体细胞克隆太湖猪出生

以中国太湖猪胎儿成纤维细胞为核供体,以体外成熟卵母细胞为核受体,以杜洛克猪为代孕母猪,进行了太湖猪体细胞克隆技术的研究,成功地获得了首例体细胞克隆太湖猪仔猪.经微卫星DNA多态性鉴定,确定克隆猪来自供核细胞,与代孕母猪无亲缘关系.本研究将为体细胞克隆技术在我国太湖猪育种、建立人类疾病模型等研究方面提供可行的技术方法.     

LncRNA-NONMMUT131476.1对PHEV复制的影响及其靶基因Nlrc5的验证

长链非编码RNA(long non-coding RNA,LncRNA)是长达200个以上核苷酸的转录本,在不同组织和发育阶段的表达具有特异性。为筛选与猪血凝性脑脊髓炎病毒(porcine hemagglutinating encephalomyelitis virus,PHEV)致小鼠神经系统损失相关的LncRNA,本试验对正常小鼠和PHEV感染小鼠大脑皮质进行高通量测序,获得PHEV感染过程中LncRNA差异表达数据。经过生物学分析,发现与PHEV感染相关的LncRNA-NONMMUT131476.1位于小鼠第8号染色体Herpud1(homocysteine-inducible,endoplasmic reticulum stress-inducible,ubiquitin-like domain member 1)和Nlrc5(NLR family,CARD domain containing 5)两基因间,由5个外显子构成。利用qPCR方法对感染PHEV的小鼠脑组织和N2a细胞中LncRNA-NONMMUT131476.1及Nlrc5基因的表达量进行检测,发现LncRNA-NONMMUT131476.1和Nlrc5基因的表达量均呈上调。研究发现干扰LncRNA-NONMMUT131476.1后Nlrc5表达被抑制,表明Nlrc5可能为其潜在靶基因。同时,沉默LncRNA-NONMMUT131476.1表达能促进病毒复制增殖,表明该LncRNA可能作为调节因子,参与调控PHEV感染过程,但其具体机制有待于进一步研究。本试验为PHEV感染发病机制和PHEV防制研究提供新思路。     

真核表达载体pIRES2-EGFP-V13KL的构建及在COS-7细胞和小鼠胚胎中的表达

构建了真核表达载体pIRES2-EGFP-V13KL,瞬时转染COS-7细胞及对小鼠受精卵进行原核注射,旨在通过抗菌肽V13KL在COS-7细胞、小鼠胚胎中的表达情况评价其对细胞生理状态、胚胎发育方面可能产生的影响。结果显示,V13KL可以与EGFP在COS-7细胞中高效共表达,转染效率为75.8%,且原核注射后约10%的胚胎发育成带有绿色荧光的囊胚。     

绵羊痘病毒吉林株的分离鉴定及其RPO30、P32和Kl基因的克隆与进化分析

从病理学和病原学角度对临床一起疑似羊痘病例进行了系统的检测分析,确诊该起病例为绵羊痘病毒(sheep poxvirus,SPPV)感染所致。对病死羊进行大体病理剖检,病羊口腔黏膜、尾根及肺脏等内脏器官表面可见有大量痘疹样结节;病理组织学观察可见,肺脏支气管黏膜上皮细胞、肺泡上皮细胞发生变性、坏死、脱落,并伴有上皮化生;此外,在肺泡上皮细胞胞浆中可见有嗜酸性病毒包涵体,该结果提示这起病例可能是羊痘病毒感染所致。之后从病原学角度进行了检测分析,电镜负染观察可见典型的痘病毒粒子;RPO30、P32、Kl基因的PCR检测结果显示,均扩增出与预期目的片段大小相一致的条带;P32基因的系统发育进化分析结果显示,该分离株与SPPV-AV40的亲缘关系较近,证实了该起病例的病因为SPPV感染所致,命名为SPPV-Jilin分离株(KF991006)。该分离株RPO30和Kl基因的测序分析结果发现,与山羊痘病毒相应序列相比,其RPO30基因缺少21bp的核酸序列,而Kl基因在902～925bp位置处存在缺失,该结果表明RPO30和Kl基因将可能用于绵羊痘病毒与山羊痘病毒的鉴别诊断。     

抗菌肽V13KL原核表达载体的构建及其表达产物的鉴定

将V13KL编码基因片段克隆到原核表达载体pET30b（＋），并在目的蛋白N端设计肠激酶酶切位点，构建出pET30b（＋）-VK13L重组质粒，转化大肠杆菌表达菌株BL21（DE3），优化诱导条件，使得抗菌肽得到了高效表达。经Tricine-SDS-PAGE和Westernblotting鉴定，目的蛋白的相对分子质量与预期一致。结果表明，V13KL基因成功克隆并且获得表达，在诱导体系中加入1mmol／LIPTG诱导6h便可检测到蛋白表达。     

羊口疮与绵羊痘二联重组DNA疫苗的构建及其免疫应答

羊口疮(Orf)和绵羊痘(SPP)是发生于羊群的高度接触性传染病，两者在临床上经常呈现混合感染，给养羊业带来严重的经济损失，因此，开发安全有效、可同时抵抗2种疫病的二联疫苗具有重要临床意义。本研究将羊口疮病毒(ORFV)的B2L基因及绵羊痘病毒(SPPV)的P32基因以P2A肽序列串联，获得pcDNA3.1-B2L-P2A-P32质粒，作为候选重组DNA疫苗。将质粒转染细胞，检测抗原蛋白的胞内表达及切割；将其免疫BALB/c小鼠，以间接ELISA法检测特异性抗体、中和抗体效价和细胞因子的分泌水平。结果表明：该重组DNA疫苗能在真核细胞中独立表达B2L及P32抗原蛋白，同时能诱导机体产生特异性免疫应答，具有较好的免疫效果。该研究为在羊群中开展更广泛的临床研究提供了试验依据，有望成为候选疫苗。