猪血凝性脑脊髓炎病毒感染可激活脑内的小胶质细胞

以猪血凝性脑脊髓炎病毒(PHEV)易感的BALB/c小鼠为实验动物模型,以小胶质细胞表面特异性标记物Iba1蛋白为检测对象,利用荧光定量PCR、Western-blot、免疫组化等方法,分别从基因转录水平、蛋白水平和组织学水平对PHEV感染后不同时间点小鼠脑内小胶质细胞的增殖、活化情况进行了检测分析。结果表明,与对照组相比,试验组小鼠脑组织内的Iba1基因转录水平、蛋白表达量均有升高,且都随着感染时间延长而增大。将采集的小鼠脑组织制作石蜡切片,免疫组化结果证实PHEV的感染激活了小胶质细胞,表现为细胞数量增多,呈聚集样分布;同时细胞形态变化也很明显,胞体变大并呈阿米巴状。上述试验证实PHEV感染小鼠后小胶质细胞发生了明显增殖、活化现象,为后期深入开展PHEV所致神经系统炎性损伤的机制研究奠定了基础。     

猪血凝性脑脊髓炎病毒抑制神经细胞干扰素的产生

猪血凝性脑脊髓炎病毒(PHEV)属于β属冠状病毒成员,其具有典型的嗜神经性。多种冠状病毒可逃避宿主先天性免疫的识别而表现出明显的致病性,但宿主的先天性免疫在PHEV感染过程中发挥的作用还不是很清楚。为了明确神经细胞在PHEV感染过程中细胞自身的免疫应答状况,本研究对参与先天性免疫的重要炎性细胞因子和相关的通路变化情况进行了检测分析。用酶联免疫吸附试验(ELISA)方法对PHEV感染小鼠脑神经瘤母细胞(N2a)不同时间点的样品进行检测,结果证明没有IFN-β的表达,说明PHEV不能引起神经细胞产生Ⅰ型IFN。收集感染N2a细胞24h的上清,ELISA方法检测TNF-α、IL-1β、IL-6和IFN-γ的分泌情况,仅有IL-6呈现高水平表达,说明PHEV感染N2a细胞诱发了IL-6的先天性免疫反应。免疫荧光方法检测PHEV感染N2a细胞24h后重要核转录因子IRF-3和NF-κB的核定位情况,发现NF-κB移位到了胞核,IRF-3仍然存在于胞浆,说明PHEV仅激活了NF-κB信号通路。以上试验结果表明,PHEV进入中枢神经系统时可逃避神经细胞以IFN-β为主的免疫识别,该结果可为深入开展PHEV抑制机体干扰素产生的机制研究奠定基础。     

LncRNA-NONMMUT131476.1对PHEV复制的影响及其靶基因Nlrc5的验证

长链非编码RNA(long non-coding RNA,LncRNA)是长达200个以上核苷酸的转录本,在不同组织和发育阶段的表达具有特异性。为筛选与猪血凝性脑脊髓炎病毒(porcine hemagglutinating encephalomyelitis virus,PHEV)致小鼠神经系统损失相关的LncRNA,本试验对正常小鼠和PHEV感染小鼠大脑皮质进行高通量测序,获得PHEV感染过程中LncRNA差异表达数据。经过生物学分析,发现与PHEV感染相关的LncRNA-NONMMUT131476.1位于小鼠第8号染色体Herpud1(homocysteine-inducible,endoplasmic reticulum stress-inducible,ubiquitin-like domain member 1)和Nlrc5(NLR family,CARD domain containing 5)两基因间,由5个外显子构成。利用qPCR方法对感染PHEV的小鼠脑组织和N2a细胞中LncRNA-NONMMUT131476.1及Nlrc5基因的表达量进行检测,发现LncRNA-NONMMUT131476.1和Nlrc5基因的表达量均呈上调。研究发现干扰LncRNA-NONMMUT131476.1后Nlrc5表达被抑制,表明Nlrc5可能为其潜在靶基因。同时,沉默LncRNA-NONMMUT131476.1表达能促进病毒复制增殖,表明该LncRNA可能作为调节因子,参与调控PHEV感染过程,但其具体机制有待于进一步研究。本试验为PHEV感染发病机制和PHEV防制研究提供新思路。     

