萘乙酸对橡胶树胶胞炭疽菌生长速率、孢子萌发率和附着胞形成率的影响

橡胶树炭疽病是影响橡胶树割胶生产的重要病害之一,主要由胶孢炭疽菌和尖孢炭疽菌侵染引起的,在世界各大植胶地区引起了无数橡胶树叶片脱落,甚至整株死亡,给当地的橡胶产业发展造成了严重损失。本实验主要采用菌落生长速率法、孢子萌发测试法等常规植物病理学方法研究萘乙酸对橡胶树胶胞炭疽菌RC169生长速率、孢子萌发率和附着胞形成率的影响。结果表明,低浓度时萘乙酸对RC169菌丝生长、孢子的萌发和附着胞的形成具有促进作用,但随着用药浓度的升高,其促进作用变为抑制作用,且抑制作用随之规律性增强。     

橡胶树胶胞炭疽菌T-900突变体生物学研究及其假定基因LV1敲除载体构建

从构建的橡胶树胶孢炭疽菌RC178(Colletotrichum gloeosporioides)突变体库中筛选获得一株致病力明显减弱突变体T-900,与野生菌株相比其菌落生长速率、产孢能力,孢子萌发率及附着孢形成率均明显降低。通过对突变菌株T-900 T-DNA侧翼序列克隆、比对和基因预测结果表明外源片段的插入破坏了一个预测基因的功能,该基因和组蛋白H3同源性为99%,暂命名为LV1。通过同源臂克隆构建了该基因敲除载体900-1A-900-1B-p CT74,为进一步研究该基因在病原菌致病过程中的作用机理提供了基础。     

橡胶炭疽病菌致病相关突变体的筛选及表型分析

通过对实验室已获得的1 685个橡胶炭疽病菌T-DNA插入突变体的生物学及致病性测定,从中筛选出15个致病力明显减弱的突变体,并进行PCR检测。结果表明,该基因组中均含潮霉素磷酸转移酶基因片段。在PDA培养基上,其中2个突变体菌落颜色异常,6个生长速率下降,8个产孢量显著降低,2个突变体分生孢子形态异常,2个附着胞形态异常,3个不能形成附着胞,在洋葱表皮上,侵染钉形成率显著降低。     

海南省3种油茶炭疽病菌的致病力及其生物学特性研究

为了弄清海南省不同油茶炭疽病菌致病力差异及生物学特性,采用刺伤接种法对3种油茶炭疽病菌(C.fructicola、C.siamense、C.camelliae)的致病力进行测定,发现不同病原间致病力存在显著差异,其中C.fructicola致病力最强,C.siamense致病力次之,C.camelliae致病力最弱。对3种炭疽病菌生物学特性研究发现,3种病菌最适生长温度、p H值及光照条件类似,同时均可利用多种碳、氮源,但不同病菌生长的最优碳源、氮源有一定差异。C.fructicola的产孢量、分生孢子萌发率及附着胞形成率均高于C.siamense及C.camelliae。不同油茶炭疽病菌生物学特性的差异可能与其致病力分化有关。本研究结果将为进一步研究不同油茶炭疽病菌致病差异机制提供理论依据。     

ATP硫酸化酶基因MoMET3在稻瘟病菌生长发育和致病过程中的功能分析

【目的】真菌对硫元素的利用始于ATP硫酸化酶对硫酸根离子的活化。对稻瘟病菌ATP硫酸化酶在病菌生长发育和致病过程中的功能进行分析,可为稻瘟病的防治提供药物靶标。【方法】采用同源重组方法构建基因敲除载体,并对突变体的表型进行分析。【结果】Mo MET3基因是病菌营养生长和分生孢子形成所必需的,但不是毒力因子。稻瘟病菌ATP硫酸化酶编码基因Mo MET3缺失后,突变体营养生长速率减慢,产孢量降低,但是突变体对寄主的毒力不受影响;虽然基因缺失不影响突变体分生孢子萌发和附着胞成熟,但突变体在硫营养限制时孢子萌发后次生菌丝的生长明显受抑。Mo MET3基因互补后,突变体恢复正常生长,能利用硫酸盐。【结论】无机硫的还原对分生孢子的萌发和附着胞的成熟并不是必需的,分生孢子内储存的还原态硫化合物可以满足这一过程中硫营养的需求,但病菌侵入寄主组织后需要吸收利用寄主源还原态硫以利于侵染菌丝的扩展。     

