稻瘟病菌MoRho2基因功能初步分析

稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)是研究病原真菌生长发育及致病机理的重要模式生物。Rho家族蛋白是一类具有GTP酶活性的GTP结合蛋白,在多种细胞信号转导通路中起着分子开关的作用。通过生物信息学方法分析Mo Rho2的理化性质、蛋白结构域等信息,并推测其潜在功能。为进一步明确Mo Rho2蛋白的功能,利用基因敲除技术获得Mo Rho2基因的敲除突变体。表型分析结果表明,与野生型菌株相比,Mo Rho2敲除突变体的菌丝生长速度、分生孢子形态、附着胞形态、产孢量、对植物的毒力等方面均无明显的差异,但分生孢子萌发和附着胞形成略滞后于野生型菌株。突变体能够产生正常的侵入栓并侵入洋葱表皮。综上所述,Mo Rho2基因可能参与稻瘟病菌分生孢子的萌发和附着胞的形成,结果为进一步揭示基因Mo Rho2的生物学功能奠定基础。     

ATP硫酸化酶基因MoMET3在稻瘟病菌生长发育和致病过程中的功能分析

【目的】真菌对硫元素的利用始于ATP硫酸化酶对硫酸根离子的活化。对稻瘟病菌ATP硫酸化酶在病菌生长发育和致病过程中的功能进行分析,可为稻瘟病的防治提供药物靶标。【方法】采用同源重组方法构建基因敲除载体,并对突变体的表型进行分析。【结果】Mo MET3基因是病菌营养生长和分生孢子形成所必需的,但不是毒力因子。稻瘟病菌ATP硫酸化酶编码基因Mo MET3缺失后,突变体营养生长速率减慢,产孢量降低,但是突变体对寄主的毒力不受影响;虽然基因缺失不影响突变体分生孢子萌发和附着胞成熟,但突变体在硫营养限制时孢子萌发后次生菌丝的生长明显受抑。Mo MET3基因互补后,突变体恢复正常生长,能利用硫酸盐。【结论】无机硫的还原对分生孢子的萌发和附着胞的成熟并不是必需的,分生孢子内储存的还原态硫化合物可以满足这一过程中硫营养的需求,但病菌侵入寄主组织后需要吸收利用寄主源还原态硫以利于侵染菌丝的扩展。     

农杆菌介导的稻瘟病菌转化及致病缺陷突变体筛选

在构建了两个含有潮霉素B磷酸转移酶基因双元载体的基础上,成功地实现了农杆菌介导的稻瘟病菌转化,转化效率达每1×106个分生孢子>300个转化子,并得到了4000多个转化子。通过继代培养和PCR检测,证明插入到稻瘟病菌基因组中的潮霉素抗性基因可稳定遗传。Southern杂交分析表明,大约有2/3转化子的T DNA插入是单拷贝的。用大麦叶片离体接种的方法快速测定部分稻瘟病菌转化子的致病性,发现一个致病缺陷突变体：A1 412。该突变体不能侵入水稻叶片及擦伤的大麦或水稻叶片,说明A1 412突变体在寄主组织中扩展进程被阻断。进一步的表型分析发现A1 412突变体的产孢量显著下降,仅为野生菌株的7%,在疏水表面不能形成附着胞,部分分生孢子萌发也略有延迟。Southern 杂交显示A1 412基因组中T DNA插入是单拷贝的。上述结果表明,A1 412突变体表型的改变可能是由于T DNA插入而使某一具有重要生物学功能的基因失活所致。     

稻瘟病菌分生孢子发芽和附着胞形成的影响因素研究

在8种培养基膜,多种cAMP、IBMX浓度梯度的琼脂表面膜,不同营养液及pH值条件下,研究了稻瘟病分子孢子发芽和附着胞形成的状况,并对稻瘟病拮抗细菌培养液的作用进行了研究。稻瘟病菌(Magnaporthe grisea) 91-11B1的分生孢子悬浮液浓度在10000~1000个/mL 和pH值在7.0为最适孢子萌发条件,但不影响附着胞的形成。疏水基物表面、营养饥饿或洋葱表皮细胞表面可以刺激附着胞形成。2.5 mmol/L cAMP和8.0 mmol/L磷酸二酯酶抑制剂IBMX显著地促进附着胞的形成。与去离子水和水洗法相比,自来水和振落法获得的分生孢子更有利于附着胞的形成。筛选到3株对孢子发芽及附着胞形成有强烈抑制作用的拮抗细菌     