猪血凝性脑脊髓炎病毒感染降低ZO-1表达致小鼠血脑屏障通透性升高

为明确猪血凝性脑脊髓炎病毒(porcine hemagglutinating encephalomyelitis virus,PHEV)感染后对机体血脑屏障(blood-brain barrier,BBB)通透性的影响,本试验以PHEV易感的BALB/c小鼠为实验动物模型,将PHEV接种小鼠后静脉注射伊文氏蓝(Evans blue,EB),运用形态学和化学定量方法检测EB通过BBB进入脑组织的状况。结果显示,接种病毒后3d的小鼠脑组织即出现肉眼可见的蓝色,定量检测结果证实其含量随着感染时间的延长而增加。同时利用荧光定量PCR和Western blot方法分别对病毒感染后不同时间点紧密连接蛋白ZO-1、Occludin和Claudin-5进行核酸定量检测,证明感染组小鼠脑组织中ZO-1的基因转录水平随感染时间延长下调明显,而Occludin和Claudin-5的变化不明显。进而对脑组织中ZO-1蛋白表达水平进行检测,证实ZO-1的蛋白表达水平也发生下调,表明内皮细胞紧密连接完整性在病毒感染后期遭到了破坏。上述试验结果证实PHEV感染机体后可使BBB的通透性升高,而且这一变化与ZO-1的降低相关,为后期深入开展PHEV所致神经系统炎性损伤的机制奠定基础。     

脑心肌炎病毒VP3蛋白抑制I型干扰素信号通路促进病毒体外增殖的研究

天然免疫是抵抗病原微生物感染的第一道防线，为探究病毒蛋白在脑心肌炎病毒感染引起的天然免疫应答过程中的作用机制以及对病毒体外复制的影响，本研究应用分子生物学技术构建结构蛋白VP3的表达载体p CMV-Myc-VP3，转染HEK293细胞后，使其在细胞内过表达；感染病毒后，通过实时荧光定量PCR和TCID50分别检测病毒的基因组拷贝数和病毒滴度，以此验证VP3蛋白表达对EMCV体外增殖的影响；另通过荧光定量PCR检测VP3过表达对EMCV引起的IFN-β和信号通路相关因子m RNA转录水平的影响。结果表明，VP3蛋白可促进EMCV在HEK293细胞内的增殖，初步探索发现VP3蛋白可显著抑制IFN-β的表达。WesternBlot检测发现体外表达VP3后，MAVS蛋白的表达明显减少，但对MDA5表达无影响。试验数据初步表明，VP3蛋白可以通过抑制MAVS的表达拮抗I型IFN信号通路的活化，进而促进病毒增殖。     

猪血凝性脑脊髓病毒在J774A.1细胞中的增殖特性及炎性因子表达

为了探讨宿主巨噬细胞(J774A.1细胞)在猪血凝性脑脊髓炎病毒(Procine hemagglutinatin encephalomyelitis virus,PHEV)感染过程中的作用及其参与炎性反应的应答特征,本研究通过CPE观察、TCID50、免疫荧光(IFA)、ELISA和PT-PCR等方法,对PHEV感染J774A.1细胞的增殖特性及炎性因子IL-6、TNF-a、IL-1β等mRNA转录水平和蛋白水平的表达情况进行检测分析。IFA的检测结果显示,感染后8h后仅有少量的被荧光抗体标记细胞出现绿色荧光,随着感染时间的延长,荧光标记的细胞逐渐增加,直至感染后32~40h出现大量细胞出现荧光。TCID50结果显示,PHEV感染滴度的增值趋势与mRNA含量的变化基本一致,在感染后24~32h增殖速度最快,至32h病毒感染滴度达到最高。荧光定量RT-PCR结果显示,PHEV感染可诱导J774A.1细胞分泌的TNF-a、IL-6、IL-1βmRNA转录水平均显著升高,尤其IL-6mRNA的表达量显著增加,在48h达到对照组的25倍;TNF-αmRNA的表达量在感染后8h内增加为对照组的4倍,随后一直维持较高水平。ELISA结果显示,TNF-a、IL-6、IL-1β蛋白水平表达也显著增加。上述研究结果表明,PHEV不仅可以感染J774A.1细胞,而且能诱导其分泌多种细胞因子参与免疫应答,为进一步阐明机体重要免疫细胞在PHEV过程中的作用奠定了基础。     

