细胞自噬与猪流行性腹泻病毒相互作用的研究进展

猪流行性腹泻病毒（PEDV）是冠状病毒科甲型冠状病毒属的一种有囊膜的单股正链RNA病毒,对全世界养猪业造成了巨大的损失。PEDV与宿主之间的致病机制和免疫调节相互作用仍不清楚。有研究表明冠状病毒可以诱导细胞发生自噬,并且与病毒的复制有着密切的联系,病毒与细胞自噬之间的关系十分复杂,虽然病毒感染与细胞自噬之间的关系研究比较广泛,但细胞自噬在PEDV感染中的作用报道较少。研究PEDV与细胞自噬的相互作用可以加速对PEDV感染入侵机制的理解,为未来研究病毒治疗和抗病毒药物提供新的思路。 [关键词] 猪流行性腹泻病毒|细胞自噬|相互作用     

细胞自噬与小RNA病毒相互作用分子机制研究进展

细胞自噬是真核生物中普遍存在的、对细胞内物质进行循环更新,维持内环境稳态的一种自我保护机制。近年研究表明,细胞自噬能够参与小RNA病毒的感染过程,小RNA病毒感染细胞时,快速激活自噬途径,自噬可以通过递呈病毒抗原发挥抗病毒天然免疫功能;同时自噬体为部分小RNA病毒提供复制相关蛋白质和非细胞裂解性释放途径,促进病毒的复制。论文对近年来小RNA病毒感染和细胞自噬相互作用的研究进展进行综述,为进一步阐明小RNA病毒参与自噬调节的作用机制提供参考。     

PEDV感染过程中TRIM5α介导的自噬对病毒复制的影响

旨在研究三结构域蛋白5α(tripartite motif protein 5α,TRIM5α)能否通过调控细胞自噬来影响猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea viru, PEDV)在非洲绿猴肾细胞(Vero-E6)中的复制。利用Western blot(WB)检测自噬标志蛋白LC3Ⅱ的表达，明确PEDV感染Vero-E6细胞后不同时间点自噬的发生情况。通过实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测TRIM5α在自噬模型中的表达水平。设计并合成3条TRIM5α的干扰片段并筛选干扰效率最高的干扰片段，将其转染至Vero-E6细胞，PEDV感染后48 h,通过WB检测LC3Ⅱ蛋白的表达水平；RT-qPCR检测PEDV的N、ORF3基因的表达水平，同时检测PEDV滴度变化，以明确TRIM5α对自噬和PEDV复制的影响。结果表明：PEDV成功感染Vero-E6细胞并诱导细胞自噬。WB结果显示感染24、36和48 h时，试验组的LC3Ⅱ的表达量呈上升趋势，在48 h时表达量最高，且差异极显著(P<0.01),自噬被激活；RT-qPCR结果显示，TRIM5α的表...     

抗病毒免疫中宿主细胞的自溶作用以及病毒的进化

多种病原体能够侵害宿主细胞并从宿主的机体免疫系统的防御下得以逃逸。在宿主细胞中,病原体利用一些复杂的方法和途径避免了细胞对入侵者强有力的攻击。近年来的研究表明,自噬作用是细胞内宿主细胞杀灭入侵病原微生物的防御结构中最显著的工具之一,有些病原体却可以在分子水平阻滞这种自噬通路而使持续感染成为可能。宿主抗病毒反应中自噬作用与先天免疫和获得性免疫之间,以及病毒与自噬作用之间存在着复杂的相互关系,这些关系主导了自噬作用和病原菌之间的相互作用。     

Dermcidin促进猪流行性腹泻病毒复制的研究

猪流行性腹泻病(PED)是由猪流行性腹泻病毒(PEDV)引起的一种高度传染性的猪胃肠道疾病，可导致哺乳仔猪产生急性水样腹泻，造成严重的经济损失。为调查抗菌肽Dermcidin(DCD)对PEDV复制的影响，本研究利用Western blot、荧光定量PCR(RT-qPCR)以及测定病毒半数组织细胞感染量TCID₅₀等方法，通过检测在DCD的作用下PEDV在细胞中的基因转录、蛋白表达和病毒滴度的水平，并利用Western blot检测信号通路中蛋白表达水平，探究其作用的分子机制。研究表明，DCD能够参与PEDV感染；DCD过表达促进了PEDV在Vero细胞和LLC-PK1细胞中的复制，而敲低DCD抑制了PEDV复制；DCD通过诱导PTEN表达来抑制Akt-mTOR-p70S6K通路相关蛋白位点的磷酸化，从而介导自噬促进PEDV复制。研究DCD对PEDV复制的作用机制，对今后PEDV防治工作有重要参考意义。     