稻瘟病菌突变体 Y34- 0453 的表型分析和 T- DNA 插入位点的定位

对稻瘟病菌 T- DNA 插入突变体 Y34- 0453 的表型分析,发现其菌落黄化,气生菌丝减少,产孢量增加,不能侵染正常的感病水稻品种,但可以侵染具有微伤口的水稻叶片,分生孢子接种洋葱皮没有形成侵染钉。初步认为是该突变体附着胞不能正常分化,从而不能正常产生侵染钉致使致病力丧失。通过 DW- ACP-PCR,获得了 T- DNA 插入的侧翼序列。测序并进行比对的结果表明,T- DNA 插入在Ⅱ号染色体的 5.184 超级重叠群（Supercontig5.184）中的未知蛋白编码基因（MGG 02065.5）下游 1 773 bp 处,T- DNA 插入位点处可能有个远程调控元件。     

枯草芽孢杆菌JN005胞外抗菌物质及对水稻叶瘟防治效果

【目的】检测枯草芽孢杆菌JN005产生的胞外抗菌物质的稳定性和对稻瘟病菌的生物活性,及其对水稻叶瘟的防治效果。【方法】通过不同培养基检测枯草芽孢杆菌JN005产生的抑菌物质,结合平板对峙法、光学显微镜观察、室内离体和活体接种来检测JN005菌株胞外抗菌物质对稻瘟病菌拮抗活性和对水稻叶瘟防治效果。【结果】枯草芽孢杆菌JN005能分泌蛋白酶、纤维素酶、淀粉酶和β-1, 3-葡聚糖酶,其胞外抗菌物质对稻瘟病菌生长具有抑制作用。胞外抗稻瘟病菌物质在0℃~100℃和pH 2~12范围内活性较为稳定,且经蛋白酶K处理后不影响其活性,紫外照射12 h以及4℃保存3个月仍有活性。胞外抗菌物质能引起稻瘟病菌菌丝形态畸变,并抑制分生孢子的萌发。室内湘晚籼12号稻瘟病离体叶片接种表明,先用100倍胞外抗菌物质稀释液处理水稻叶片,24 h后接种稻瘟病菌分生孢子悬浮液(1×10⁵个/mL),其叶瘟发病率为34.07%,效果接近稀释500倍的40%稻瘟灵EC;而先接种稻瘟病菌分生孢子悬浮液,24 h后用100倍胞外抗菌物质稀释液处理,其发病率为38.52%,与稀释1500倍的75%三环唑(WP)和稀释500倍的40%稻瘟灵(EC)有显著性差异。活体喷雾接种试验表明,于湘晚籼12号秧苗长至3叶1心时,接种稻瘟病菌分生孢子悬浮液前24 h喷施稀释100倍的胞外抗菌物质稀释液,其叶瘟防效为75.32%;接种稻瘟病菌分生孢子悬浮液后24 h喷施稀释100倍的胞外抗菌物质稀释液,其防效为71.49%。【结论】JN005菌株胞外抗菌物质对稻瘟病菌的菌丝生长和孢子萌发有直接抑制作用,且对环境稳定性较好,对稻瘟病有较好的预防和治疗作用,有进一步的开发潜力。     

水稻穗顶部小穗退化突变体paa1-2的表型与等位基因序列分析

水稻穗顶部小穗退化在水稻生产中普遍存在,严重影响了水稻产量。本文对水稻穗顶部小穗退化突变体paa1-2进行表型观察,同时测序分析突变体paa1-2中已报道的TUTOU1和PAA1基因序列。结果表明,突变体paa1-2穗顶部退化表型是在幼穗发育6期后产生的。突变体paa1-2和野生型的TUTOU1基因序列一致,然而其PAA1基因存在突变,在第1512~1515 bp处存在4个碱基缺失,导致基因移码突变并使得蛋白翻译提前终止,PAA1-2可能是已报道PAA1基因的新等位突变基因。     

