进行亚单位疫苗制备。本试验分别扩增了水貂细小病毒(mink enteritis virus,MEV)NS1与VP2基因,连接pET-32a表达载体并进行表达,对表达产物进行SDS-PAGE及Western blotting分析。以His-Bind亲和层析柱纯化目的蛋白,将纯化后的蛋白免疫小鼠,分析目的蛋白的免疫原性。经SDS-PAGE与Western blotting鉴定,表明NS1与VP2蛋白大小分别为83 和67 ku,且均具有生物学活性;免疫小鼠后,目的蛋白NS1和VP2均可诱导小鼠产生抗MEV特异性抗体,且VP2蛋白诱导小鼠产生的抗体滴度要高于NS1蛋白。与NS1蛋白比较,VP2蛋白更适合亚单位疫苗的制备。     

日本脑炎病毒prM蛋白的表达及免疫原性分析

日本脑炎是一种由日本脑炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)引起的、经虫媒传播并可导致母猪流产的急性病毒性传染病。JEV的M蛋白参与病毒的感染过程且能诱生具有轻度中和作用的抗体。本研究提取JEV上海分离株的基因组RNA,反转录合成cDNA,RT-PCR扩增该病毒的prM基因片段,亚克隆到原核表达载体pET-28(a)上,构建重组原核表达质粒pET-28(a)-JEV-prM,转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株,IPTG诱导表达重组his-JEV-prM蛋白,SDS-PAGE结果表明,获得分子量大小为24 ku的重组蛋白,主要以包涵体形式表达,薄层扫描分析表明,表达量占总菌体蛋白的30%以上,纯化后获得高纯度重组蛋白,占总蛋白比例达60%以上。纯化蛋白his-JEV-prM免疫BALB/c小鼠,制备了小鼠抗JEV-prM抗体,Westernblotting和间接免疫荧光检测小鼠抗JEV-M抗体的特异性。纯化蛋白能诱导小鼠产生高滴度抗体,并且该抗体能特异识别原核、真核和病毒表达的prM。本研究表达纯化的prM蛋白和小鼠抗prM抗体,为基于M蛋白的疫苗开发、检测JEV的方法及致病机理研究提供了工具。     

猪圆环病毒2型ORF2基因在Sf9细胞中表达及免疫原性研究

利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统表达猪圆环病毒2型(PCV2)核衣壳(Cap)蛋白。将优化合成的PCV2 ORF2基因克隆到杆状病毒转移载体p Fast HTA中,并将鉴定正确的重组质粒p Fast HTA-Cap2转化至大肠杆菌感受态细胞,经蓝白斑筛选得到含有目的基因的重组杆状病毒质粒(r Bac-Cap2),转染至Sf9细胞,获得重组杆状病毒,对感染重组杆状病毒的细胞培养物进行重组蛋白的表达,进行SDS-PAGE和Western blot分析,并对表达的重组蛋白进行小鼠免疫试验及其病毒血清中和试验。SDS-PAGE分析表明,优化合成的PCV2 ORF2基因得到表达,蛋白分子质量大小为33 ku;Western blot证实重组蛋白能够识别抗PCV2阳性血清,表明重组蛋白具有反应原性;小鼠免疫试验结果显示,该蛋白能刺激机体产生特异性抗体,具有较好的免疫原性;病毒血清中和试验证实,抗PCV2 Cap血清抗体具有中和病毒的活性,中和效价为1∶42。该蛋白在杆状病毒系统中的成功表达,为PCV2感染的诊断及亚单位疫苗的研制奠定基础。     

小反刍兽疫病毒(PPRV)F基因在昆虫细胞中的分泌表达及免疫原性研究

试验旨在探索利用杆状病毒表达系统分泌表达小反刍兽疫病毒（peste des petits ruminants virus,PPRV） F基因蛋白及将其作为亚单位疫苗的应用价值。将PPRV F基因克隆到已插入蜂毒信号肽（melittin）的转移载体pFastBacⅠ中,将鉴定正确的重组质粒转化大肠杆菌DH10Bac感受态细胞,经抗性及蓝白斑筛选得到含F基因的重组杆状病毒DNA （F-Bacmid）,转染提取的F-Bacmid DNA至Sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒（F-rBac）,应用无血清培养的High Five细胞进行重组蛋白的表达及条件优化。SDS-PAGE结果表明,重组蛋白在重组杆状病毒感染的High Five昆虫细胞中获得分泌表达,并可产生较高浓度的重组蛋白;Western blotting结果显示,重组蛋白可被PPRV的特异性抗体所识别,表明重组蛋白具有反应原性;应用重组蛋白免疫BALB/c小鼠试验结果显示,该蛋白可刺激小鼠产生较高水平的特异性抗体。本研究成功分泌表达了PPRV F蛋白,该蛋白能够刺激机体产生免疫应答,为小反刍兽疫亚单位疫苗的研制奠定基础。     