病毒与细胞的互作——自噬

病毒作为一种专性细胞内寄生物,其在感染过程中会与自噬这一维持细胞自稳态的代谢过程发生相互作用,有研究表明自噬在病毒的感染、病毒相关基因的复制转录和致病力方面均起到重要作用,本文对细胞自噬的概念、病毒感染引起细胞自噬、自噬介导的抗病毒作用和病毒利用自噬及其相关途径进行增殖等作一概述。根据细胞自噬功能的两面性,为控制病毒感染和成功研制抗病毒药物奠定基础。     

PEDV编码蛋白拮抗宿主天然免疫的研究进展

猪流行性腹泻病毒(PEDV)属于冠状病毒家族成员,是近年来引起新生仔猪水样腹泻致死的主要病原之一,给养殖业带来了巨大威胁。病毒感染后,宿主细胞通过模式识别受体(PRRs)识别病原相关分子模式(PAMPs),促进I型干扰素等细胞因子的产生,进而抑制病毒的增殖。近年来的研究表明,PEDV能够通过其编码蛋白对宿主的抗病毒天然免疫反应进行调节,成功逃避免疫识别或拮抗宿主的天然免疫反应,为自身的快速复制和增殖创造条件。本文结合目前关于PEDV与宿主细胞相互作用的研究进展,综合分析了PEDV编码的各种蛋白在感染过程中拮抗宿主天然免疫系统的分子机制,旨在为进一步认识PEDV乃至其他冠状病毒的致病机制,也为探索新的抗病毒药物靶标提供思路。     

鹅细小病毒诱导番鸭胚成纤细胞自噬

细胞自噬在病毒生命周期中发挥着重要作用，目前国内仍然没有鹅细小病毒(GPV)与细胞自噬关系的系统研究。本研究旨在探讨番鸭小鹅瘟病毒(MDGPV)PT株与短喙矮小综合征鹅细小病毒(SBDS-GPV) M15株细胞适应毒感染番鸭胚成纤维细胞(MDEFs)后对细胞自噬的影响，以及细胞自噬对病毒增殖的作用。通过激光共聚焦方法观察自噬标记物LC3-Ⅱ特异绿色荧光聚集颗粒，借助蛋白免疫印迹检测LC3蛋白与p62蛋白的表达量，以及LC3-Ⅰ/LC3-Ⅱ蛋白转化分析，确定GPV感染能够促进细胞自噬发生。利用膜通透性半胱氨酸蛋白酶抑制剂阿洛司他丁、自噬诱导剂雷帕霉素以及自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤，调控自噬来研究细胞自噬对病毒增殖的影响，结果显示细胞自噬有利于GPV在MDEFs中的复制。结果表明GPV感染能够诱导细胞自噬，同时细胞自噬有利于病毒在宿主细胞中的复制。     

甘露糖-6-磷酸/胰岛素样生长因子Ⅱ受体介导PEDV感染作用的初步验证

为进一步研究猪流行性腹泻病毒(PEDV)感染细胞的机制,本研究利用病毒铺覆蛋白印迹技术(VOPBA)和质谱(MS)技术筛选细胞内与PEDV相互作用的蛋白,初步鉴定细胞内源性蛋白甘露糖-6-磷酸/胰岛素样生长因子II受体(M6P/IGF2R)为候选蛋白。结果证实M6P/IGF2R蛋白与PEDV S2蛋白相互作用且在细胞内存在共定位现象,过表达M6P/IGF2R能够促进PEDV增殖,干扰M6P/IGF2R能够抑制PEDV增殖。PEDV S2蛋白通过与宿主细胞M6P/IGF2R蛋白互作促进PEDV侵入细胞,该结论为进一步开展PEDV与宿主细胞蛋白相互作用机制研究提供了重要理论依据。     

RT—PCR快速诊断猪流行性腹泻

猪流行性腹泻病毒(PEDV)属于冠状病毒,是一种猪肠道病原性腹泻病毒.其感染猪表现的临床症状与猪传染性胃肠炎(TCE)十分相似.虽然通过细胞培养可以进行病毒分离、诊断PEDV感染,但是PEDV只能在Vero细胞中繁殖,而且通常需要胰蛋白酶参与的情况下盲传数代,因此,有必要建立一种病原鉴别诊断方法.     