三唑酮种衣剂对小麦幼苗上白粉病菌萌发和侵染影响的组织学观察

采用组织病理学染色技术 ,观察和测定了三唑酮种衣剂包衣处理的小麦幼苗上白粉病菌孢子萌发、侵染的发展过程。结果表明 ,药剂处理对白粉病菌初生芽管、附着胞芽管的萌发及成熟附着胞的形成无抑制作用 ,但明显提高附着胞的畸形率 ;抑制初生吸器原体的形成和指状体的发育 ,降低入侵率 ;抑制初生菌丝的发育、次生菌丝和次生吸器的形成。分析认为 ,三唑酮种衣剂包衣处理在降低小麦白粉病菌的初始菌源数量和控制白粉病的流行危害中具有重要作用     

橡胶树胶孢炭疽菌P型ATP酶基因CgATPase 01的敲除及表型分析

为了了解橡胶树胶孢炭疽菌的一个钙转运P型ATP酶基因Cg ATPase01的功能,本研究利用Splitmarker技术构建敲除载体,通过PEG介导原生质体转化对橡胶树胶孢炭疽菌菌株HBCg01的Cg ATPase 01基因进行敲除,根据表型变化及致病性检测对其功能进行分析。结果表明:通过Split-marker方法获得了敲除突变体△Cg ATPase01,表型分析发现该突变体与野生菌株间存在明显差异,病菌气生菌丝的颜色发生了改变,生长速率降低,产孢量下降,对橡胶树叶片的致病性减弱,推测该基因可能在橡胶树胶孢炭疽菌的产孢、生长发育和致病性等方面具有重要作用。本研究结果为进一步研究胶孢炭疽菌P型ATP酶基因功能和病原菌的致病机理奠定了基础。     

茶树炭疽病菌拮抗链霉菌的筛选及其抑菌特性研究

茶炭疽病菌刺盘孢菌（Colletotrichum camelliae）是引起茶树炭疽病的重要致病菌,为获得对C.camelliae具有拮抗作用的链霉菌,采用稀释涂布法和平板对峙法从茶园生境中分离筛选出对其具有明显拮抗作用的链霉菌菌株,并结合形态学观察、生理生化特征和16 SrRNA基因序列分析对其进行种属鉴定;开展基于链霉菌菌株的抗菌谱测定、茶炭疽病菌菌丝生长抑制试验和孢子萌发抑制试验;通过菌丝生长速率法测定其无菌发酵滤液对茶炭疽病菌的抑菌活性及其抑菌活性稳定性,并测定其产胞外降解酶能力、抗菌物质合成基因、挥发性与非挥发性代谢物抑菌活性。结果表明,筛选获得一株对茶炭疽病菌C.camelliae具有良好抑菌效果的菌株XS-4,对茶炭疽病菌的平板抑制效果为76.42%;结合形态学观察、生理生化特征,以及16 SrRNA基因序列分析,将菌株XS-4鉴定为多产色链霉菌（Streptomyces polychromogenes）;菌株XS-4对其他8种植物病原菌均具有较好的抑菌效果,抗菌性能具有广谱性。扫描电镜结果表明,菌株XS-4能抑制茶炭疽病菌菌丝生长。孢子萌发抑制试验发现,拮抗菌XS-4发...     

橡胶树胶孢炭疽菌组蛋白乙酰转移酶CgGCN5调控致病力功能研究

胶孢炭疽菌引起的炭疽病害是造成海南省橡胶减产的主要原因之一。研究该病原菌致病力的分子机制能够为新型防控策略的研发提供理论依据。在橡胶树胶孢炭疽菌中,存在1个编码组蛋白乙酰转移酶的基因CgGCN5。在本研究中,通过同源重组原理及原生质体转化法构建了橡胶树胶孢炭疽菌CgGCN5的敲除突变株和互补菌株,并对其生长、产孢及致病力等表型进行了初步分析。结果表明,与野生型菌株相比,CgGCN5敲除突变株的生长速率、产孢能力均显著下降;并且突变株对橡胶树叶片的致病力也显著下降;进一步分析表明,突变株丧失了对玻璃纸的穿透力。与此同时,互补菌株能够恢复突变株的相应表型。以上结果表明,CgGCN5在调控胶孢炭疽菌的生长及致病力中起重要作用。     

杧果炭疽病菌漆酶基因Cglac3序列特征及其在两个侵染相关基因突变体中的表达分析

本研究运用同源克隆技术克隆了杧果炭疽病菌（Colletotrichum gloeosporioides）的Cglac3漆酶基因,并采用实时荧光定量PCR分析了该基因在侵染过程、漆酶基因LAC1突变体、外切葡聚糖酶基因CgCBH1突变体中的差异表达情况。结果表明,杧果炭疽病菌漆酶Cglac3基因大小为1842 bp,含3个内含子,大小分别为56、51、58 bp。Cglac3开放读码框编码558个氨基酸,蛋白分子量为61.38 kDa,等电点（PI）为4.50。与未侵染对照0 h的表达量相比,Cglac3在6 h孢子萌发形成附着胞时表达量迅速升高,在12 h侵入寄主后达到最高,之后在菌丝扩展、叶片显症过程中出现波动,但均远高于0 h的表达量,显示Cglac3在侵染的不同阶段均发挥着重要的作用,可能是胶孢炭疽菌的重要致病因子之一。与野生型相比,Cglac3表达量在杧果炭疽病菌漆酶基因LAC1敲除突变体中下降了74%,在外切葡聚糖酶基因CgCBH1敲除突变体中下降了56%;在CgCBH1缺失敲除突变体中,LAC1的表达下降了68%,与Cglac3的表现趋势一致,说明Cglac3的表达受LAC1调控,外切葡聚糖酶基因CgCBH1也会影响Cglac3和LAC1的表达。     