miR-21a-5p对PHEV复制的影响及其靶基因Cntfr的验证

为研究猪血凝性脑脊髓炎病毒(PHEV)感染过程中宿主miR-21a-5p对PHEV复制的影响,利用荧光定量PCR方法对PHEV感染过程中细胞内miR-21a-5p的表达变化进行了检测;之后,将化学合成的miR-21a-5p模拟体或抑制剂转染N2a细胞,接种PHEV后利用荧光定量PCR方法检测PHEV基因组RNA的含量。通过TargetScan、Microcosm和Miranda数据库预测miR-21a-5p的靶基因,并利用双荧光素酶报告系统对预测的靶基因进行验证。结果显示,PHEV感染N2a细胞后,miR-21a-5p的表达量明显升高。而有效抑制N2a细胞中miR-21a-5p的表达会使PHEV复制增殖显著下降;反之,miR-21a-5p过表达能使PHEV表达量升高。此外,生物信息学分析表明,miR-21a-5p可能在PHEV感染致病过程中参与了细胞免疫、神经损伤等过程。而预测靶基因Cntfr为CNTF受体,具有维持神经细胞形态和功能完整性的作用,并进一步利用双荧光素酶报告系统证实Cntfr为miR-21a-5p的靶基因。总之,miR-21a-5p在PHEV致病过程中具有极其重要的调控作用,影响PHEV的复制增殖,并具有直接靶向Cntfr基因维持神经细胞稳态的作用。研究结果不仅为miRNA参与调控PHEV复制提供数据支持,也为深入研究PHEV的致病机制提供新的思路。     

猪源脑心肌炎病毒GXLC株对小鼠的致病性试验

为研究猪源脑心肌炎病毒(EMCV)GXLC株对小鼠的致病性,将其接种4周龄健康BALB/c小鼠,观察临床症状,检查病理变化,测定心重/体重比值,检测心脏、脑、脾脏组织及血清中病毒含量,检测心脏、脑、脾脏组织中细胞因子IL-1β、TNF-α、IL-6 mRNA表达水平及血清中IL-1β、TNF-α蛋白含量。结果显示,感染小鼠出现明显的临床症状,感染后第4天开始死亡,第5~7天死亡达到高峰;心脏、脑出现典型的大体病理变化和组织病理学变化,心重/体重比值显著升高、组织病理学炎症分值显著增加;感染后第1天即可在心脏、脑、脾脏及血清中检测到大量病毒,直至第14天仍能检测到病毒;血清中IL-1β、TNF-α蛋白含量显著升高,心脏、脑、脾脏组织中IL-1β、TNF-α、IL-6 mRNA表达水平显著上调,而且细胞因子表达的高峰期与出现明显临床症状、严重病理损害及死亡高峰期密切相关。结果表明,猪源EMCV GXLC株对小鼠具有高度致病性,IL-1β、TNF-α、IL-6等促炎细胞因子在EMCV对小鼠的致病机制中发挥重要作用。     

自噬相关蛋白Beclin-1对PHEV复制增殖的影响

首先利用荧光定量PCR和Western blot的方法分别从基因水平和蛋白表达水平检测猪血凝性脑脊髓炎病毒(porcine hemagglutinating encephalomgelitis virus,PHEV)感染细胞对Beclin-1的影响,结果发现随着PHEV感染时间的增加Beclin-1表达呈现明显的上调趋势。其次,利用间接免疫荧光技术检测Beclin-1在PHEV感染后的N2a细胞中的定位变化,发现Beclin-1和PHEV呈现明显的共定位关系。随后构建Beclin-1的真核表达载体pCMV-FlagBeclin-1,将其转染至N2a细胞后接种PHEV,发现PHEV复制增殖特性并未受到显著影响。利用siRNA技术特异性敲低N2a细胞中的Beclin1水平,结果显示PHEV的表达量明显下调。本试验结果揭示了Beclin-1参与调控PHEV复制增殖的重要作用,为深入阐明PHEV致病机制提供了新的思路。     