猪流行性腹泻病毒入胞机制研究现状

猪流行性腹泻是由猪流行性腹泻病毒(PEDV)引起的一种高度传染性疾病,给全球养猪业造成了严重的经济损失。PEDV的S蛋白同时具有受体结合和膜融合功能。S蛋白与宿主细胞受体之间相互作用,细胞蛋白酶对S蛋白的水解激活,病毒膜融合的方式对PEDV的组织嗜性、宿主范围,发病机制起到关键作用。因此,从PEDV的组织和细胞嗜性、细胞受体、入胞方式、细胞蛋白酶等方面着手,研究病毒的入胞机制对病毒感染的预防和治疗具有重要意义,也为后续的基础研究及PEDV的防控提供理论支持。     

细胞自噬在细小病毒感染中的作用机制研究进展

自噬是真核细胞中常见的一种保守的溶酶体分解代谢途径，对宿主代谢至关重要。其主要功能包括饥饿时的能量守恒、细胞器的循环和长寿蛋白质的正常周转。自噬在清除细胞内病原体方面起着关键作用，很可能是一种原始的内在细胞防御机制。最近的研究表明，自噬在病毒感染过程中起着复杂的多向作用，它不仅保留了降解细胞内病原体的能力，还具有增强和微调抗病毒免疫反应的功能。然而，一些病毒也进化出各种机制以逃避自噬降解，促进其自身的复制和释放。本文综述了自噬与病毒感染相互作用的研究进展，强调了自噬与细小病毒之间的分子相互作用，为抗病毒药物及疫苗研发提供理论基础，从而为细小病毒的防控提供新思路。     

细胞糖酵解对猪流行性腹泻病毒复制的影响

为研究猪流行性腹泻病毒(PEDV)感染细胞后,细胞糖酵解的变化及其对PEDV复制的影响,本试验通过实时荧光定量PCR和Western blot检测PEDV感染猪小肠上皮细胞IPEC-J2后36 h糖酵解相关酶己糖激酶2(HK2)的表达水平,然后通过添加糖酵解抑制剂2-脱氧-D-葡萄糖(2-DG)来进一步验证细胞糖酵解对PEDV复制的影响,最后检测了正常浓度葡萄糖(5.5 mmol/L)和高浓度葡萄糖(11.1 mmol/L和22.2 mmol/L)培养条件下PEDV复制情况来探究葡萄糖浓度对PEDV复制的影响。结果表明,PEDV感染显著增加糖酵解限速酶HK2的表达,PEDV感染可增强IPEC-J2细胞的糖酵解,细胞糖酵解水平增强有利于PEDV的复制。在一定范围内提高葡萄糖浓度可促进PEDV复制。研究结果为初步阐明PEDV感染机制以及冠状病毒病的综合防控提供了理论依据。     

长链非编码RNA在PEDV感染Vero-E6细胞中对自噬的调控作用

【目的】 试验旨在研究长链非编码RNA(long noncoding RNA，lncRNA)在猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea viru，PEDV)感染非洲绿猴肾细胞(Vero-E6)过程中对自噬的调控作用，以期为抗PEDV新型药物靶点的开发提供新思路。【方法】 根据GenBank上公布的人lncRNA-HOTAIR基因序列(登录号:NR_047517.1)，利用LongMan在线工具筛选lncRNA-HOTAIR的猴源同源序列(lncRNA-M)，并利用RNAfold、LncLocator在线预测工具预测其二级结构和核质分布。建立PEDV感染的Vero-E6细胞模型，在0、6、12、24、36和48 h收集细胞，利用实时荧光定量PCR和Western blotting检测微管相关蛋白1-轻链3(LC3)蛋白的表达，以明确病毒感染细胞后不同时间点自噬的发生情况。通过实时荧光定量PCR检测lncRNA-M在PEDV感染Vero-E6细胞模型中0、6、12、24、36和48 h的表达水平。设计并合成3条lncRNA-M的干扰片段:siRNA-1、siRNA-2和siRNA-3，分别转染Vero-E6细胞，待细胞汇合度达到90%时接毒，感染48 h后利用实时荧光定量PCR检测lncRNA-M的表达情况，筛选出干扰效率最高的干扰片段。将干扰效率最高的干扰片段转染至Vero-E6细胞并接种PEDV后，通过Western blotting检测感染后24和48 h LC3蛋白的表达水平，以验证自噬的发生情况。【结果】 成功筛选出lncRNA-HOTAIR猴源同源序列为lncRNA 0.1，并根据RNAfold预测结果生成lncRNA 0.1的RNA最小自由能二级结构;LncLocator预测结果表明，lncRNA 0.1在细胞核和细胞质中的分布分别为41.88%和37.78%。PEDV感染Vero-E6细胞48 h后，细胞皱缩、聚集成团，细胞膜融合形成合胞体;1.0%琼脂糖凝胶电泳结果显示，在1 326 bp处出现目的条带，说明PEDV感染Vero-E6细胞模型成功建立。在PEDV感染的Vero-E6细胞模型中，Western blotting结果显示，6、12、24、36和48 h LC3Ⅱ的表达量呈上升趋势，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比值在48 h最高且极显著高于0 h (P<0.01);实时荧光定量PCR结果显示，LC3的mRNA表达量在48 h最高，且极显著高于0 h(P<0.01)，自噬被激活;lncRNA 0.1的表达均呈上升趋势，在48 h表达量最高，48 h lncRNA 0.1的表达量极显著高于0 h (P<0.01);siRNA-2的干扰效果最好，干扰效率为80%。干扰lncRNA 0.1后，Western blotting结果显示，24和48 h干扰组的LC3蛋白表达量均低于对照组，自噬受到抑制。【结论】 PEDV感染Vero-E6细胞能够诱导自噬发生，lncRNA 0.1在感染过程中起到了促进自噬的作用。     