OsLOX10正调控水稻对稻瘟病和白叶枯病的抗性

【目的】由稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae）引起的稻瘟病和由水稻黄单胞菌（Xanthomonas oryzae pv. oryzae，Xoo）引起的白叶枯病严重影响水稻的产量和品质。创制转OsLOX10基因水稻材料，进行稻瘟菌和白叶枯菌的抗病性分析，有助于揭示其调控水稻对稻瘟病和白叶枯病的抗性机制。【方法】采用CRISPR/Cas9系统构建OsLOX10的敲除载体，利用限制性内切酶XcmⅠ线性化pCXUN-HA，TA连接构建OsLOX10的过表达载体，遗传转化获得OsLOX10转基因水稻，筛选过表达株系和纯合敲除株系进行真菌和细菌的抗病性分析。在稻瘟菌（Guy11）侵染水稻后，对水杨酸（salicylic acid，SA）、茉莉酸（jasmonic acid，JA）途径的标志基因进行qRT-PCR分析;在几丁质（chitin）和flg22诱导下，观测水稻活性氧（reactive oxygen species，ROS）的暴发情况。【结果】 qRT-PCR分析表明，接种稻瘟菌和白叶枯菌24 h后，OsLOX10表达量上调;OsLOX10的纯合敲除和过表达水稻转基因株系接种稻瘟病菌Guy11孢子悬浮液，与野生型（日本晴）相比，OsLOX10敲除株系更易感病，过表达株系则无典型的病斑症状;接种 6、12、24和36 h时，3个病程相关蛋白基因OsPBZ1、OsPR1a、OsPR1b和SA通路基因OsPAL1，以及JA合成通路上的2个基因OsAOS2、OsLOX5的转录水平在敲除转基因株系中显著下调，而在过表达转基因株系中显著上调。对转OsLOX10基因水稻接种白叶枯菌（PXO99A），发现敲除OsLOX10的转基因水稻对白叶枯菌更易感病。qRT-PCR分析OsPR1b和OsPAL1以及JA合成通路上的3个基因OsAOS2、OsAOC和OsJAZ在OsLOX10过表达基因水稻中表达量明显上调，而在敲除OsLOX10的转基因水稻中却保持在较低水平，在接种7 d后表现出显著性差异。在几丁质和flg22诱导下，OsLOX10敲除株系的ROS水平显著性降低，而且在几丁质诱导下，ROS的起峰时间推迟。【结论】稻瘟病菌和白叶枯病菌能够诱导OsLOX10的表达，OsLOX10通过病原菌分子模式触发的免疫途径（PTI）参与抗病反应，其在水稻抵御稻瘟病和白叶枯病中起着正调控作用。同时，OsLOX10可能通过调节SA和JA介导的信号通路来正调控水稻对稻瘟病和白叶枯病的抗性。     

香蕉枯萎病菌4号生理小种smy1基因的功能分析

Smy1是一种参与调控真菌生长的驱动蛋白。本研究克隆了香蕉枯萎病菌4号生理小种（Foc 4）驱动蛋白基因smy1,并采用同源重组技术获得smy1敲除的野生型Foc 4的smy1敲除突变体。通过测定突变体菌丝形态、生长速度、产生孢子量、对香蕉苗的致病力及对氰烯菌酯的敏感性,用于研究smy1在香蕉枯萎病菌的生长发育及对氰烯菌酯抗药性中的作用。结果表明,与野生型Foc 4相比,smy1敲除突变体生长缓慢、菌丝畸形、产孢量增加,对巴西蕉苗的致病力减弱,但对氰烯菌酯的抗性水平变化不大。由此推断smy1基因可能在Foc 4的生长发育、产孢以及致病力等方面具有重要作用。     