细胞自噬与猪流行性腹泻病毒相互作用的研究进展

猪流行性腹泻病毒（PEDV）是冠状病毒科甲型冠状病毒属的一种有囊膜的单股正链RNA病毒，对全世界养猪业造成了巨大的损失。PEDV与宿主之间的致病机制和免疫调节相互作用仍不清楚。有研究表明冠状病毒可以诱导细胞发生自噬，并且与病毒的复制有着密切的联系，病毒与细胞自噬之间的关系十分复杂，虽然病毒感染与细胞自噬之间的关系研究比较广泛，但细胞自噬在PEDV感染中的作用报道较少。研究PEDV与细胞自噬的相互作用可以加速对PEDV感染入侵机制的理解，为未来研究病毒治疗和抗病毒药物提供新的思路。     

HEK-293T细胞敲除TRIM25基因促进脑心肌炎病毒复制的研究

为了探究三方基序蛋白25(TRIM25)对脑心肌炎病毒(encephalomyocarditis virus,EMCV)增殖的影响，在HEK-293T细胞上使用簇状规则间隔的短回文重复序列(CRISPR/Cas9)基因编辑技术敲除TRIM25基因，并通过PCR测序和Western blot确认敲除效果，然后观察敲除细胞形态并利用试剂盒测定TRIM25缺失后细胞增殖速度的变化，确认敲除细胞与野生细胞无明显差异，用EMCV感染敲除细胞后，采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)、病毒滴定测定和Western blot等方法测定病毒基因转录水平、蛋白表达情况。结果显示：感染EMCV后，敲除细胞与野生细胞相比，显著促进了病毒的转录水平、病毒蛋白的翻译水平和子代病毒的毒力(P<0.05)。综上，在HEK-293T细胞上，成功构建TRIM25缺失细胞系，且试验表明TRIM25的缺失有助于EMCV的复制。研究结果为后续TRIM25抗病毒机制研究提供了理论依据。     

核孔复合体在病毒入核机制中的作用研究进展

病毒与宿主间的相互作用是病原感染与机体防御机制之间的激烈战争。当病毒入侵机体并进入宿主细胞后,宿主细胞的遗传物质将被其挟持以完成病毒的自我复制和传播,因此辅助病毒复制的宿主因子是影响病毒复制的重要因素;而对于核内复制的病毒来说,病毒基因组入核是其复制的关键。大量研究表明核孔复合体蛋白在病毒复制中发挥着重要作用,因此全面系统地了解细胞与病毒蛋白之间的相互作用,可为开发新型高效抗病毒药物提供新的思路和视角。本研究根据近年来对病毒入核机制的研究进展,概述核孔复合体的结构特征,细胞核转运过程,病毒入核的多种策略以及核孔复合体和相关核孔蛋白在其中发挥的作用等方面,为相关病毒防治研究提供系统深入的理论基础。     

细胞自噬与猪流行性腹泻病毒相互作用的研究进展

猪流行性腹泻病毒（PEDV）是冠状病毒科甲型冠状病毒属的一种有囊膜的单股正链RNA病毒,对全世界养猪业造成了巨大的损失。PEDV与宿主之间的致病机制和免疫调节相互作用仍不清楚。有研究表明冠状病毒可以诱导细胞发生自噬,并且与病毒的复制有着密切的联系,病毒与细胞自噬之间的关系十分复杂,虽然病毒感染与细胞自噬之间的关系研究比较广泛,但细胞自噬在PEDV感染中的作用报道较少。研究PEDV与细胞自噬的相互作用可以加速对PEDV感染入侵机制的理解,为未来研究病毒治疗和抗病毒药物提供新的思路。 [关键词] 猪流行性腹泻病毒|细胞自噬|相互作用     