稻瘟病菌分生孢子发芽和附着胞形成的影响因素研究

在8种培养基膜,多种cAMP、IBMX浓度梯度的琼脂表面膜,不同营养液及pH值条件下,研究了稻瘟病分子孢子发芽和附着胞形成的状况,并对稻瘟病拮抗细菌培养液的作用进行了研究。稻瘟病菌(Magnaporthe grisea) 91-11B1的分生孢子悬浮液浓度在10000~1000个/mL 和pH值在7.0为最适孢子萌发条件,但不影响附着胞的形成。疏水基物表面、营养饥饿或洋葱表皮细胞表面可以刺激附着胞形成。2.5 mmol/L cAMP和8.0 mmol/L磷酸二酯酶抑制剂IBMX显著地促进附着胞的形成。与去离子水和水洗法相比,自来水和振落法获得的分生孢子更有利于附着胞的形成。筛选到3株对孢子发芽及附着胞形成有强烈抑制作用的拮抗细菌     

香蕉黑星病菌侵入前发育的Ca2+/CaM依赖信号研究

测定Phyllosticta musarum 在不同疏水性的人工表面上的孢子萌发率和附着胞形成率,以及Ca2+,CaM依赖信号系统是否参与了P.musarum侵入前阶段的发育调控.结果表明,P.musarum在侵染寄主时形成一种专门的附着胞作为侵染结构,刚性的疏水表面有利于诱导P musarum分生孢子的萌发.刚性表面则有利于附着胞的形成,而对这种与侵染相关的特化结构即附着胞的发育影响不显著.加入外源Ca2+,不论浓度如何都能促进分生孢子萌发,而附着胞形成率在高浓度外源Ca2+存在时则明显下降.Ca2+敖合剂EGTA有抑制孢子萌发和附着胞形成的作用,但在EGTA中加入Ca2+载体A23187和CaCl2可部分缓解EGTA的这种抑制作用.磷酸酯酶C(PLC)抑制剂Neomycin可以抑制附着胞形成.Ca2+通道阻断剂TMB-8和Nicaldipine,CaM拈抗剂Chloropromazine在微摩尔剂量水平上均可抑制附着胞形成.证明由Caz+/CaM信号系统控制的生化过程参与了P.musarum在寄主香蕉表面侵入前的形态建成.     

胶孢炭疽菌侵染橡胶树叶片染色方法的建立及显微观察

本研究建立了一种橡胶树叶片中胶孢炭疽菌的染色方法,通过显微观察明确胶孢炭疽菌在橡胶树叶片中的侵染结构,为橡胶树炭疽病的预测预报提供理论依据。在脱色剂（0.15%三氯乙酸乙醇溶液∶氯仿=5∶1）处理12 h,1%刚果红染色剂抽滤染色3 h的条件下,能清晰观察到胶孢炭疽菌在橡胶树叶片上的发育进程和侵染结构。结果表明,在28 ℃、100%相对湿度培养条件下,接种橡胶树淡绿期叶片2~6 h为分生孢子萌发高峰期,12 h后分生孢子萌发率大于85%;8~12 h为附着胞形成高峰期,接种12 h约75%的芽管顶端产生附着胞,少数附着胞中央部位开始形成侵染钉;24 h为侵染钉形成高峰期,同时分生孢子萌发形成多个芽管;36 h时附着胞顶端再次萌发产生次级附着胞,从而进一步侵染周围细胞,叶片出现零星病斑;48 h时芽管不断分支异化成菌丝并产生次级分生孢子,叶片出现大量典型的炭疽病病斑;72 h后菌丝在叶片表面纵横扩展,随机分支,逐步形成网状分布。随着菌丝的扩展,叶片组织发生一系列的病理变化,侵染部位组织出现褐色坏死病斑。本研究建立了一种着色效果好,简便易行,经济有效的橡胶树叶片中胶孢炭疽菌的染色方法,进一步明确了胶孢炭疽菌的侵染结构。     