乙型脑炎病毒NS1和NS1-2A蛋白的真核表达及其差异性研究

为深入研究乙型脑炎病毒(JEV)NS1和NS1-2A蛋白的表达和免疫效果差异,本试验构建并扩增C-端含Flag标签的NS1和NS1-2A基因,利用T4 DNA连接酶分别连接到质粒pcDNA3.1(+)上,构建重组质粒pcDNA3.1-NS1-Flag和pcDNA3.1-NS1-2A-Flag。将这两种真核表达质粒分别转染BHK-21细胞,利用RT-PCR、IFA和Western blotting检测NS1和NS1-2A蛋白在体外的表达情况,用pcDNA3.1-NS1-Flag、pcDNA3.1-NS1-2A-Flag和pcDNA3.1(+)免疫BALB/c小鼠,检测这两种蛋白在体内的表达差异。结果显示,试验成功构建了NS1和NS1-2A基因的真核表达载体pcDNA3.1-NS1-Flag和pcDNA3.1-NS1-2A-Flag,IFA和Western blotting鉴定NS1和NS1-2A蛋白成功表达,重组质粒pcDNA3.1-NS1-Flag和pcDNA3.1-NS1-2A-Flag免疫小鼠后可诱发机体产生特异性体液免疫,pcDNA3.1-NS1-2A-Flag联合免疫组小鼠血清抗体效价和INF-γ细胞因子分泌水平比pcDNA3.1-NS1-Flag免疫组高,且与pcDNA3.1(+)空载体免疫组差异极显著(P0.01);pcDNA3.1-NS1-Flag和pcDNA3.1-NS1-2A-Flag免疫组小鼠体内的INF-γ分泌量会增多,免疫第4周达到最高后逐渐降低。pcDNA3.1-NS1-Flag和pcDNA3.1-NS1-2A-Flag免疫小鼠能够刺激JEV特异性抗体的分泌和增强机体的细胞免疫功能,且NS1-2A联合基因的免疫效果优于NS1单一基因,为进一步研究JEV的非结构蛋白功能、研发NS1和NS1-2A基因疫苗奠定基础。     

新疆天康将推出三款猪用疫苗

<正>猪圆环病毒2型重组杆状病毒亚单位灭活疫苗由新疆天康畜牧生物技术股份有限公司技术中心研制的猪圆环病毒2型重组杆状病毒亚单位灭活疫苗,是应用分子生物学技术将猪圆环病毒2型Cap基因重组于杆状病毒内,在昆虫细胞上培养表达PCV2-r Cap蛋白而制成的亚单位疫苗。该疫苗与市场使用的猪圆环病毒2型全病毒灭活疫苗相比,具有极其显著的特点:(1)以当前的优势基因型毒株PCV2b基因序列做参考,经杆状病毒系统表达出类似病毒样颗粒(VLPs)的蛋白,抗原的     

杆状病毒表达系统融合表达猪圆环病毒2型Cap蛋白与口蹄疫病毒VP1蛋白及免疫原性评估

猪圆环病毒2型(porcine circovirus type 2,PCV2)Cap蛋白是病毒的主要结构蛋白,能诱导宿主产生特异性免疫应答。口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus,FMDV)VP1蛋白是病毒的主要免疫原性蛋白,能刺激机体产生中和抗体。利用杆状病毒表面展示系统,将这2种病毒蛋白与猪CD40配体(CD40 ligand,CD40L)进行融合表达并展示在杆状病毒表面,构建了rv Ac-Cap、rv Ac-VP1和rv Ac-Cap-VP1 3种重组杆状病毒。通过SDS-PAGE和Western blotting检测3种重组杆状病毒感染的Sf9细胞总蛋白,证明3种融合蛋白成功表达。纯化的重组杆状病毒颗粒以1×108pfu/只的剂量免疫接种BALB/c小鼠,通过间接ELISA检测血清中Cap和VP1的抗体浓度,证明表面展示有Cap和VP1的重组杆状病毒能激发小鼠产生较高水平的抗体,与PCV2和FMDV商品化疫苗免疫组的抗体浓度差异不显著(P0.05),表明该重组杆状病毒具有较好的免疫原性。     