色氨酰-tRNA合成酶基因WRS1调控水稻种子发育

【目的】氨酰-tRNA合成酶（aminoacyl-tRNA synthetases, aaRSs）与遗传信息传递密切相关,已发现植物中aaRSs家族蛋白在维持翻译功能之余,还参与配子发生与胚发育、质体的早期发育以及免疫信号的感知与病害防御等生物学过程。本研究利用水稻胚乳发育缺陷突变体,分析水稻色氨酰-tRNA合成酶（WRS1）在胚乳发育中的作用,证明WRS1基因编码一个影响水稻胚乳发育的关键因子。【方法】本研究通过甲烷磺酸乙酯（ethyl methane sulfonate, EMS）诱变籼稻（Oryza sativa subsp. indica）品种N22,筛选到一个稳定遗传的水稻粉质胚乳突变体（wrs1）,图位克隆获得目标基因。对wrs1成熟种子进行形态学观察以及淀粉相关理化性质测定,利用细胞学切片分析wrs1发育中胚乳的结构,利用实时荧光定量PCR（quantitative real-time PCR, qRT-PCR）和GUS活性染色分析基因表达模式,通过qRT-PCR比较野生型与突变体花后12 d胚乳中淀粉合成相关基因表达情况,免疫印迹检测野生型与突变体成熟种子中淀粉合成酶蛋白积累情况,使用全自动氨基酸分析仪测定游离氨基酸含量。【结果】 wrs1突变体幼苗表现出明显的发育滞后且逐渐蔫萎死亡,从杂合突变体（WRS1wrs1）中分离到的粉质籽粒呈现明显的腹部皱缩,粒厚、千粒重下降,同时总淀粉含量下降,糊化淀粉的峰值黏度和崩解值均低于野生型。wrs1突变体发育胚乳中复合淀粉颗粒变小,排列疏松。WRS1定位于第12染色体长臂约183 kb的区间内,测序发现编码色氨酰-tRNA合成酶（tryptophanyl-tRNA synthetase, WRS）基因的第6外显子上发生单碱基替换,导致一个保守位置上的甲硫氨酸被替换。wrs1突变体中大部分淀粉合成相关基因表达量下调,且野生型与突变体间基因表达的变化与相应蛋白积累的差异存在不一致的趋势。wrs1突变体籽粒中蛋白质积累降低,而游离氨基酸含量显著升高。【结论】 WRS1编码色氨酰-tRNA合成酶,该基因突变后通过影响氨基酸稳态和蛋白质合成,造成淀粉合成相关基因异常表达从而影响淀粉的合成与积累,导致种子发育缺陷。     

持有Pi9基因的水稻单基因系IRBL9-W对稻瘟病菌苗期和成株期抗性差异

【目的】Pi9是一个广谱稻瘟病抗性基因,田间病圃监测发现持有Pi9的水稻单基因系IRBL9-W在苗期高抗稻瘟病,但却感穗瘟。探明水稻单基因系IRBL9-W在苗期抗病而孕穗末期感染穗颈瘟的原因,为Pi9基因在水稻抗病育种中的有效利用提供参考。【方法】利用从IRBL9-W穗颈瘟病斑上分离的8个单孢菌株以及实验室保存的单孢菌株Y363,在温室分别对单基因系IRBL9-W苗期和孕穗末期进行接种鉴定;并利用病原菌AvrPi9基因的特异引物对9个单孢菌株进行PCR扩增及产物测序;提取水稻单基因系IRBL9-W苗期叶片和抽穗期穗部的总RNA,通过半定量RT-PCR以及实时qRT-PCR分析Pi9基因在苗期和穗期的表达。【结果】在温室人工喷雾接种条件下,IRBL9-W在苗期对从穗颈瘟上分离的8个单孢及对照菌株Y363均表现为抗病;随机选取的2个从IRBL9-W穗颈瘟病样分离的单孢菌株(YX2-7-1和YX2-15-1)及对照菌株Y363对孕穗末期IRBL9-W注射接种,接种的植株表现出典型的穗颈瘟症状;AvrPi9的等位基因分析结果表明,与AvrPi9相比,Y363中的等位基因与AvrPi9完全相同,而从IRBL9-W穗瘟分离的8个单孢菌株中编码区与AvrPi9基因完全相同,但在编码起始位置上游-264 bp处缺失16 bp的一段序列。由于IRBL9-W苗期对这些菌株均表现抗病,推测这段序列的缺失并不影响AvrPi9基因的功能;实时qRT-PCR分析结果表明,Pi9基因在穗部的表达量为苗期叶片表达量的47.3%。【结论】在水稻单基因系IRBL9-W中,与苗期叶片中Pi9基因的表达量相比,Pi9基因在穗部表达量的明显降低可能是造成IRBL9-W穗期感稻瘟病的原因。     