猪流行性腹泻病毒研究进展

<正>猪流行性腹泻病毒属于冠状病毒科冠状病毒属,是I群冠状病毒的成员。目前对于PEDV感染机理方面的研究较少,2007年猪氨基肽酶(p APN)被证实为PEDV的功能性细胞感染受体,继而又有研究从数量上证实增加p APN的密度可以增大PEDV感染率。PEDV基因组长为27000~33000个核苷酸(nt),靠近3’端5kb区域内有5个主要的开放阅读框(ORF)。编码4种结构蛋白:S蛋白、E蛋白、M蛋白和N蛋白,位于E基因上游的ORF命名为ORF3,编码一个未知功能且具有多态性的产物。     

自噬与细菌相互作用的研究进展

细菌感染细胞的过程中,自噬是一把"双刃剑"。一方面,非吞噬细胞内的细菌被自噬体内化、降解,从而有助有感染细菌的清除;另一方面,某些细菌在进化过程中形成了独特的机制来逃避细胞的自噬作用,防止最终被溶酶体所降解,同时利于其在细胞内复制和存活。本文将自噬与细菌的相互作用进行综述,希望对细菌和自噬相互作用的研究有所帮助。     

H9N2流感病毒诱导MDCK细胞自噬对病毒复制的影响

本试验旨在研究H9N2流感病毒感染MDCK细胞引发的细胞自噬对病毒复制的影响。试验首先建立了稳定表达GFP-LC3的 MDCK细胞系,该细胞系经H9N2流感病毒感染后,激光共聚焦观察到了绿色荧光的点状聚集,得出H9N2流感病毒感染MDCK细胞引发细胞自噬。随后试验利用3-MA抑制细胞自噬、Rapamycin诱导细胞自噬,荧光定量PCR检测NP mRNA水平,TCID50检测病毒的滴度进行细胞自噬与病毒复制的研究。结果表明： Rapamycin可显著增加NP mRNA水平和病毒滴度（P ＜ 0.01）|3-MA可以显著降低NP mRNA水平和病毒滴度（P ＜ 0.01)。说明H9N2流感病毒感染MDCK细胞引发的细胞自噬可促进流感病毒的复制。 [关键词] H9N2 流感病毒|细胞自噬|病毒复制|MDCK细胞|诱导     

3C样蛋白酶：重要抗PEDV药物的筛选靶标

<正>猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)是一种有囊膜的单股正链RNA病毒，属于套式病毒目(Nidovirales)、冠状病毒科(Coronaviridae)、冠状病毒属(Coronavirus)成员。由于冠状病毒的RNA酶缺乏校正功能，PEDV等冠状病毒的基因组易发生变异。2010年末，PEDV变异株所致疫情在我国猪群中暴发以来，该病一直在我国猪群中反复流行，对哺乳仔猪的致死率高达100%。当前，疫苗接种仍然是防控PEDV感染的首选措施。然而，冠状病毒变异速度快、流行株多，导致现有疫苗株对当前流行变异株只起到部分的交叉免疫保护。抗病毒药物对于病毒感染的应急性治疗，特别是对新生仔猪等尚未形成完整免疫系统的动物，在缓解病情进一步恶化中发挥重要作用。在抗病毒药物的设计策略中，靶向病毒的药物可以在不影响宿主细胞的同时有效抑制病毒的复制，并且由于大部分病毒结构简单，病毒蛋白数量相对较少，易设计出特异性抑制病毒蛋白功能的抗病毒药物。     