日本脑炎病毒NS3基因截短表达及其在神经细胞定位研究

根据GenBank发表的日本脑炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)基因序列,合成用于克隆编码病毒NS3蛋白C端的基因片段(955~1857 bp)的引物。从感染JEV的细胞样品中,采用RT-PCR扩增出大小约900 bp的目的片段,插入到pET-28a(+)表达载体,诱导表达出NS3C蛋白。将该重组蛋白免疫小鼠制备NS3C抗血清,通过间接免疫荧光和Western blot验证,该抗血清能特异识别JEV感染Vero细胞中的NS3蛋白。使用该抗血清研究了JEV在神经细胞内的亚定位,发现NS3主要定位于JEV感染的神经细胞的胞浆中,并在细胞核周围分布明显。     

猪乙型脑炎病毒E蛋白结构域Ⅲ原核表达和抗原性分析

为分析猪乙型脑炎病毒(JEV)E蛋白Ⅲ结构域的抗原性,本研究克隆了JEV疫苗株SA14-14-2的E蛋白结构域Ⅲ,并通过pET-28a载体进行融合表达和纯化。用纯化后蛋白作为免疫原,免疫8周龄BALB/c小鼠,通过SDS-PAGE、Western blotting、间接ELISA及间接免疫荧光方法(IFA)检测小鼠及猪抗体滴度,验证E蛋白结构域Ⅲ的抗原性。SDS-PAGE结果表明融合蛋白以包涵体形式表达;Western blotting、间接ELISA检测结果表明表达产物具有良好的抗原性;纯化的蛋白免疫BALB/c小鼠ELISA方法检测特异性抗体滴度可达1×10⁵;猪JEV阳性血清ELISA抗体滴度可达5.1×10⁴;IFA结果表明JEV E Ⅲ蛋白产生的抗血清能很好的识别乙型脑炎病毒抗原。以上结果表明,表达、纯化的重组JEV E Ⅲ蛋白具有良好的抗原性。本试验结果为建立以E蛋白结构域为抗原的诊断方法提供了重要依据。     

猪Ⅱ型圆环病毒ORF2截短基因的表达纯化及动物免疫试验

在最佳诱导条件下获得猪圆环病毒Ⅱ型（PCV2）重组Cap蛋白,表达产物经可溶性分析表明该重组蛋白主要以包涵体形式存在。大量诱导表达重组Cap蛋白,利用His Bind蛋白质纯化试剂盒对表达产物进行纯化,通过Western blotting检测证明表达产物具有良好的免疫原性。用该纯化的重组蛋白作为亚单位疫苗,与本实验室所构建保存的pcDNA3.1-ORF2分别免疫BALB/c小鼠,对亚单位疫苗和基因疫苗做了对比试验,为进一步研制PCV2基因工程苗奠定良好的基础。     

猪圆环病毒Cap蛋白的分泌表达及其免疫原性研究

探索利用杆状病毒表达系统(Bac-to-Bac expression system)分泌表达猪圆环病毒2型(PCV2)Cap蛋白及将其作为亚单位疫苗的应用价值。将PCV2 Cap基因克隆到已插入蜂毒信号肽(Melittin)的转移载体pFastBacⅠ中,将鉴定正确的重组质粒(pFastBAC-Cap)转化至DH10Bac大肠杆菌感受态细胞,经抗性及蓝白斑筛选得到含Cap基因的重组杆状病毒DNA(Bacmid-Cap),转染提取的Bacmid-Cap DNA转染至sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒(rBac-Cap),应用无血清培养的High Five细胞进行重组蛋白的表达及条件优化。重组蛋白通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分析(SDS-PAGE)证明:在重组杆状病毒感染的High Five昆虫细胞中获得分泌表达,并可产生较高浓度的重组蛋白;Western blotting结果显示:重组蛋白可被猪PCV2的特异性抗体所识别,表明重组蛋白具有反应原性;应用重组蛋白免疫BALB/C小鼠试验结果显示:该蛋白可刺激小鼠产生较高水平的特异性抗体。该研究成功分泌表达了PCV2 Cap蛋白,该蛋白能够刺激机体产生免疫应答,为PCV2亚单位疫苗的研制打下基础。     