稻瘟病菌中小G蛋白Rho3的假定互作蛋白MoKin1的功能分析

小G蛋白MoRho3在稻瘟病菌生命活动中具有重要的生物学功能。前期研究表明,MoRho3的缺失对于稻瘟病菌分生孢子的形态建设、附着胞萌发和侵入能力以及对宿主的致病性等表型都存在严重缺陷。为了进一步解析MoRho3在稻瘟病菌中的网络调控途径,通过生物信息学的方法预测了MoRho3的互作蛋白。在众多假定互作蛋白中,蛋白激酶MoKin1与酿酒酵母中KIN1和KIN2是同源蛋白。在酵母细胞中,KIN1和KIN2可以抑制△rho3的表型缺陷。为了验证在稻瘟病菌中MoKin1与MoRho3之间是否存在着相似的调控途径,本研究通过分析MoKin1与同源蛋白的进化关系,序列结构,定位状态以及相关的互作蛋白,揭示了MoKin1的功能特点,为后续病原菌中MoKin1与MoRho3互作机制的研究,以及病原菌致病机制的解析提供了新的思路和方向。     

利用CRISPR/Cas9技术创制抗稻瘟病香型早籼温敏核不育系

【目的】创制新型抗稻瘟病香型早籼温敏核不育系，为高产优质杂交水稻选育提供资源。【方法】利用CRISPP/Cas9技术在水稻稻瘟病基因Pi21、温敏不育基因TMS5和香味基因Badh2的第1外显子处设计靶位点，构建多基因表达载体pC1300-2×35S::g^TMS5-g^Badh2-g^Pi21，转化优质常规籼稻品种中早70，测序鉴定分析获得纯合阳性稳定株系。利用稻瘟病喷雾接种和打孔接种方法对稻瘟病基因Pi21的纯合突变株系进行稻瘟病抗性鉴定，利用GC-MS技术对Badh2纯合突变株系的香味物质2-乙酰-1-吡咯啉（2-AP）含量进行测定。【结果】在T₀转基因株系中，Pi21、TMS5和Badh2突变频率分别为87.5%、80.0%和87.5%，突变类型多为双等位突变。从T₁代中筛选不含载体骨架的纯合突变株系，获得两种三突变纯合株系。稻瘟病接种结果表明，与野生型相比，T₂代Pi21纯合变异株系的抗性显著提高。同时，接种后纯合突变体株系内相关防卫基因的表达量显著上调，ROS积累量也显著增加。tms5纯合变异株系表现出典型的温敏不育特性，TMS5基因的表达水平与野生型相比显著降低，高温下Ub_L404基因的表达水平明显高于野生型。与野生型相比，在Badh2纯合突变体植株中Badh2的表达水平显著下调，并且香味物质2-AP含量极显著增加。【结论】利用CRISPR/Cas9技术成功对Pi21、TMS5和Badh2基因同时进行定向编辑，获得了具有高抗稻瘟病的香型温敏不育系，为高抗、香型不育系材料的选育提供参考，加快高产优质杂交水稻的选育。     

稻瘟病菌中蛋白激酶CK2的功能预测分析

通过生物信息学分析,初步掌握了稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)中蛋白激酶CK2三亚基的结构特点,生物进化树分析表明CK2的蛋白序列在进化上的高度保守性;利用酵母同源比对的方法预测分析了稻瘟病菌中潜在的互作底物,揭示了CK2可能参与的生理生化过程,并且重点预测分析了CK2与小G蛋白Rho3之间的互作关系,为进一步揭示稻瘟病菌蛋白激酶CK2的功能及其参与调控的信号通路提供了理论基础.     