农杆菌介导的稻瘟病菌转化及致病缺陷突变体筛选

在构建了两个含有潮霉素B磷酸转移酶基因双元载体的基础上,成功地实现了农杆菌介导的稻瘟病菌转化,转化效率达每1×106个分生孢子>300个转化子,并得到了4000多个转化子。通过继代培养和PCR检测,证明插入到稻瘟病菌基因组中的潮霉素抗性基因可稳定遗传。Southern杂交分析表明,大约有2/3转化子的T DNA插入是单拷贝的。用大麦叶片离体接种的方法快速测定部分稻瘟病菌转化子的致病性,发现一个致病缺陷突变体：A1 412。该突变体不能侵入水稻叶片及擦伤的大麦或水稻叶片,说明A1 412突变体在寄主组织中扩展进程被阻断。进一步的表型分析发现A1 412突变体的产孢量显著下降,仅为野生菌株的7%,在疏水表面不能形成附着胞,部分分生孢子萌发也略有延迟。Southern 杂交显示A1 412基因组中T DNA插入是单拷贝的。上述结果表明,A1 412突变体表型的改变可能是由于T DNA插入而使某一具有重要生物学功能的基因失活所致。     

稻瘟病菌丝氨酸/苏氨酸磷酸酶MoPpz1的功能研究分析

稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae）是一种在水稻不同生育期均能引起病害的真菌。在真核生物中,蛋白激酶CK2高度保守,包含2个调节亚基和2个催化亚基。稻瘟病菌中MoCKb1和MoCKb2分别编码MoCK2的2个调节亚基,MoCKa编码稻瘟病菌MoCK2的催化亚基。运用反向遗传学策略和同源重组原理,对MoCKa-GFP的pull-down实验结果中获得的一个丝氨酸/苏氨酸磷酸酶MoPpz1进行功能分析。经过生物信息学研究分析发现Ppz1在不同的真菌中具有不同的功能,同时与其他模式真菌的Ppz1蛋白序列具有较高同源性。在获得基因敲除突变体后,通过表型分析发现,与野生型Ku80相比,ΔMoppz1突变体菌落的营养生长和产孢量等方面均无明显差异,但分生孢子的萌发和附着胞的形成滞后于野生型菌株,且对水稻的致病能力减弱。激光共聚焦显微分析表明,MoPpz1定位在菌丝、分生孢子和附着胞的细胞质中。综上所述,蛋白磷酸酶MoPpz1可能参与稻瘟病菌分生孢子萌发、附着胞形成以及对水稻致病性的调控。     

稻瘟病菌MoRho2基因功能初步分析

稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)是研究病原真菌生长发育及致病机理的重要模式生物。Rho家族蛋白是一类具有GTP酶活性的GTP结合蛋白,在多种细胞信号转导通路中起着分子开关的作用。通过生物信息学方法分析Mo Rho2的理化性质、蛋白结构域等信息,并推测其潜在功能。为进一步明确Mo Rho2蛋白的功能,利用基因敲除技术获得Mo Rho2基因的敲除突变体。表型分析结果表明,与野生型菌株相比,Mo Rho2敲除突变体的菌丝生长速度、分生孢子形态、附着胞形态、产孢量、对植物的毒力等方面均无明显的差异,但分生孢子萌发和附着胞形成略滞后于野生型菌株。突变体能够产生正常的侵入栓并侵入洋葱表皮。综上所述,Mo Rho2基因可能参与稻瘟病菌分生孢子的萌发和附着胞的形成,结果为进一步揭示基因Mo Rho2的生物学功能奠定基础。     

稻瘟病菌温度敏感型突变体的筛选

通过紫外诱变,筛选获得了274个稻瘟病菌的温度敏感型突变体,这些突变体在25℃下可以生长,而在33℃下不能生长。致病性测定结果表明,有32个突变体的致病性显著降低; 在33℃条件下,不萌发的有7个;有12个萌发后停止生长,不能形成附着胞;有9个可以形成附着胞,以后停止生长;有4个形成膨大透明且成串生长的附着胞,随后停止生长。有些温度敏感型突变体形成子囊壳的能力也发生了改变。     

芒果炭疽病菌生防细菌的筛选,鉴定及生防潜能的初步研究

从热带作物,果树,蔬菜的叶,果上和根系周围土壤中分离到了１１０个芽孢杆菌分离物,以炭疽病菌－芽隐杆菌对峙培养法筛选出拮抗力较强的Ｂａ２４,Ｂａ６和Ｂａ２３。经形态特征,培养特性和生理生化性状的测定,这３株芽孢杆菌被鉴定为桔芽孢杆菌。抑菌谱的测定结果表明,这３株芽孢杆菌为广谱性的拮抗菌。经离心,过滤,除去菌体后的Ｂａ２４,Ｂａ,Ｂａ２３的培养滤液对芒果炭疽病菌的菌丝生长和分生孢子萌发均有较好的抑制作