猪血凝性脑脊髓炎病原学特征及检测技术研究进展

猪血凝性脑脊髓炎是由猪血凝性脑脊髓炎病毒(PHEV)感染引起的一种以仔猪呕吐、衰竭或显著神经症状为主要特征的急性、高度接触性传染病,给世界养猪业造成了严重经济损失。本文阐述了PHEV的发现、分类地位、形态特征、理化特性、基因组结构及功能、培养特性、流行病学与致病性等,介绍了PHEV检测方法,包括病毒分离与鉴定、血凝/血凝抑制试验等6种血清学方法,以及RT-PCR等3种分子生物学方法,以期为该病诊断和防控提供参考。     

猪宿主蛋白G3BP1对猪圆环病毒2型在PK15细胞上复制的影响

猪宿主蛋白G3BP1在宿主抵抗病毒感染过程中起着重要作用,然而还未有相关报道G3BP1与猪圆环病毒2型(PCV2)感染过程中的联系。本文构建了G3BP1真核表达载体和干扰RNA,实现在PK15细胞上G3BP1的过表达及敲低。结果发现,PCV2感染细胞24 h后病毒复制出现显著差异,感染48 h相比于感染24 h病毒复制差异更显著,表明G3BP1能显著促进PCV2复制。过表达或敲低G3BP1后,用干扰素刺激DNA(ISD)刺激12 h,G3BP1能促进ISD诱导IFN-βmRNA的表达;感染PCV212 h后,G3BP1也能正调控IFN-βmRNA的转录。本文揭示了宿主蛋白G3BP1显著促进PCV2的复制,很可能是通过上调IFN-β表达引起的。     

新城疫病毒M蛋白细胞核定位的机制与功能研究进展

新城疫病毒（Newcastle disease virus,NDV）M蛋白一种非糖基化膜相关蛋白,主要位于病毒囊膜内表面,构成了病毒囊膜和核衣壳连接的支架。研究表明,M蛋白是一种细胞核-细胞质穿梭蛋白。在NDV感染早期,M蛋白可通过自身携带的核定位信号进入细胞核。根据已报道的相关RNA病毒M蛋白功能的研究结果,推测NDV M蛋白早期的细胞核定位有利于细胞质中病毒基因组的复制和转录,并且可能会抑制细胞基因的转录和蛋白质合成。目前,国内外对M蛋白的研究主要集中在M蛋白与NDV毒力和复制的关系以及以M蛋白为核心的病毒样颗粒形成机制和利用方面,而对M蛋白细胞核定位的机制和功能研究相对较少。鉴于M蛋白细胞核定位在NDV复制和致病过程中的重要作用,本文主要从NDV M蛋白的细胞定位特征、M蛋白细胞核定位的分子机制和功能方面进行阐述,以期为NDV M蛋白细胞核定位的功能及其作用机制研究提供理论参考。     