胶孢炭疽菌侵染橡胶树叶片染色方法的建立及显微观察

本研究建立了一种橡胶树叶片中胶孢炭疽菌的染色方法,通过显微观察明确胶孢炭疽菌在橡胶树叶片中的侵染结构,为橡胶树炭疽病的预测预报提供理论依据。在脱色剂（0.15%三氯乙酸乙醇溶液∶氯仿=5∶1）处理12 h,1%刚果红染色剂抽滤染色3 h的条件下,能清晰观察到胶孢炭疽菌在橡胶树叶片上的发育进程和侵染结构。结果表明,在28 ℃、100%相对湿度培养条件下,接种橡胶树淡绿期叶片2~6 h为分生孢子萌发高峰期,12 h后分生孢子萌发率大于85%;8~12 h为附着胞形成高峰期,接种12 h约75%的芽管顶端产生附着胞,少数附着胞中央部位开始形成侵染钉;24 h为侵染钉形成高峰期,同时分生孢子萌发形成多个芽管;36 h时附着胞顶端再次萌发产生次级附着胞,从而进一步侵染周围细胞,叶片出现零星病斑;48 h时芽管不断分支异化成菌丝并产生次级分生孢子,叶片出现大量典型的炭疽病病斑;72 h后菌丝在叶片表面纵横扩展,随机分支,逐步形成网状分布。随着菌丝的扩展,叶片组织发生一系列的病理变化,侵染部位组织出现褐色坏死病斑。本研究建立了一种着色效果好,简便易行,经济有效的橡胶树叶片中胶孢炭疽菌的染色方法,进一步明确了胶孢炭疽菌的侵染结构。     

转Pi9抗稻瘟病基因水稻株系的比较转录组分析

【目的】在转录水平上解析Pi9基因介导的稻瘟病抗性调控机理,为培育抗病水稻品种提供理论依据。【方法】向水稻品种日本晴(NPB)及其转Pi9抗稻瘟病基因株系(NPB/Pi9)接种稻瘟菌。分别于接种后0 h、12 h、24 h、36 h提取叶组织样品,选取12503个水稻基因定制基因芯片,进行水稻基因转录组分析,并通过qRT-PCR对部分差异表达基因进行验证。【结果】NPB/Pi9在接种后12 h、24 h和36 h的基因表达量分别与其接种0 h表达量比较,共检测到7754个差异表达基因;相应地,感病水稻NPB在以上时间点共检测到7385个差异表达基因;在接种后36 h,NPB/Pi9的差异表达基因数目显著多于NPB。比较NPB/Pi9和NPB相同时间点的基因表达量,共获得4065个差异表达基因,其中接种后36 h的差异表达基因显著多于接种后0 h、12 h或24 h。因此,NPB/Pi9的稻瘟病防御反应更强烈。对NPB/Pi9与NPB相同时间点的差异表达基因进行GO和KEGG分析,细胞外区域、植物对刺激应答、转录调控、氧化还原、离子结合、次生代谢和植物激素相关的GO分类在接种后呈显著富集,苯丙氨酸代谢、类黄酮生物合成和植物激素信号途径的KEGG通路在接种后显著富集。与效应分子触发的免疫反应(ETI)相关的水杨酸信号途径、几丁质酶,以及与病原相关分子模式触发的免疫反应(PTI)相关的胞外区域、对刺激的应答、木质素合成等,均在抗感水稻之间差异表达。而且PTI/ETI共有的WRKY转录因子、MAPK激酶、茉莉酸和乙烯信号途径等发生差异表达。综上所述,NPB/Pi9和NPB的差异表达模式与ETI和PTI相关,两者相互联系并在Pi9介导的稻瘟病抗性中发挥作用。【结论】与日本晴比较,抗病基因型NPB/Pi9对稻瘟病防御反应更强烈。转录因子、激酶、NBS-LRR基因、几丁质酶、水杨酸、茉莉酸和乙烯信号途径,以及植物次生代谢在Pi9介导的稻瘟病抗病反应中发挥重要作用。