猪源冠状病毒监测简报

目前,已知感染猪群的冠状病毒有6种,分别是猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪呼吸道冠状病毒(PRCV)、猪急性腹泻综合征冠状病毒(SADS-CoV)、猪血凝性脑脊髓炎病毒(PHEV)和猪δ冠状病毒(PDCoV)。在冠状病毒科α、β、γ、δ等4个属中,PEDV、TGEV、PRCV、SADS-CoV均为α冠状病毒,PHEV为β冠状病毒,PDCoV为δ冠状病毒。PRCV在临床上引发仔猪呼吸道症状,PHEV感染会造成仔猪呕吐和神经症状,其他4种病毒均可引起猪群腹泻。中国动物卫生与流行病学中心对2011年以来收集自全国16个省份的2 915份临床腹泻猪群样品(肠道、粪便等)进行了PEDV、TGEV检测,检出PEDV阳性1 223份、TGEV阳性109份,PEDV、TGEV检出率分别为41.96%、3.74%;对2014年以来收集自14个省份的12 430份临床健康猪组织样品(淋巴结、扁桃体等)进行了PEDV检测,检出阳性325份,检出率为2.61%。针对引发新型冠状病毒肺炎的病原2019新型冠状病毒(2019-nCoV),对2018—2019年收集自15个省份的2 658份生猪组织样品开展了追溯性检测,结果均为阴性。对2019-nCoV与猪源冠状病毒的亲缘关系进行了分析。基于全基因组的遗传进化分析表明:2019-nCoV与同为β冠状病毒属的PHEV核苷酸同源性仅为54%,与α、δ属猪源冠状病毒亲缘关系更远。基于以上数据与分析,可初步排除2019-nCoV来源于已知猪源冠状病毒的可能性。     

猪流行性腹泻病毒Nsp12与宿主RNF7蛋白相互作用的研究

猪流行性腹泻病毒(PEDV)编码的Nsp12蛋白具有RNA依赖的RNA聚合酶(RdRp)活性,在PEDV复制过程中发挥重要作用。为了研究与Nsp12蛋白相互作用的宿主细胞蛋白对PEDV复制的影响,本研究利用酵母双杂交技术将诱饵质粒pGBKT7-Nsp12与猪小肠绒毛上皮细胞(IECs)cDNA酵母表达文库进行杂交筛选,获得的阳性克隆经过测序鉴定证实为环指蛋白7(RNF7),将pGBKT7-Nsp12与p GADT7-RNF7进行酵母回复验证,结果显示二者共转化后能分解SD/-4/X/A中的X-α-Gal形成蓝色菌落,表明Nsp12与RNF7蛋白在酵母中存在相互作用。同时,构建p CAGGS-Nsp12-HA和p CAGGS-Flag-RNF7真核表达载体,利用针对不同标签的抗体进行正向和反向免疫共沉淀鉴定,进一步证实PEDV Nsp12蛋白与RNF7蛋白之间存在直接相互作用;激光共聚焦显微镜观察发现Nsp12蛋白和RNF7蛋白在细胞质中存在共定位现象。为了分析宿主细胞中RNF7蛋白异常表达对PEDV增殖的影响,将构建的RNF7真核表达质粒pcDNA3.1-RNF7转染LLC-PK1细胞后,再用PEDV感染过表达RNF7的LLC-PK1细胞,通过western blot检测LLC-PK1细胞中PEDV N蛋白表达量,荧光定量PCR检测PEDV N基因转录水平,采用TCID50方法检测病毒滴度,结果显示,过表达RNF7后LLCPK1细胞内PEDV N蛋白表达量和N基因拷贝数均下降,其子代病毒滴度也明显低于正常对照组,表明过表达RNF7蛋白可以抑制PEDV的增殖。而利用si RNA-178敲低宿主细胞内源性RNF7蛋白的表达,再以MOI 0.01的PEDV感染后,对感染后不同时间的细胞样品进行western blot检测和病毒滴度检测,结果显示在PEDV感染后24 h,细胞内PEDV N蛋白表达量明显增加,PEDV的滴度在感染后18 h和24 h时分别是对照组的1.10倍和1.17倍。本研究结果首次证实了宿主细胞中RNF7蛋白表达对PEDV的复制发挥负调控作用,为深入探究PEDV复制调控的分子机制奠定了基础。