表达鸡传染性支气管炎病毒S1蛋白的重组假型杆状病毒对SPF鸡的免疫原性分析

本研究旨在对本实验室所构建的表达鸡传染性支气管炎病毒(IBV) S1蛋白的重组假型杆状病毒(Ac-V-S1)的免疫保护效果进行探讨.以2×109 pfu剂量的重组假型杆状病毒(Ac-V-S1)腿部肌肉注射7日龄SPF雏鸡,21日龄加强免疫1次.血清抗体检测表明,灭活疫苗组诱导的IBV特异性ELISA抗体水平最高,极显著高于其它试验组(P＜0.01),其次是Prime-boost组(先免疫Ac-V-S1后免疫poly156S1亚单位疫苗)和Ac-V-S1组;但在细胞免疫水平方面,Ac-V-S1免疫组表现出较强的优势,免疫应答反应极显著的高于其它免疫组(P＜0.01),然后是Prime-boost组和杆状病毒野毒对照组.二免后2周用IBV M41强毒进行攻毒保护试验.结果表明,Ac-V-S1、Ac-V-EGFP、poly156S1亚单位疫苗组的保护率分别为55％(6/11)、27％(3/11)、37％(4/11),而采用Prime-boost免疫组的保护率为64％(7/11),略低于免疫保护率为73％的常规灭活疫苗(8/11).结果显示:重组杆状病毒Ac-V-S1具有较好的免疫效果,而且在细胞免疫方面具有较强优势,可以弥补重组杆状病毒在体液免疫水平的不足,而Prime-boost免疫策略能更进一步提高重组杆状病毒免疫效果,为将重组杆状病毒发展为经济有效的IBV基因工程疫苗奠定基础.     

表达猪圆环病毒2型Cap蛋白的重组杆状病毒的构建及鉴定

利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统成功表达了猪圆环病毒2型Cap蛋白,并对该蛋白的生物活性进行鉴定。PCR获得Cap基因并克隆入pFastBacTMⅠ载体质粒,重组质粒pFastBacⅠ-Cap转化DH10Bac感受态细胞,通过蓝白斑筛选获得重组杆粒rBacmid-Cap。以脂质体法将重组杆粒转染对数生长期的Sf9细胞,获得重组杆状病毒。电镜下可见典型的杆状病毒,SDS-PAGE显示,重组病毒表达的Cap蛋白约28ku,间接免疫荧光试验证明,Cap蛋白良好表达并具有免疫反应性,为猪圆环病毒亚单位疫苗的研究奠定了基础。     

猪丹毒杆菌SpaA优势表位的串联表达及其免疫效果分析

目的 构建串联SpaA优势表位的丹毒亚单位疫苗,并对其免疫原性进行研究。方法 将丹毒杆菌表面保护抗原A优势表位串联表达,提取并经亲和层析纯化获得重组蛋白,制备亚单位疫苗,免疫小鼠和猪,21日后攻毒。结果 成功制备串联SpaA优势表位的丹毒亚单位疫苗,2μg重组蛋白可为小鼠抵抗1000MLD强毒攻击提供100%保护,100μg重组蛋白可为猪抵抗1MLD强毒攻击提供100%保护,可为猪抵抗2MLD强毒攻击提供67%保护。结论 串联SpaA优势表位的丹毒亚单位疫苗具有良好的免疫原性,高于商品化疫苗保护标准。     

迟缓爱德华菌外膜蛋白OmpA原核表达及其免疫原性研究

为研究迟缓爱德华菌外膜蛋白OmpA免疫保护性,本研究利用PCR方法扩增迟缓爱德华菌ompA基因,构建重组载体pET-32a-ompA,将其转化大肠杆菌BL21后诱导表达,表达产物经SDS-PAGE和western blot分析显示,重组蛋白大小约58 ku;将纯化的重组蛋白免疫小鼠后,以迟缓爱德华菌强毒株ET-13攻毒,结果显示该重组蛋白对免疫组小鼠具有保护力,保护率为55%。本研究克隆了迟缓爱德华菌ompA基因并表达了相应重组蛋白,免疫小鼠后能够提供一定保护,为重组OmpA蛋白亚单位疫苗的研制奠定基础。