猴头菇多糖对MDRV感染RAW264.7细胞TLR3/TRIF诱导表达及病毒复制的影响

试验旨在探究猴头菇多糖（HEP）预处理RAW264.7细胞对番鸭呼肠孤病毒（MDRV）复制的影响及其机制,从Toll样受体3/β干扰素TIR结构域衔接蛋白（TLR3/TRIF）信号通路解析HEP在调节MDRV所致的雏番鸭机体免疫抑制中的作用机制并提供体外试验参考。试验设空白对照组（BCG）、病毒感染对照组（VCG）、HEP对照组（HCG）和HEP预防病毒感染组（HPG）,RAW264.7细胞在MDRV感染12和24 h后,通过Western blotting检测各组细胞中TLR3、TRIF和肿瘤坏死因子受体相关因子6（TRAF6）的蛋白表达量;病毒感染24 h后,用ELISA法检测各组细胞培养液中肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白介素-10（IL-10）、IL-6、IL-1β、干扰素-β（IFN-β）的含量。TCID₅₀检测结果表明,MDRV病毒的TCID₅₀为10^3.46。病毒感染后12 h,细胞未出现明显变化;病毒感染后24 h,细胞变圆;病毒感染后36 h,细胞大量死亡。MDRV在RAW264.7细胞中的复制结果显示,在感染病毒12~24 h内,σNS的表达量呈现上升趋势;在24~36 h,σNS的表达量维持在较高水平。Western blotting结果显示,与空白对照组相比,VCG组细胞TLR3、TRIF和TRAF6蛋白的表达量在感染后12和24 h均显著升高（P<0.05）,HCG组TRIF蛋白的表达量均显著升高（P<0.05）;与感染组相比,HPG组的σNS、TLR3、TRIF和TRAF6蛋白表达量在病毒感染12和24 h均显著降低（P<0.05）。ELISA检测结果显示,与空白对照组相比,VCG组细胞培养液中TNF-α、IL-6、IL-1β和IFN-β的含量均显著升高（P<0.05）;与感染组相比,HPG组细胞培养液中TNF-α、IL-6、IL-1β含量均显著降低（P<0.05）,IFN-β的含量显著升高（P<0.05）。结果表明,HEP可调节MDRV感染诱导RAW264.7细胞TLR3信号转导通路活化,抑制TLR3信号转导通路下游产物TNF-α、IL-10、IL-6和IL-1β的过度表达,同时上调IFN-β的表达,从而抑制MDRV在RAW264.7细胞中的复制。     

GADD45β蛋白抑制ALV-J在DF-1细胞中的复制

生长阻滞和DNA损伤诱生蛋白45β（growth arrest and DNA damage 45β，GADD45β）参与多种细胞信号通路，在病毒感染过程中发挥重要作用，但在禽白血病病毒（avian leukosis virus，ALV）感染中研究较少。本研究中，用J亚群禽白血病病毒（ALV-J）感染DF-1细胞，通过荧光定量PCR和Western blot检测GADD45β表达水平。此外，在过表达GADD45β和干扰GADD45β的情况下，通过Western blot、间接免疫荧光试验和ELISA检测GADD45β对ALV-J复制的影响。结果表明，ALV-J感染DF-1细胞能显著上调GADD45β表达水平（P<0.05）。过表达GADD45β后，ALV-J的蛋白表达水平显著降低（P<0.05），荧光信号强度也明显低于对照组。然而，干扰GADD45β后，ALV-J的复制水平显著上调（P<0.05），说明GADD45β可以抑制ALV-J病毒复制。本研究首次发现GADD45β具有抑制ALV-J病毒复制的功能，为抗ALV-J的研究提供了新的思路和理论基础。     

脑心肌炎病毒及其蛋白结构和功能研究进展

脑心肌炎病毒(EMCV)是一种重要的人畜共患病病原,高危感染动物是猪,自然宿主是啮齿动物,人也可以感染这种病毒。也有研究报道,病毒可分解为前体蛋白P1、P2、P 3和L蛋白,最终切割成11个蛋白终产物,其中VP1蛋白存在主要抗原表位,具有良好的中和作用。目前尚不能阐明病毒感染后的发病机制,宿主感染病毒的影响因素等。因此,对病毒特性进行的研究有助于对该病的预防及控制,对病毒基因组及它所编码蛋白的结构与功能的研究对新型疫苗及动物机体的抗感染免疫机制的研究有重要的生物学作用。论文综述了脑心肌炎病毒基因组结构及其编码蛋白的结构和功能。     

细胞自噬与小RNA病毒相互作用分子机制研究进展

细胞自噬是真核生物中普遍存在的、对细胞内物质进行循环更新,维持内环境稳态的一种自我保护机制。近年研究表明,细胞自噬能够参与小RNA病毒的感染过程,小RNA病毒感染细胞时,快速激活自噬途径,自噬可以通过递呈病毒抗原发挥抗病毒天然免疫功能;同时自噬体为部分小RNA病毒提供复制相关蛋白质和非细胞裂解性释放途径,促进病毒的复制。论文对近年来小RNA病毒感染和细胞自噬相互作用的研究进展进行综述,为进一步阐明小RNA病毒参与自噬调节的作用机制提供参考。